Metabolismus dusíkuMetabolismus dusíku Metabolismus dusíku • dusík je čtvrtým nejhojnějším prvkem na zemi • nejvíce dusíku využívaného organismy je recyklováno ze směsi dusíkatých látek  t ř ý h ji ý i ivytvořených  jinými organismy • hlavní zdroj dusíku pro směs využitelných dusíkatých látek je získáván procesem fixace  dusíku • proces fixace dusíku je prováděn pouze prokaryoty • nejdůležitější krok asimilace anorganického dusíku na organické metabolity je• nejdůležitější krok asimilace anorganického dusíku na organické metabolity je  katalyzován enzymem glutamin syntetasou Cyklus dusíku V b é důl ži é i ké d ík é lá k A i ké l č i d ík Metabolismus dusíku Vybrané důležité organické dusíkaté látky  Sloučenina Ox. stav Název Anorganické sloučeniny dusíku N2 0 Dusík NH3 ‐3 Amoniak NH + ‐3 Amonný ionNH4 ‐3 Amonný ion N2O +1 Ox. dusný NO +2 Ox. dusnatý NO2 ‐ +3 Dusitan NO2 +4 Ox. dusičitý NO3 ‐ +5 Dusičnan3 ů Metabolismus dusíku Rostlina bez nodů Rostlina s nody Rostliny mohou přijímat dusík ve formě: • amonného iontu • dusičnanu a následné redukci na  amonný ion • v případě přítomnosti  bakteriálního symbionta fixujícího  dusík ve formě atomárního dusíku Metabolismus dusíku Fixace dusíku – redukce plynného dusíku na amonný ion Chemická cesta přeměny (Haber‐Bosch) Biologická cesta přeměny (Cyanobacteria, Actinomycetes, α‐proteobacteria) N2 + 16ATP + 8e‐ 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Metabolismus dusíku Enzymologie fixace dusíku • redukce molekuly dusíku je prováděna dvěma enzymy, dinitrogenasou a reduktasou  dinitrogenasy, jejichž komplex je označován jako nitrogenasa Struktura nitrogenasového komplexu DinitrogenasaReduktasa dinitrogenasy Fe protein (NifH) Dinitrogenasa MoFe protein (NifD, NifK + FeMoco) Metabolismus dusíku Struktura Dinitrogenasy (NifD, NifK) • všechny dinitrogenasy obsahují dva identické P‐klastry (8Fe‐7S) vázané na protein 6 kovalentními  vazbami mezi Cys a atomy Fe • dále obsahují další dva klastry přichycené pouze přes atom S cysteinu a atom N histidinu, které lze  reverzibilně z proteinu odstranit. • klastry mohou obsahovat následující kombinace atomů kovů: FeMoCo, FeVCo, FeFeCoy j , , Klastr FeMoCo Metabolismus dusíku Struktura Reduktasy dinitrogenasy (Nifh) • přijímá elektrony z redukovaného feredoxinu nebo flavodoxinu a přenáší je na dinitrogenasu • obsahuje 4Fe‐4S klastr vázaný kooperativně mezi dvěma monomery proteinu• obsahuje 4Fe‐4S klastr vázaný  kooperativně mezi dvěma monomery proteinu • po navázání dvou molekul MgATP se mění struktura proteinu, kdy Fe‐S klastr se posouvá k Fe‐S  klastru dinitrogenasy a dochází k přenosu elektronu M ATPMgATP 4Fe‐4S4Fe 4S Metabolismus dusíku Reakční schéma MoFe enzymového cyklu • celý reakční průběh není ještě do detailu zcela popsán •v počátečních fázích reakce může docházet k uvolňení molekuly H2 , aniž by došlo k  redukci N a celý systém má tak “jalový výkon“redukci N2  a celý systém má tak  jalový výkon . • při vazbě na enzym molekula N2 zřejmě vytěsňuje molekulu H2 z reakčního centra •Pokud přidáme ke komplexu E N H silnou kyselinu