STACIONÁRNÍ FÁZE Pokročilá kapalinová chromatografie Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz SILIKAGEL Sil – gel, typ A (méně čistý) - neionizovatelné látky, póry 2.5 nm Sil – sol, typ B rozklad organosilanů, shlukování plynné fáze, čistý, stabilnější i při vyšším pH – i ionizovatelné látky, póry 4.5 – 7 nm Porézní forma oxidu křemičitého (SiO2) vyráběná synteticky z křemičitanu sodného. Desikant Stelivo Stacionární fáze Vysoký aktivní povrch (800 m2/g) a snadná absorpce vody (zahřátím na 150°C lze regenerovat).  Povrch je slabě kyselý, což způsobuje chvostování bazických látek.  Chemicky stabilní do pH 8 www.team-cag.com CHEMICKY VÁZANÉ STACIONÁRNÍ FÁZE commons.wikimedia.org CHEMICKY VÁZANÉ STACIONÁRNÍ FÁZE J. Churáček, P. Jandera, Úvod do vysokoúčinné kapalinové chroamtografie, SNTL, Praha 1984. Zavádění reaktivních funkčních skupin Omezená stabilita – hydrolýza při pH < 3, rozp. při pH > 8.5, zbylé Si-OH skupiny adsorbují látky (basické) a způsobují nesymetrické píky, proto dosilanizace ve 2. stupni Cl-Si(CH3)3 nebo (CH3)3N-Si-N(CH3)3, činidla s rozvětvenými alkyly. méně stabilní stabilnější odolné vůči hydrolýze účinnost PŘÍTOMNOST SILANOLOVÝCH SKUPIN? Protřepat náplň s benzenovým roztokem metylové červeně a promýt čistým benzenem. Červenofialová náplň? Nezreagované hydroxylové skupiny 1,5-NDSA 0.4 M Na2SO4Mobilní fáze Testovací sloučeniny Naftalendisulfonové kyseliny J. Chromatogr. A 1059 (2004) 61–72., J. Sep. Sci. 27 (2004) 789–800. Chromatografický test Volné silanolové skupiny? Retence VOLNÉ SILANOLOVÉ SKUPINY 1. Endcapping – silanizace ve 2.stupni s TMCS (pro kyseliny), s HMDS (pro báze) 2. Encapsulation – obalení povrchu silikagelu tenkou vrstvou silikonového polymeru před modifikací (Stálé do pH 10, zbytkové Si-OH skupiny) 3. Zavedení polárních skupin – stíní povrch, jiná selektivita, brání zhroucení alkylů v mobil. fázích s vysokým obsahem vody 4. Bidentátové stacionární fáze – stabilita při vysokém pH 5. Modifikace celého povrchu – zavedení CH3 skupin do povrchové vrstvy, poměr alkyl : SiOH  1 : 1 se změní na alkyl : CH3 : SiOH  1 : 1 : 1 VOLNÉ SILANOLOVÉ SKUPINY dx.doi.org/10.1590/S0103-50532009000800002 Vertikálně polymerizované fáze Horizontálně polymerizované fáze Stérická ochrana Bidentátové fáze Stacionární fáze s polárními skupinami HYDROSILOVANÝ SILIKAGEL Odstraněno 90-95% Si-OH skupin, menší polarita povrchu, vyšší teplotní stabilita. HILIC aplikace pro polární látky. Navázání bidentátových C18 nebo cholesterolových skupin - dvojí mechanismus: HILIC – RP. J. Chromatogr. A 1245 (2012) 98– 108 Bidentátová C18 skupina Cholesterol DUÁLNÍ RETENČNÍ MECHANISMUS J. Chromatogr. A 1245 (2012) 98– 108 Flavony v 10 mmol/L octanu amonném (65:35 voda : acetonitril) Reverzní fáze Flavony v 10 mmol/L octanu amonném (6:94 voda : acetonitril) Hydrofilní interakce NEJEN