Regulace růstu a vývoje rostlin, fytohormony Úvod • Metabolismus, růst a vývoj jsou koordinovány celou řadou signálních molekul • Signální molekuly působí v blízkosti nebo přenášeny floémem a xylémem • Souhrnně je nazýváme fytohormony • Některé se podobají živočišným – brasinosteroidy • Podílí se na : - Přizpůsobení metabolismu okolním podmínkám - Příjem vody - Teplota - Délka dne - Regulace růstu a vývoje • Fytochromy – červené světlo • Kryptochromy a fototropin – modré světlo • Kryptochrom – řízení ceklu den/noc u rostlin i živočichů G-proteiny • Rodina proteinů vázající GTP nebo GDP • S receptory na PM interagují heterotrimérní G-proteiny - Ga podjednotka (50 kDa) – váže GTP/GDP - Gb podjednotka (35 kDa) - Gg podjednotka (8 kDa) https://www.youtube.com/watch?v=xT0mAQ4726s G-proteiny • Malé G-proteiny mají pouze Ga podjednotku • Všechny malé G-proteiny patří do rodiny Ras proteinů • Lokalizované v cytozolu • Po stimulaci interagují s výměnným faktorem - přeměna z GDP inaktivní na GTP aktivní formu) • V A. thaliana 93 malých G-proteinů • Podílí se na regulaci: - Obranných reakcí - ABA odpovědí - Transportu váčků - Buněčné polaritě - Růstu pylové láčky a kořenových vlásenek Vápník • V buňkách koncentrace volného Ca2+ menší než 0.7 mM • Nízká koncentrace udržována ATPdependentní pumpou • Hromadění Ca2+ v - lumenu endoplasmatického retikula - vakuole - transport ven z buňky • Signál aktivuje velmi krátké otevření kanálů na membránách Fosfoinositolová dráha • Ca2+ kanály řízené dráhou fosfoinositolu • PLC stimulovaná G-proteinem uvolňuje IP3 • IP3 stimuluje růst vápníku • Kyselina fosfatidová ovlivňuje protein kinázy a iontové kanály • Doba života IP3 je pouze 1s • Eliminace IP3 fosforylací/fosfatázou • Důležité role při přenášení signálů - otevírání průduchů pro přísun vody • Fosforylace fosfatidylinositolu speciální kinázou Calmodulin • Vyskytuje se v převážně cytosolu • Vysoce konzervovaný protein (91% homologie mezi dobytkem a pšenicí) • Obsahuje na koncích tzv. EF ruce (zbytky E a F) • Vazba Ca2+ indukuje konformační změnu – interakce s calmodulin-vázajícími kinázami (CBKs) • Ca2+ calmodulin se váže na celou řadu proteinů a ovlivňuje jejich aktivitu • Rostliny mají rodinu protein kináz obsahující motiv EF rukou (Ca2+ -dependentní protein kinázy – CDPK) Protein kinázy Kináza Modulátor Protein kináza A (PKA) cAMP Protein kináza G (PKG) cGMP Ca2+ -dependentní protein kináza (CDPK) Ca2+ Calmodulin- vázající kinázy (CBK) Ca2+ -calmodulin Receptorové protein kinázy (RLK) Vnější podněty Cyclin dependentní kinázy (CDK) Cyklin Mitogen-aktivované protein kinázy (MAPK) Mitogen MAPK-aktivované protein kinázy (MAPKK) MAPK MAPKK-aktivované protein kinázy (MAPKKK) MAPKK • Fosforylace na 12ti konzervovaných oblastech obsahujících –OH skupiny S, T, Y • Zvláštní skupina protein kináz fosforylující zbytky H a D • Buňka obsahuje rovněž serin-threoninové fosfatasy a tyrosin fosfatasy https://www.youtube.com/watch?v=r7GoZ9vFCY8 Protein kinázy https://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/signaltrans/olsignalkinases.html Fytohormony • Fytohormony mají různé struktury a funkce - Auxiny (odvozené od indolu) stimulují buněčnou elongaci - Gibereliny (deriváty giberelanu) stimulují prodlužování internodií - Cytokininy (zeatin) stimulují buněčné dělení - Kyselina abscisová (ABA) reguluje vodní homeostázu - Brasinosteroidy – klíčová role v buněčném vývoji - Ethylen a kyselina jasmonová – potencují senescenci - Peptidické hormony regulují vývoj - Kyselina salicylová a jasmonová se účastní obranných reakcí Auxin • V roce 1880 C. Darwin a syn pozorovali růst semenáčku za světlem • Předpokládali přenos signálu z růstové špičky do růstové zóny • V roce 1926 Frits Went izoloval z růstových špiček semenáčku ovsa látku, kterou nazval auxin • Později identifikována jako indol-3-octová kyselina (IAA) • Další látky mající aktivitu auxinů – fenyloctová kyselina; 2,4dichlorooctová kyselina (2,4-D) • 2,4-D – účinný herbicid způsobující