MONOLITY Pokročilá kapalinová chromatografie Jiří Urban. Ústav chemie. Přírodovědecká fakulta. Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz 7533 SVĚTOVÉ MONOLITY STLAČENÉ GELY Vliv průtoku mobilní fáze 0.50 0.25 0.12 Polymerace vodného roztoku N,N'-methylenebis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli, nejčastěji síranu amonného Stlačení na méně než 10 % původního objemu Separace bílkovin v iontově-výměnném módu (neočekávané) zvýšení permeability po stlačení gelu Lineární gradient 2.25 - 0.25 M síran amonný ■ myoglobin (M) ■ ribonuclease (R) ■ ovalbumin (O) ■ a-chymotrypsinogen A (C) ■ phycoerythrin (P) 0 10 20 30 (min) a 0 4 S (min) J. Chromatogr., 473 (1 989) 273., J. Chromatogr. 586 (1 991) 21 -26. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE Pro separace vysokomolekulárních látek je potřeba velmi krátká kolona (B.G. Belenkii) 800x 5400x J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE 600 1 400 I 3 200 Oh Vliv složení polymerační směsi (rostoucí koncentrace GMA) 0.2 0.3 Pressure, MPa Separace bílkovin 1 J 30 20 10 0 Time, min Membrána 1 x 20 mm (1) Myoglobin (2) Ovalbumin (3) Ribonucleáza A (4) Lysozym (5) Chymotrypsinogen J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. POLYMERNÍ MONOLITY O CH3 O Glycidyl metakrylát ch2 o Ethylen dimetakrylát Cyklohexanol Dodekanol Azobisisobutyronitril 6 h při 70 °C 30 x 8 mm Chromatografie iontové výměny modifikováno (diethylamino)hydroxypropylem E 1.00 2.00 3.00 4.00 x 101 minutes Anal. Chem. 64 (1992) 820-822. RADIKÁLOVÁ POLYMERACE RADIKÁLOVÁ POLYMERACE Fáze polymerace Azobisisobutyronitril 1) Iniciace n. 2) Propagace A N n 3) Terminace Teplotou iniciovaná polymerace UV zářením iniciovaná polymerace POLYMERNÍ MONOLITY Modifikace vnitřní stěny Kapilára Iniciace uv, z... Monolitická kapilární kolona Polymerační směs ■ Funkční monomery (ST, CMS, BMA, GMA, ■ Síťující monomery (DVB, EDMA, ...) ■ Porogenní rozpouštědla (alkoholy, ...) ■ Iniciátor (AIBN, benzofenon) azobisisobutyronitril benzofenon ••) Polymetakryláty Styren-divinylbenzen DVB (B)MA EDMA T Styren ROBUSTNOST MONOLITŮ Digest šesti proteinů, monolit 250 mm Izokratická separace malých molekul Intens x107 5 000 0 20 40 60 80 100 120 Time (min) J. Chromatogr. A,1217 (2010) 6610-6615. r 0 Stabilní a reprodukované výsledky (stále ale pouze výzkumné laboratoře) 24 024 024 Time, min Fenol (1), toluen (2), and thiomočovina(3) v 98% ACN, průtok 1 0 |al/min. J. Sep. Sci. 201 3, 36, 2806-281 2 KONTROLA MORFOLOGIE 2 DOMINANTNÍ PRŮTOČNÉ PÓRY PORÉZNÍ VLASTNOSTI Rtuťová porozimetrie Chromatografická porozi 8 4 - -1—i i i n 1 10 100 1000 10000 Pore diameter, nm Chem. Mater. 7 (1 995) 707. Suchý vs. nabobtnaný stav Porozita, aktivní povrch, distribuce pórů 0.9- ü) 0.8 H o L. o a "rô 0.7-o Chromatografie i 06- Rtuťová porozimetrie 10 —r— 20 -i— 30 -1— 40 Monomers [%] vs. J. Chromatogr. A 11 82 (2008) 161 - 1 68. MAKROPORÉZNÍ MONOLITY Monolit Polymer C8 Silikagel 50 x 4.6 mm 1 50 x 4.6 mm, 1 0 |J,m 1 50 x 4.6 mm, 5 |J,m Peptidy Proteiny (a) 1 J 2 ^ u (b) Nízký pracovní tlak 1 Rychlý průtok mobilní fáze (c) ( : Jl_ 40 2 4 0 KííiĽiitiuii [íjíIí'. min 1 0 |am ľ Monolit 0 5 10 J. Chromatogr. A 865 (1 999) 1 69-174. Flow