SILIKAGEL http://www.pg.gda.pl/chem/CEEAM/Dokumenty/CEEAM_ksiazka/contents.htm CHROMATOGRAFICKÉ ČÁSTICE Tlak na monolitické koloně 3-4x menší – vyšší permeabilita, zvyšování průtoku mobilní fáze - zhoršení účinnosti a rozlišení, větší naředění vzorku Monolitické www.crawfordscientific.com Omezení difúze látek do pórů > eliminace pórů. Snadné přetížení kolony, malé dávkované koncentrace (objemy). Neporézní www.merckmillipore.com Částice < 2 mm: Krátké kolony, technika UHPLC, speciální instrumentace, nejvyšší tlak na koloně, 100 – 150 MPa Kolony s částicemi s tenkou povrchovou pórovitou vrstvou na pevném jádře menší tlak, vyšší permeabilita, vyšší průtoky, lepší rozlišení Povrchově-porézní Plně porézní Phys. Chem. Chem. Phys., 2014, 16, 6583-6592. VNITŘNÍ STRUKTURA ČÁSTIC Monolitická 5) Chromolith 100 x 4.6 mm J. Chromatogr. A 1167 (2007) 63–75. 1) Prontosil 75 x 3 mm, 3 mm 2) Zorbax 75 x 2.1 mm, 5 mm Celoporézní 3) Poroshell 75 x 2.1 mm, 5 mm Povrchově porézní 4) NPS Micra 100 x 4.6 mm, 3 mm Neporézní Objem vnitřních pórů ÚČINNOST Etylbenzen 1) Prontosil / 2) Zorbax / 3) Poroshell / 4) NPS / 5) Chromolith J. Chromatogr. A 1167 (2007) 63–75. Inzulin GRADIENTOVÁ ELUCE PROTEINŮ J. Chromatogr. A 1167 (2007) 63–75. 1 – Insulin 2 – Trypsin 3 – BSA Zlepšená separace při minimalizaci vnitřních pórů POVRCHOVĚ PORÉZNÍ ČÁSTICE (CORE-SHELL) Neprostupné jádro Povrchová porézní vrstva Objevily se již na konci 60. let 20. století. Byly ale zastíněny možností připravit celoporézní částice s menším průměrem (C. Horváth, J. Kirkland) LLC (liquid-liquid chromatography) – porézní vrstva napuštěná nemísitelným rozpouštědlem (problém s rozpustností vzorku) Umožňují rychlejší a účinnější separace. CORE-SHELL ČÁSTICE J. Chromatogr. A 1357 (2014) 36–52. A) Jedna částice B) Shluk částic C) „Skořápka“, „chrastítko“ D) Malé částice na jedné E) Více vrstev F) Agregované částice G) Integrace částic do vrstvy H) Několik různých vrstev I) Chromatografie MORFOLOGIE CORE-SHELL ČÁSTIC J. Chromatogr. A 1217 (2010) 3819. PŘÍPRAVA CORE-SHELL ČÁSTIC Monodispersní křemenné mikro částice (sub-2-3-mm) připravené pomocí Stöberovy metody (1968) Jádro Anal. Methods, 2016, 8, 919-924. Chem. Commun., 2010, 46, 5832-5849 Hydrolýza a polykondenzace tetra- etylortosilikátu probíhá v systému etanol/voda. PŘÍPRAVA CORE-SHELL ČÁSTIC J. Chromatogr. A 1357 (2014) 36–52. Porézní vrstva Syntéza vrstvy na vytvořených částicích  Polymerizace podporovaná silikagelem  Precipitační polymerace  Silica-metal-organic frameworks (MOFs)  Magnetické core-shell částice J. Mater. Chem. A, 2013, 1, 7488-7493. Elektrostatické interakce PŘÍPRAVA CORE-SHELL ČÁSTIC Porézní vrstva Spheres-on-spheres 3-mercaptopropyltrimethoxysilanPrekurzor Adv. Mater. 