3. K A P A L I N O V Á CH R O M A T O G R A F I E (RP-HPLC) 3.3. Provedení chromatografického stanovení Vysokoúčinná kapalinová chromatografie RP-HPLC je druhem kapalinové chromatografie s reverzní fází, což znamená, že mobilní fází (MF) je většinou organické rozpouštědlo a stacionární fází (SF) je pevná látka. Mobilní fáze je pak tlačena skrz nepohyblivou a nemísitelnou stacionární fázi. Principem HPLC je různá afinita vzorku ke stacionární fázi. Čím vyšší má vzorek afinitu ke stacionární fázi, tím větší je jeho zádrž a pozdější eluce, dochází tedy k separaci látek. Vzorek je kolonou nuceně transportován postupným přitékáním mobilní fáze. Tento proces se nazývá eluce. Výsledkem měření pomocí metody HPLC je chromatogram, z něhož zjišťujeme retenční čas jednotlivých analytů, popřípadě koncentraci, atd Nejdůležitější kvalitativní charakteristikou látek rozdělujících se mezi stacionární a mobilní fází je kapacitní faktor, pro jehož výpočet je nezbytné znát mrtvý čas dané kolony. Mrtvý čas t[0] je čas, za který projde kolonou nezadržovaná látka, tzn. látka, která prakticky neinteraguje se stacionární fází (SF). Je-li tedy SF velmi polární (nemodifikovaný silikagel), můžeme mrtvý čas ztotožnit s retenčním časem velmi nepolární kapaliny, tj. markeru (např.hexanu), je-li SF velmi nepolární (C18), pak markerem může být velmi polární molekula, např. aceton. Při znalosti průtokové objemové rychlosti (F, ml·min^-1), lze vypočítat V[M] mrtvý objem kolony z času t[M]. 3.3.1. Příprava chromatografu k měření a sběr dat - zapnout zařízení, a to v pořadí detektor, pumpa, počítač (nutné nažhavení detektoru po dobu 30 minut). MF je třeba odplynit na ultrazvukové lázni po dobu minimálně 20 minut - jakmile je detektor nažhavený, je možné přistoupit k ekvilibraci kolony - zkontrolovat, zda je nasávací hadička s filtrem ponořena pod hladinou MF - inj. stříkačku se šroubovacím zakončením o objemu 30 ml nasadit na výpustní ventil pumpy. Ventil opatrně otevřít a pomalu natáhnout mobilní fázi ze zásobní láhve, to zajistí odstranění bublin z koloběhu mobilní fáze. Před sejmutím stříkačky z výpustního ventilu vždy ventil opět uzavřít. Natáhnutí mobilní fáze opakovat alespoň 2x, dokud nedojde k odstranění veškerých drobných bublinek z nasávací hadičky. Poté ještě hadičku zkontrolovat pohledem, případné bublinky sklepnout a znovu inj. stříkačkou natáhnout mobilní fázi. POZOR: Při vniknutí bublin do kolony může dojít k jejímu poškození. - na pumpě nastavit požadovaný průtok pro stanovení (0,5 ml·min^-1, příp. 0,6 ml·min^-1 ), teprve nyní je možné spustit pumpu tlačítkem "RUN". - až je tlak na pumpě konstantní, spustit program EZStart - v úvodní nabídce vybrat metodu test254.met (lze ji najít na cestě c:\Ezstart\Methods\test254.met). Tato metoda slouží k ekvilibraci kolony a také k následnému provedení jednotlivých měření - spustit Preview na horní liště programu, které slouží k ekvilibraci kolony - základní linie (base line) se ustálí po cca 40 min, což odpovídá 20 kolonovým objemům, po této době ukončit ekvilibraci červeným tlačítkem "RUN STOP". 3.3.2. Příprava roztoků standardů a neznámého vzorku Mobilní fáze: CH[3]OH:voda 70:30 (v/v). Příprava testovací směsi - do odměrné baňky na 25 ml připravit testovací směs napipetováním 2 ml acetonu, 0,5 ml benzenu a 0,5 ml toluenu, doplnit methanolem po rysku. Připravenou směs umístit na 20 min do ultrazvukové lázně. Příprava 0,01% roztoku thiomočoviny - do odměrné baňky na 50 ml připravit navážením 0,01% roztok thiomočoviny rozpuštěním v destilované vodě. Připravenou směs umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. Příprava standardu kyseliny askorbové (M[AA]=176,13 g/mol) - do odměrné baňky na 25 ml připravit navážením kyseliny askorbové roztok o koncentraci 1 g/l, doplnit po rysku destilovanou vodou. Připravenou