rate, raIVmin -»-1-«—■ 0 0,5 Ketention tíme, min 1 0 10 20 Ret en í km timeT s Rychlé gradientově separace VLIV MALÝCH PÓRŮ Gradientova eluce malých molekul A 1 2 3 t [min] J. Sep. Sci. 29 (2006) 1 064 - 1 073. MONOLITICKÉ STACIONÁRNI FAZE Anorganické monolity Organické monolity malé molekuly velké molekuly 0 00 0 25 0 50 0 75 1 00 1 25 1 50 1.75 0 00 0.25 0 50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 Time, min Time, min E. COLI DIGEST 1 m monolit, piková kapacita 1038 100 200 300 400 Time (min) 500 600 J. Chromatogr. A,l 21 7 (201 0) 661 0 - 661 5. TEPLOTA POLYMERACE 15 CL 10 I < Í 5 10 100 1000 Póre diameter, nm 10000 Vyšší teplota I Víc radikálů I Víc center polymerace I „Hustší" monolit I Menší póry Chem. Mater. 1 995, 7, 707-71 5. TEPLOTA POLYMERACE Povrch & Objem pórů Distribuce pórů 50 80 70 80 00 100 1 10 100 1000 10000 Polymerization temperature, "C pore diameter, nm Macromolecules 28 (1 995) 7580 - 7582. Chem. Mater. 1 995, 7, 707-7\5. KONVERZE POLYMERAČNÍ REAKCE 100+■ 90 7; 2; 100 75 50 25 L 0 0.5 1 2 3 6 ■ etylen dimetakrylát ■ butyl metakrylát 0 L.** 100 - .O O 50 - • styren (•) ethylstyren (□) divinylbenzen (o) glyddyl metakrylát ethylen dimetakrylát 1.0 0.9- 0.7- Li.fi 0.5 (a) Celková porozita 1 ■ 0 : 01 0 * 0 • uracil 0 • * konverze 0 • 1 ____°_°____l --1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 10 20 30 40 50 -1-'-1-1—1— 2 3 4 6 8 10 20 40 0 1000 2000 Polymerization time, min 8- 7- e- f 7 5 O 1- 4 ■4—* Ľ, n 3- D 2 - n 1 - 0- Polymerisation tíme, h J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397 (b) I Permeabilita —1—1—1—1—1—t—j— 10 20 30 40 Polymerization time, h 5: KONVERZE POLYMERACNI REAKCE Morfologie a kvalita separace poly(styren-co-divinyl benzen) 3 h 48 h Macropores M e s op o re s Less cross-linked polymer; f 400 nm < (Ľ m (a) 3 A 0V> 3 h i i 1<' i' i ■ i ■ i i i i i i i i i i i 11 0 2 4 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 ■iA 8 ; c n I i-i (b) (1) 48 h f2) (3) (i) (5) (C) f 71 1 I 1 I ' I.....I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 !' I D 2 4 6 fl 10 12 14 1& 18 20 22 24 Time, min J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397. KONVERZE POLYMERAČNÍ REAKCE J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397. FUNKČNÍ Butyl metakrylát (BMA) O CH, BMA LMA i-w~ 0 1 CMMA f-f-f— 2 3 4 r I Cyklohexyl metakrylát (CHMA) CH3 7 3 THMA i i ---,- ,-.--- 0 23401234 Ethylhexyl metakrylát (EHMA) O H2C: (1) Insulin (2) Cytochrom c (3) BSA (4) P-laktoglobulin. i-» r » » 0 12 3 4 Time, min Lauryl metakrylát (LMA) 0 Y^OCH2(CH2)10CH3 Chk H2C Stearyl metakrylát (SMA) O H2C OCh^Ch^JisCH^ CH, Nutnost (neustálé) optimalizace složení směsi J. Sep. Sci. 34 (201 1) 2054 - 2062. 8891 8891 POVRCHU Glycidyl metakrylát 1875 POVRCHU Styren & Chlormethylstyren ci-R I Aicij Friedel-Craftsova alkylace HN- ,NH, NHj TAEA tris(aminoethyl)amin NEt3 N2(C(CN)(CH3)C2H4COOH)2 y-glucuronolakton rK5 mer48 (2007)2187-2198. 1875 OBECNÝ MONOLIT Anal. Chem. 82 (201 0) 1 621 - 1 623. | J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 821 2 - 8221. ZESÍTĚNÍ (HYPERCROSSLINKING) rozpouštědlo 1,2-dichloroethan ZVÝŠENÍ AKTIVNÍHO POVRCHU 600- původní monolit zesítěný monolit Ol E