UVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. Detekce miRNA Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - napr. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|al 95°C 1min Forward primer (10|aM) 2,0\i\ Reverse primer (10|aM) 2,0|al 95°C 15s PCR grade H20 15,0|al 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ] Disociační křivka - 60-95°C Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% qRT-PCR - detekční limit 1 x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv. „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0|al 50°C 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0jal Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0|al 95°C 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10|aM) 2,0jal Reverse primer (10|aM) 2,0jal 95°C15s i 45X \ Sonda (20|aM) 0,2jal 60°C1min PCR grade H20 8,8jal Vzorek DNA nebo standard 5,0jal Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA - Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/ Detekce Taqman SNP microarray Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • 2 alelově specifické sondy které mají specifické fluorofory a PCR primery, které detekují specifický target • Vysoká specificita • Próby s MGB (minor groove binder, 3') - zlepšují hybridizaci stabilizací vazby MGB s templátem • Proby cca 13bp Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza 1 .Assaycomponents and DNA template For* art primer E u._ i-. íVt ti Reverse prtttr ľ %f ^^ttt iii rTTT^ d^i^stid ■as- ii -v TTTT. .........IT^ is.-n 2. Denalwed template and annealing assay oomponHifa r Fomanj primer 2' r 4« .....I i iUii I I h J J ■ i ■ i ■.......t j.l.l.......1 J J I ■........ .1 DGJT1 fievcie prrr-er 3 Pclynerisaco" andsgna generatiDn -k ».....TXmG^ JIIIIIIŇll.....j.......11,1 r'7UllllIll.ŕft-,.-rrrr ■z ■'ľ-i- ^ -V,_J d..: Quenorier MItck--Groove ~sq ľ-: :: DNA Pntyi-wrasc <_ Prcce -mo™ Eilndtd rjlTier U n dctermi nod * AI lete X * Al lete Y • Both ■ NTC * ■ . 4 í: ľ ■ --■- _ř_ ta M i tí ■ - M y- \ * AlleJc X [SNP Allele 1) Figure 1, Allalic discrimination is achieved by the selective annealing of TaqMan* MGB probes, Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • Detekce pomocí dvou majáků - 1 se váže na wt alelu, druhý na mutantní alelu • Různé fluorofory Molecular Probe Target Sequence Emission of Fluorescence Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridizován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Aplikace SNP genotypizace SNP array Array pomocí použití tisíce prob Amplification Digestion Probe labeling B. SNP array Patient DNA SNP array / Allele A Allele B I Hybridization Normal Deletion Duplication Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 ■u ň 75 E 7 bo* c * Š 25 o Double-stranded DNA m DNA) Single^tranded DNA (random coils) 76 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] ■ oo 80 § 60 c 20 25 20 15 c 7 (t /ild typ 2allel« Mutc jnts ~ i „ \ (I all 3le) Hl 3teroz^ /gote; \^ 5 R J RJ R Fi Rfi (B) ^=§: lA/NH +\ \ IfVIIU l< 'Callí íle) ľ c s/lutar ľallel ts / \ J/ V ^# 1 Hete rozyg otes 81 5 82 82.5 83 33.! 84 84.Í 85 85 80 30.! Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21 mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) a \ Pre-miRWA miRNA ganes Nucleus Cyiopfasm jdnnrmiRWAdupieií \ i JSnnr^^JÍimír Ore strand: jncorpcr'.ittd Inla R\± C RIzC. Tafciei TTÍTTTl cleavage Třanslaliůri inhibiliori -V I Tumor suppressor gene ;Turnor suppressor gene expression tOncogene expression Aplikace [FU] 25CH 200 H 15GH 100 50-\ miRNA Region 75 ng/ul Thymus Tola I RNA Smalt rRNAs 40 60 Fig. IA. Image of a typical electropherogram for small RNA analysis performed with the Small RNA Assay on the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) (hrtp:// www.chem.agLlent.com/LLbracy/technLcalovecvLews/PublLc/59S9-7002EN.pdf). Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce Specifický primer pro RT 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA (snRNA) TÍTT ............ lllll............... _1 IUM U Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory C + bisulfit = U mC intaktní hii, Sulphonation HS03- íHNíř^ ^ H H Cytosine OH SO,- H H Cytosine sulphonate Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal u N H HS03 OH. I STEP 2] Hydrolytic Deamination STEP 3| Alkali H Uracil Desulphonation Uracil sulphonate The two main components of the epigenetic code DNA methylation Methyl marks added W Certain on A ba ses repress gene activity. Hi stone modification A combination of different molecules can attach to the tails' of proteins called histones, These alter the activity of the DMA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem nebo 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR $ <& 9 ni <& 9 ._m_ Aplikace ImunoPCR - Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce - Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou - Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay - Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR Aplikace ImunoPCR - stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Human Pathülogy (2008} 39, 1474-1482 ELSEVIER Original contribution Human PATHOLOGY w w w. el sev i er. eom/1 Dcate/humpath Prostate-specific antigen mRNA and protein levels in laser microdissected cells of human prostate measured by real-time reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction and immuno-quantitative polymerase chain reaction i. .i Pamela Pinzarri PhD , Kristina Lind PhD ' , Francesca Malentacchi Gabriella Nesi MDC, Francesca Salvianti PhDa, Donata ViLlarí MDf, Mikael Kubista PhDd'e, Mario Pazzagli PhDa, Claudio Orlando PhDa 10 000 000' £■ I 100 000 10 goo' 1000- -una I I □ mm1, ~i-1-1-1—i—i-r~ NI N2 m N4 N5 N6 N7 sioomh r R- <■-'<<' -.id:m i Ktxm fxtuK www '»aw sworn turn PS* PfOTŕio ÍP-ůXult^CrlI] Aplikace Single cell profiling tion > B Total number of ^ transcripts = S Total number of ^ transcripts = 6 Total number of \ transcripts = 7 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis glass capillaries flow cytometry laser capture purification detergents heat osmotic mechanic * reverse transcriptase * priming ' temperature profile 1 pre-amplification m astermix ■ priming temperature profile ■ detection chemistry pre-amplification ■ normalization ■ quality assessment ■ statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Droplet digital PCR • Precizní sensitivní stanovení NK • Kombinuje klasické PCR postupy s fluorescenčním stanovením produktu • Rozdělení PCR reakce na stovky až tisíce subreakcí- někde dojde k replikace, někde ne - přítomnost/nepřítomnost hledané sekvence • Subreakce individuálně analyzovány • Ratio pozitivních a negativních reakcí - počáteční množství molekul templátu • Absolutní kvantifikace bez externích standard ddPCR-využití • Kvantifikace virů a patogenů • Genové exprese - pokud rozdíly menší než dva krát • Copy number variations • Single cell analysis • Rare mutations.... ddPCR . * SuBsr Enzyme PCRPftfier* Sample Fig. 3 Components of a Digital PCR reaction and ParBo'oning. dPCR reactions contain similar components to that typically used in a qPCfl reaction. These components should be thoroughly mixed and then partitioned into uniform subpartibais Ch2-Conc:1230 Pra:Baa7 Nag:«K2 e S 3C0Q ■J 2C0Q ■J d 2000 4000 8000 BOOO 1-0000 1 2000 Event NumBer Hg. 4 (a) Partitioned reactions are placed in a vessel compatible for the PCR amplification to take place, (b) Amplification can take place in a standard thermocyder using typical qPCR protocols. For example 95 "C tor 10 min followed by 40 cycles of 95 °Cfor 30 s and GO °C far 1 min. Ho optical analysis is required at the amplification phase, (c) Individual subreacfons are collected and subseguentiy interrogated for trie presence of a positive fluorescent signal, (if) Individual reactions are deemed either a positive or negative event, counted, and the concentration is calculated ddPCR 2DO0 ftOOO 5000 1O0O0 Fwsnt Nimhftr 12Q00 UOCO Fig. 5 Temporal plot of a dPCR reaction.X axis represents individual subreacbons in the order they were analyzed. Taxis represents fluorescent signal generated in each corresponding subreaction. Sfuedotsare deemed as positive events; grey dots are deemed negative. Purple fine is the threshold for determining what is positive from negative (can be set automatically by software algorithms or manually as in the case above)