směs umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. Příprava vzorků kyseliny askorbové - tabletu kyseliny askorbové zvážit, rozpustit v cca 50 ml destilované vody v kádince, přefiltrovat do 100ml odměrné baňky a doplnit po rysku destilovanou vodou. Připravenou směs umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. Z tohoto roztoku připravit následující roztoky: a) do 25 ml odměrné baňky odpipetovat 2,5 ml roztoku rozpuštěné tablety a doplnit po rysku destilovanou vodou b) do 25 ml odměrné baňky odpipetovat 2,5 ml roztoku rozpuštěné tablety, napipetovat 2,5 ml roztoku standardu kyseliny askorbové, doplnit po rysku destilovanou vodou 3.3.3. Optimalizace podmínek stanovení, ověření funkčnosti a stavu chromatografické kolony Dávkování vzorku dávkovacím kohoutem - před zahájením vlastního měření je doporučeno několikrát propláchnout dávkovací kohout destilovanou vodou, methanolem nebo mobilní fází pomocí injekční stříkační s nasazovací jehlou. POZOR: Zasunutá jehla nesmí propíchnout septum dávkovacího kohoutu, zasunujte ji tedy velmi opatrně a poté, co ucítíte odpor, je třeba se s jehlou vrátite o několik mm zpět - vzorek dávkovaný na kolonu musí být čirý, částice nebo zákal mohou nevratně znehodnotit kolonu - vzorky obsahující rozpuštěné plyny (např. metanolické roztoky) je třeba před nástřikem důkladně odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Naplnění smyčky dávkovače a nástřik vzorku na kolonu - po ekvilibraci kolony je možné nastříknout testovací roztok. Testovací roztok se měří při 254 nm. Aceton má funkci inertního analytu, tudíž se vůbec nezachytává na stacionární fázi, proto se čas jeho eluce bere jako mrtvý retenční čas. Toto slouží k výpočtu kapacitních faktorů. Dávkovací zařízení je opatřeno kohoutem s polohou 1 (load) a 2 (inject). V poloze 1 (levá poloha) se plní smyčka, aniž by docházelo k unášení analytu mobilní fází, v poloze 2 (pravá poloha) je analyt unášen mobilní fází. Než dojde k nástřiku, musí být dávkovací zařízení vždy v poloze 1. - při plnění dávkovací smyčky o objemu 20 μl se kohout dávkovače přepne do pohotovostní horní polohy 1 (levé polohy), do dávkovacího otvoru se jemně (ne násilím)zasune jehla injekční stříkačky a tlakem na píst injekční stříkačky se naplní dávkovací smyčka dávkovače (na konci odpadní kapiláry odkápne 3–5 kapek). - kohout dávkovače se přepne do pravé spodní polohy a jehla se vytáhne. Tím se uvnitř dávkovače přepne směr toku mobilní fáze tak, že prochází smyčkou. Měření vzorku - zkontrolovat zda je kohout dávkovače v pohotovostní horní poloze 1 (levá poloha) - inj. stříkačku (např. Hamilton) s obsahem 25 µl několikrát propláchnout destilovanou vodou, poté měřeným roztokem. Do inj. stříkačky nabrat 2,5 µl z testovacího roztoku tak, aby ve stříkačce nebyla žádná bublinka - inj.stříkačkuzasunout rovně skrz septum do dávkovacího zařízení - před nadávkovám vzorku je potřeba spustit program pro sběr naměřených dat → pro spuštění programu stlačit modrou šipku na horní liště → objeví se okno, ve kterém jetřeba vyplnit název vzorku (sample ID), cestu pro uložení naměřených hodnot (data path) a název souboru, pod kterým se jednotlivé měření uloží (data file). V řádku Method zkontrolovat, zda je správně zvolena metoda - pro další informace slouží tlačítko Description, kde je možné vypsat bližší informace o vzorku, např. kolik µl vzorku dávkujeme, typ kolony, typ mobilní fáze, průtok - měření spustit tlačítkem Start. Než dojde k nástřiku jakéhokoliv vzorku, je třeba počkat, až se na obrazovce objeví waiting for trigger což znamená, že je software připraven a čeká na nástřik vzorku - po objevení nápisu waiting for trigger na liště, pohybem pístu stříkačky nadávkovat 2,5 µl testovací směsi. Ihned po nadávkování otočit kohout dávkovače do polohy 2, teprve poté vytáhnout