nebo zásadu dojde k uvolnění•Pokud přidáme ke komplexu E4N2H2 silnou kyselinu nebo zásadu dojde k uvolnění  hydrazinu. Metabolismus dusíku Symbiotická fixace dusíku • v přírodních ekosystémech pochází 80‐90% rostlinami využitelného dusíku z procesu fixace. • při fixaci N2 existují tři základní typy symbiózy: i. Symbióza gram‐negativních bakterií (rhizobií) s celou řadou luštěnin (hrách, fazole, sojové boby,  čočka, vojtěška) ii. Symbióza gram‐pozitivních bakterií actinomycet s některými dvouděložnými rostlinami (olše,  myrta přesličník)myrta, přesličník) iii. Symbióza  mezi cyanobakteriemi a celouřadou rostlin (kapradí, jaterník, mech)  • výsledná symbióza vznikla zřejmě jako výsledek pozitivních a negativních tlaků během koevoluce    symbiotického partnera a rostliny Metabolismus dusíku Tvorba kořenových nodulů • symbióza rhizobií s luštěninami se odehrává ve speciálních strukturách nazývaných noduly (hlízky) • tvorba nodulů je vyvolána bakteriálními signály na základě kterých dochází ke změnám na  úrovni buněk a orgánů • rozpoznání host‐symbiont probíhá v kořenové sféře, kdy rostlina je infikována skrze kořenové  vlásky • samotná invazivní struktura se jmenuje infekční vlákno a je tvořena rostlinou 1 K ř tli lň jí li it N d1. Kořeny rostlin uvolňují elicitory experese Nod genu 2. Bakterie jako odpověď uvolňuje do okolí Nod faktor 3. Kořeny exprimující nodulinové proteiny jsou y p j p y j infikovány a prochází nodulační morfogenezí Metabolismus dusíku Schéma tvorby kořenových nodulů • kořenové vlásky se postupně stočí a dojde k polapení bakterie • bakterie postupně vytváří invazní vlákno do cílové buňky • bakterie v bakteroidech mají odlišnou morfologii od wt Metabolismus dusíku Geny zodpovědné za symbiózu ‐ bakterie • pro symbiózu rhizobií s luštěninami je nezbytným krokem výměna biochemických signálů  lá k lň é h i l k li lá jí i b k iál í h ů ( d) k é é• látky uvolňované hostitelskou rostlinou vyvolávají expresi bakteriálních genů (nod), které po té  modifikují metabolismus rostliny a její vývoj Stádium symbiosy Rhizobium gen Funkce Regulace genů v odpovědi na  rostlinný signál Formace nodulů, rozpoznání nodD, nolR, nodVW nod, nol, noe Aktivace nebo represe nod promotoru Enzymatická synthesa Nod hostitele faktorů Růst invazivního vlákna exo, lps, ndv Syntéza extracelulárních  polysacharidů Diferenciace, metabolismus bacA Signál pro export/importDiferenciace, metabolismus  bakteroidu bacA dct geny Signál pro export/import Import dikarboxylových kyselin Regulace genů fixujících dusík Fixace dusíku fixL, fixJ,fixA,fixK nifHDK, jiné nif, fix Odpověď na kyslík, transkripční kontrola nif promotoru Enzym nitrogenasa a kofaktoryf j f f y g y Metabolismus dusíku Geny zodpovědné za symbiózu ‐ hostitel • během pozdní fáze nodulace rostlina exprimuje geny nazývané noduliny • mezi noduliny patří leg‐hemoglobin, membránové proteiny, enzymy katalyzující asimilaci  ťamoniaku a zajišťující transport N2 uvnitř rostliny Metabolismus dusíku Látky uvolňované hostitelskou rostlinou indukující expresi nod genuy j p g Flavonoidní povahy Jiné