24 (2012) 6042. PŘÍPRAVA CORE-SHELL ČÁSTIC Porézní vrstva Metal-organic frameworks (MOFs) www.sigmaaldrich.com www.nanoshel.com J. Mater.Chem. A 1 (2013) 3276. PŘÍPRAVA CORE-SHELL ČÁSTIC Porézní vrstva Kapková emulzní technika Pickering emulsion Emulze stabilizovaná pevnými částicemi (koloidní silikagel), které se absorbují na rozhraní dvou fází www.slideshare.net/jorissalari/joris-salari-phd Langmuir 27 (2011) 13242. Langmuir 27 (2011) 13242. VLIV MIMOKOLONOVÝCH OBJEMŮ http://www.chromatographyonline.com/superficially-porous-particles-perspectives-practices-and-trends-0 k = 5 VLIV MIMOKOLONOVÝCH OBJEMŮ http://www.chromatographyonline.com/superficially-porous-particles-perspectives-practices-and-trends-0 k = 5 Nutná optimalizace (pokud je cílem účinnost a selektivita) VYŠŠÍ ÚČINNOST J. Chromatogr. A 1258 (2012) 76–83. SROVNÁNÍ KOLON J. Chromatogr. A 1258 (2012) 76–83. Počet pater / pracovní tlak (bar) STABILITA J. Chromatogr. A 1258 (2012) 76–83. VLIV KONCENTRACE VZORKU J. Chromatogr. A 1258 (2012) 76–83. Srovnatelný vliv zvýšené koncentrace vzorku, ale dramatičtější pokles účinnosti. Tloušťka porézní vrstvy snižuje vliv koncentrace vzorku na účinnost kolony. 2.7 mm částice s 0.5 mm vrstvou, 75% objemu porézní > vyšší koncentrace vzorku CORE-SHELL VS. PLNĚ PORÉZNÍ J. Chromatogr. A 1258 (2012) 76–83. CORE-SHELL VS. UHPLC www.chromatographyonline.com/current-state-superficially-porous-particle-technology-liquid-chromatography 50 mm × 2.1 mm, 2.7 μm Poroshell 120 EC-C18 50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm Zorbax RRHD Eclipse Plus C18 54.9 MPa 100.3 MPa Core-shell Celoporézní CORE-SHELL VS. UHPLC www.chromatographyonline.com/current-state-superficially-porous-particle-technology-liquid-chromatography 50 mm × 2.1 mm, 2.7 μm Poroshell 120 EC-C18 50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm Zorbax RRHD Eclipse Plus C18 54.9 MPa 100.3 MPa Core-shell Celoporézní UHPLC CORE SHELL VS. PORÉZNÍ ČÁSTICE Efficiency comparison between fully porous and superficially porous 5-μm particles. Column dimensions: 250 mm × 4.6 mm, 5 μm; mobile phase: acetonitrile–water; test compound: benzophenone; k' = 6.2 (isoelutropic conditions). (Data courtesy of Dr. Ken Broeckhoven, Vrije Universiteit Brussel.) www.chromatographyonline.com/current-state-superficially-porous-particle-technology-liquid-chromatography LEGENDY Core-shell částice jsou tak dobré, protože: 1) Mají malý příspěvek axiální (longitudinální) difúze k účinnosti (parametr B) 2) Umožňují rychlý převod hmoty mezi mobilní a stacionární fází (parametr C) 3) Vířivá difúze je nezávislá na průtoku mobilní fáze (parametr A) 4) Mají velmi úzkou distribuci velikosti částic www.phenomenex.com VAN DEEMTEROVA ROVNICE www.thermofisher.com 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑢 + 𝐶𝑠 + 𝐶 𝑚 ∙ 𝑢 C – odpor proti převodu hmoty A – turbulentní difúze B – molekulová difúze kvalita a rovnoměrnost náplně Difúzní koeficienty látek (malé vs. velké