narušení morfogeneze a zvýšenou produkci ethylenu • Použit jako „agent orange“ ve Vietnamu, destruuje pouze dikoty – monokoty ho degradují Auxin • Během časné embryogeneze formuje polaritu (stonek/kořen) • Ovlivňuje buněčné dělení a diferenciaci • Podněcuje prodlužování buněk – nejvyšší koncentrace v růstových zónách • Primárně je tvořen v růstové špičce (nadzemní část) - Transportován polárním přenosem (vyžaduje energii) - Přenos zajišťují specifické eflux/influx přenašeče (PIN) - Polární transport = asymetrické rozložení přenašečů Auxin • Několik minut po přídavku IAA dochází ke ztenčení buněčné stěny - Auxin aktivuje H+- ATPasu (účast proteinkináz a 14-3-3 proteinů) - Acidifikace oblasti buněčné stěny - Aktivace enzymů degradujících buněčnou stěnu - Zvětšení buňky řízené turgorem • Po hodině dochází k aktivaci exprese proteinů spojených s růstem • IAA vykazuje v různých pletivech různé efekty - V kambiu stimuluje buněčné dělení - Posiluje apikální dominance (inhibice laterálního růstu) - Řídí vývoj embrya - Zabraňuje opadávání listů a plodů (antagonista ethylenu) - Indukuje tvorbu plodů • Za normálních okolností produkují semena auxin pouze po oplodnění Auxin Cytokininy • Prenylované deriváty adeninu • Nejčetnějším cytokininem je zeatin • Zvyšují růst stimulací buněčného dělení a indukují laterální růst • Antagonisté auxinu • Oddalují senescenci – opak ethylenu • Maturované buňky mohou opět aktivovat k dělení a vývoji • Formace kalusu – může regenerovat zpět v rostlinu kinetin zeatin Skoog Cytokininy Cytokininy Cytokininy Cytokininy • Některé bakterie a houby produkují auxiny a cytokininy k indukci tvorby nádorů (Agrobacterium, Ti plasmid) Rostlina Agrobacterium Cytokininy • Cytokininové receptory jsou dimerní histidinové kinázy • Lokalizace na plasmatické membráně • Kinázová doména obsahuje dva histidinové a dva aspartátové zbytky • Vazba cytokininu dochází k autofosforylaci na histidinových zbytcích • Následně je fosfát přenesen na His nebo Asp zbytky přenašečových proteinů (dvou komponentní systém Gibereliny • Infekce rýže houbou Gibberella fujikiroi vede k extrémně vysokým rostlinám bez semen • 1926 – Eiichi Kurozawa izoloval z této houby látku mající tento efekt • Nazval ji gibberellin • Gibereliny jsou směsí látek s podobnou strukturou ent-gibberellanu ent-gibberellan Gibereliny • Nejdůležitější giberelin je GA1 a GA • Podobně jako IAA gibereliny stimulují prodlužování stonků a rovněž regulují kvetení • Rovněž se podílí na vytváření plodů a jejich růstu • Gibereliny ukončují dormanci semen expresí enzymů ztenčujících obal semene (amylázy) • Prakticky se využívají v zemědělství: - Produkce protáhlých hroznů bez semen - Pro stimulaci amyláz u ječmene (pivovarnictví) - Inhibitory jsou používány pro zkrácení růstu stonků - V 50-letech umožnily zelenou revoluci u kukuřice (zakrslé rostliny s vyšším obsahem zrn) 2-chlorotrimethylamonium chlorid (Cycocel, BASF) Ethylen • Je zahrnut v procesu senescence (degradace listového pletiva) • Indukuje obranou reakci rostlin • Stimuluje opadání a dozrávání plodů • Transport plodin za podmínek minimální produkce ethylenu (chlad, CO2 atmosféra) • Ethylenový receptor (ETR) – vysoká afinita (nmol/l), podobný cytokininovému Ethylen Brassinosteroidy • Prvně izolovány z pylu řepky (ze 40 kg pylu 4 mg brassinolidu) • Jsou syntetizovány z campesterolu (membránový lipid) • Regulují vývoj rostlin - Stimulují růst stonků - Diferenciaci xylému - Skládání listů • Jasný důkaz pochází ze studia mutantů s vývojovými defekty - Zakrslý růst - Snížená apikální dominance - Snížená plodnost • Vývojové defekty mohou být zvráceny pouze přidáním brassinolidu • Receptor pro brassinolid – receptor-like kináza napojená na MAPK Kyselina abscisová • Pojmenována podle schopnosti vyvolat opadání listí/plodů • Později se však ukázala role ethylenu v tomto procesu • Podílí se na indukci dormance u semen a poupat • Hlavní funkcí je udržování vodní rovnováhy • S NO indukuje zavírání průduchů • Blokuje předčasní klíčení semen před jejich maturací • Je produktem isoprenoidního metabolismu oxidace violoxanthinu • Syntéza je realizována jak v listech, tak v kořenech • Může být přenášena xylémem z kořenů do listů (zavírání průduchů) Kyselina abscisová • Signální dráha zahrnuje: - G-proteiny - Proteinové kinázy/fosfatázy - PLC a fosfoinositolovou dráhu - Cyklickou ADP-ribózu (cADPR) • cADPR otevírá vápenaté kanály • Vyplavení vápníku: - Otevírání průduchů - Aktivace transkripce skrze MAPK kaskádu Vzájemné interakce Regulace vývoje světlem • Světlo řídí vývoj rostlin od klíčení až po kvetení • Fytochromy - Základní senzory červeného světla - Účastní se klíčení - Fotomorfogeneze - Adaptace fotosyntetického aparátu na plné slunce/stín • Pro plné pokrytí spektra senzory modrého světla - Cryptochrom 1 a 2 (obsahují flavin a pterin) - Fototropin (obsahuje flavin) - Zeitlupe • Rostliny zřejmě mají i senzor pro UV světlo Fytochromy • Solubilní dimerní proteiny • Apoprotein (120-130 kDa) s navázaným tetrapyrolem (chromofor) • Fytochrom ve dvou konformacích - Pr (660 nm) – tetrapyrol navázaný na apoproteinu - Pfr (730 nm) – absorpce světla mění konformaci tetrapyrolu - Pfr – aktivní forma - Absorpce vzdáleně červeného světla – konverze na Pr • 660 nm – 88% ve formě Pfr • 720 nm – 3% ve formě Pfr • U arabidopsis 5 různých fytochromů (A-E) • Fytochrom A – sledování vzdáleně červeného světla • Fytochrom B - sledování červeného světla • Fytochrom A ovlivňuje transkripci 10% genů Fytochromy • Fytochrom je příliš velká na průchod do jádra • Proteiny FHY1/FHL – import do jádra • V jádře interakce s Fytochrom Interakčním Faktorem (PIF) • V jádře součást velkých signálních komplexů (jaderných tělísek) • Jaderná tělíska mizí během noci a objevují se před svítáním Fytochromy • Fytochromy jsou rovněž spojeny s: - protein-kinázami - Vápníkem - G-proteiny (cGMP) Klíčení a vývoj • Mutantní rostliny s omezenou schopností syntézy giberelinů (GA) špatně klíčí • GA je zprostředkovaná ubiquitinylační drahou degradace proteinů zpomalujících růst • Tyto proteiny nazýváme tzv. DELLA proteiny • DELLA proteiny – jaderné proteiny obsahující GRAS doménu (GIBBERELLIC-ACID INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR of GAI (RGA) and SCARECROW (SCR)) • Receptor GA – GID1 proteiny (GA-insensitive dwarf1) Gibereliny – percepce Gibereliny – klíčení • Dvě funkce DELLA proteinů v jádře: - Aktivace transkripce cílových genů - Inhibice aktivity některých fytochrom interagujících proteinů • Geny aktivované DELLA - Geny pro biosyntézu GA - Geny pro rozpoznání GA - Gen podporující syntézu ABA (XERICO) Gibereliny – fotomorfogeneze https://www.youtube.com/watch?v=uJUqP3rHi7M Průduchy • Průduchy umožňují difúzi CO2 do listů a odpar vody z listů • Otevírání průduchů je řízeno: - Oxidem uhličitým - Vlhkostí - Fytohormony (ABA) - Teplota - Ozón - Cirkadiální rytmy • Velikost průduchu – turgor ve dvou svěracích buňkách • Změna tvaru svěracích buněk - extenzivní přenos váčků mezi cytoplasmou/membránou https://www.youtube.com/watch?v=IlmgFYmbAUg Regulace průduchů • U většiny druhů je otevírání řízeno světlem – fototropiny (modré světlo) • Aktivace H+-ATPasy = hyperpolarizace PM = vtok draslíku dovnitř buněk • Narůstající koncentrace K+ kompenzována malátem, Cl- a NO3 - = nasátí vody = zvětšení turgoru • Během rána jsou draselné soli nahrazeny sacharózou – udržení turgoru přes den Regulace průduchů • ABA slouží jako signál pro zavření průduchů • V případě nedostatku vláhy u kořenu je transportována do nadzemních části • ABA zavírá průduchy pomocí depolarizace PM a přeměnou sacharózy/malátu na škrob Regulace průduchů • Dlouhodobě zvýšená koncentrace Ca2+ nestačí k trvalému uzavření • Role oscilací Ca2+ v cytoplazmě: - dlouhodobé působení ABA – pomalé oscilace (10 min) - Vysoká koncentrace CO2 - pomalé oscilace (10 min) - Nízká koncentrace CO2 – rychlé oscilace (5 min) • GCA2 lokus (Arabidopsis) nutný pro oscilace • Mechanismus vnímání CO2 je neznámý