Metabolismus dusíku Základní struktura Nod faktorů ( l ý h hi li h idů)(N‐acylovaných chitooligosacharidů) • Struktura rhizobiálního extracelulárního polysacharidu  (EPS) •Úloha jednotlivých EPS  v procesu symbiózy se liší mezi  jednotlivými páry hostitel‐mikrobjednotlivými páry hostitel mikrob Metabolismus dusíku Přehled rhizobiálních proteinů hrajících roli při symbiózep j p y Plasmatická membrána rostlin Buněčná stěnaBuněčná stěna Vnější bakt. membrána Vnitřní bakt. membrána Obecný sekreční systém Specializovaný  sekreční systém NodO – kationt‐selektivní kanál PlyA B – polysacharidová lyasaPlyA,B – polysacharidová lyasa RapA,C – adhesiny CasA – calsymin (EF motiv) Metabolismus dusíku Fixace N2 v nodulech • při fixaci N2 je nezbytné vytvořit mikro‐aerobní redukční prostředí, ve kterém může docházet k aerobní tvorbě ATP • pro udržení nízké koncentrace kyslíku v nodulech jsou potřeba tři základní faktory: i. permeační bariéra v parenchymu nodulů ii. přítomnost leghemoglobinu vázajícího volný kyslík iii. výrazné snížení Km rhizobiální cytochrom oxidasy (50nM/8nM) Regulace pomocí hemo‐protein kinasy regulované c kyslíku Metabolismus dusíku Asimilace amoniaku a transport  dusíku z nodulů • asimilace amoniaku probíhá v cytosolu a organelách nodulů • za prvotní asimilaci dusíku jsou zodpovědné glutamin syntasa (GS) a NADPH‐dependentníza prvotní asimilaci dusíku jsou zodpovědné  glutamin syntasa (GS) a NADPH‐dependentní  glutamát syntasa (GS‐GOGAT) GS‐GOGAT cyklusGS GOGAT cyklus Metabolismus dusíku Transport dusíku u některých luštěnin (hrách vojtěška)Transport dusíku u některých luštěnin (hrách, vojtěška) Metabolismus dusíku Transport dusíku u některých luštěnin (sója vigna)Transport dusíku u některých luštěnin (sója, vigna) Metabolismus dusíku Asimilace dusičnanů • dusičnan je hlavním zdrojem dusíku pro rostliny • dusičnan je nejprve transportován do buňky (NRT1, NRT2) a poté je buď využit nebo skladován ve vakuole i ve  l i ký h k í h ( ž 20 M)velmi vysokých koncentracích (až 20mM) • při asimilaci je dusičnan nejprve redukován na dusitan (NR), který je poté dále redukován na amoniak (NiR) Metabolismus dusíku Nitrát reduktasa • homotetramer s dvěma vaznými místy pro NADH a dusičnan  • jako zdroj redukčních ekvivalentů slouží NADH/NADPH • obsahuje tři kofaktory (FAD, hem‐Fe, MoCo) NO3 ‐ + NAD(P)H + H+ NO2 ‐ + NAD(P)+ + H2O Metabolismus dusíku Nitrát reduktasa ‐ regulace a NR a NR Relativní hladina Relativní hladina hodiny dny Signál Vliv na NR Glutamin Snížení transkripce Dusičnan Zvýšení transkripce Cytokininy Zvýšení transkripce Cukry Zvýšení transkripce Světlo Zvýšení transkripce a aktivity Tma Snížení transkripce a aktivity ká CO ýš í k i iVysoká c CO2 Zvýšení aktivity Nízká c CO2 Snížení aktivity Metabolismus dusíku Nitrit rekuktasa • zdrojem šesti elektronů je molekula feredoxinu produkovaná v chloroplastech při fotosysntetickém ne‐cyklickém přenosu elektronů • u “nebarevných plastidů“ NADPH z pentosového cyklu redukuje feredoxin v reakci katalyzované  ferredoxin‐NADP reduktasou NO2 ‐ + 6Fdxred + 8H+ NH4 + + 6 Fdxox + 2H2O