molekuly) Difúze ve stacionární fázi, tvar a velikosti náplně, „hloubka“ difúze 𝐻 = 𝐻𝐴 + 𝐻 𝐵 + 𝐻 𝐶𝑠 + 𝐻 𝐶𝑚 ℎ = 𝐻 𝑑 𝑝 𝜈 = 𝑢 ∙ 𝑑 𝑝 𝐷 𝑚 Redukované veličiny 𝐷 𝑚 = 7.4 ∙ 10−8 𝑇 𝜙𝑠𝑣 ∙ 𝑀𝑠𝑣 𝜂 𝑠𝑣 ∙ 𝑉𝐴 0.6 Difúzní koeficient Wilke-Changova rovnice f – asociační faktor: voda 2.6, metanol 1.9, etanol 1.5, ACN 1.37, ostatní 1 LEGENDY ÚČINNOSTI CORE-SHELL ČÁSTIC www.phenomenex.com Porézní Core-shell A B C A B C LEGENDA Č. 1 MALÝ PŘÍSPĚVEK B www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles Tloušťka vrstvy / průměr částic Difúze ve vrstvě/ difúze v mobilní fázi Plně porézní Povrchově-porézní Neporézní DB 25 000/m pro 2.6 mm core-shell LEGENDA Č. 1 MALÝ PŘÍSPĚVEK B JE VELKÝ www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles Tloušťka vrstvy / průměr částic Difúze ve vrstvě/ difúze v mobilní fázi Plně porézní Povrchově-porézní Neporézní DB 25 000/m pro 2.6 mm core-shell LEGENDA Č. 1 MALÝ PŘÍSPĚVEK B JE VELKÝ www.phenomenex.com Vliv jádra Nižší vliv parametru B Posunuje minimum v vyšším hodnotám Porézní Core-shell www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 2 ODPOR PROTI PŘEVODU HMOTY < 5 % Minimální vliv parametru C na účinnost (malé molekuly) www.chromatographyonline.com/current-state-superficially-porous-particle-technology-liquid-chromatography www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 2 ODPOR PROTI PŘEVODU HMOTY < 5 % Minimální vliv parametru C na účinnost (malé molekuly) [platí pro velké molekuly] www.chromatographyonline.com/current-state-superficially-porous-particle-technology-liquid-chromatography www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 2 ODPOR PROTI PŘEVODU HMOTY www.phenomenex.com Minimální rozdíl mezi vlivem odporu proti převodu hmoty (parametr C) Porézní Core-shell www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 3 NEKONSTANTNÍ PARAMETR A www.phenomenex.com Porézní Core-shell www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 3 NEKONSTANTNÍ PARAMETR A www.phenomenex.com Parametr A (turbulentní difúze) roste s průtokem mobilní fáze Porézní Core-shell 1.52.5 www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles LEGENDA Č. 4 ÚZKÁ DISTRIBUCE ČÁSTIC www.phenomenex.com www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles PŘEDSTAVA LEGENDA Č. 4 ÚZKÁ DISTRIBUCE ČÁSTIC www.phenomenex.com Neplatí, pokud rozptyl v distribuci částic nepřesáhne 50 % Lepší homogenita náplně (vliv porézní vrstvy?) Malý vliv turbulentní difúze www.chromatographyonline.com/facts-and-legends-columns-packed-sub-3-m-core-shell-particles PŘEDSTAVA VLIV VELIKOSTI ČÁSTIC www.phenomenex.com NUKLEOSIDY, HALO PENTA-HILIC, 100 X 4.6MM DOI: 10.1016/j.jpha.2013.02.005 Gradientová eluce SULFONAMIDY Plně porézní Core-shell www.agilent.com Gradientová eluce „Challenges are what make life interesting; overcoming them is what makes life meaningful.“ Joshua J. Marine