inj. stříkačku z dávkovacího zařízení - před ukončením anylýzy nejprve vrátit kohout dávkovače do polohy 1 a teprve poté analýzu ukončite červeným tlačítkem „RUN STOP“. - testovací směs proměřit 1x při průtoku 0,5 ml·min^-1, příp. 0,6 ml·min^-1 3.3.4. Stanovení mrtvého objemu kolony V[M] pomocí inertní látky (thiomočovina) - nastříknutím látky, která není zadržovaná sorbetem, se stanoví tzv. mrtvý čas t[M], tj doba, za kterou kolonou projde látka zcela inertní vůči sorbetu. Při znalosti průtokové objemové rychlosti (F, ml/min), lze vypočítat mrtvý objem kolony V[M] (odečtem času t[M] a s použitím údaje F vypočítat mrtvý objem kolony V[M]) - měření thiomočoviny provést stejným způsobem jako měření testovací směsi, dávkování 5 µl (příp. 2,5 µl) stanovované látky - thiomočovinu proměřit vždy 1x při průtocích 0,4; 0,5; 0,6; 0,7;0,8, 0,9 a 1,0 ml·min^-1 - sestrojit van Deemterovu křivku závislosti výškového ekvivalentu teoretického patra H na průměrné lineární rychlosti MF, kde minimum křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti, při které kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně rozšiřuje zóny analytů (délka kolony C18 je 250 mm, délka kolony C8 je 100 mm) - vybrat optimální průtokovou rychlost, při ní 3x proměřit vodný roztok thiomočoviny 3.3.5. Stanovení množství kyseliny askorbové v neznámém vzorku - při optimální průtokové rychlosti 3x proměřit oba vzorky kyseliny askorbové, dávkování 20 µl stanovované látky Koncentraci obsahu kyseliny askorbové v neznámém vzorku při přídavku jednoho standardu ke vzorku určit podle vzorce (matrice a celkový objem je konstantní – tzv. metoda dvou roztoku) 3.3.6. Statistické vyhodnocení Aritmetický průměr: kde: n je počet měření, x[i] jsou naměřené hodnoty Směrodatná odchylka: kde: n je počet měření, x[i] jsou naměřené hodnoty, je aritmetický průměr Relativní směrodatná odchylka v %: kde: s je směrodatná odchylka, je aritmetický průměr Šířka intervalu spolehlivosti kde: s je směrodatná odchylka, t[α,υ ]je konstanta Studentova rozdělení pro určitou hladinu jistoty, v našem případě pro n = 3 je t[0,05;2 ]= 4,303 Odlehlost výsledků – Grubbsův test – při tomto testu se seřadí hodnoty od nejmenší po největší a testují se krajní body (tzn. nejvyšší a nejnižší hodnota). Vypočítají se kritéria podle vztahů: pro nejvyšší hodnotu: pro nejnižší hodnotu: kde: je aritmetický průměr, x[n] (x[1]) je nejvyšší (respektive nejnižší) hodnota, s je směrodatná odchylka Vypočtená kritéria se porovnají s hodnotou: Lordův u-test shodnosti: kde: a jsou aritmetické průměry měření, R[1] a R[2 ] jsou jejich rozpětí, u[α] je tabelovaná hodnota, je-li u ³ u[α], je rozdíl aritmetických průměrů statisticky významný 3.4. Vyhodnocení chromatografické separace 1. Provést identifikaci látek testovací směsi, zdůvodnit pořadí jednotlivých analytů v chromatogramu. 2. Z chromatogramů určit a uvést do tabulky pomocí programu EZStart-offline pro jednotlivé látky retenční časy t[R], plochy A (AU.s), výšky h (AU) a šířky signálů w (min) (w[0,5] je třeba dopočítat). Data jsou uložena v programu EZStart Offline. 3. Vyhodnotit chromatografický záznam a stanovit faktory, které mají vliv na chromatografické stanovení (rozlišení, účinnost kolony, kapacitní poměry separovaných látek, atd.). 4. Vypočítat mrtvý objem kolony V[M]. 5. Sestrojit van Deemterovu křivku stanovení thiomočoviny. Vybrat optimální průtokovou rychlost. Vyhodnotit a zdůvodnit jakým způsobem ovlivňuje zvyšující se průtok zónu analytů. 6. Určit množství kyseliny L-askorbové v neznámém vzorku. Porovnat naměřený obsah vitamínu C ve vzorku s obsahem deklarovaným výrobcem, diskuse výsledků uvést v závěru. 7. Provést statistické vyhodnocení jednotlivých stanovení analyzované látky (kyseliny askorbové) ve vzorku. 8. Zdůvodnit případné problémy během analýzy.