GRADIENTOVÁ ELUCE Pokročilá kapalinová
chromatografie
Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz
KONSTANTNÍ SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE
40 % ACN
KONSTANTNÍ SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE
60 % ACN
KONSTANTNÍ SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE
80 % ACN
CHROMATOGRAFICKÁ ELUCE
Izokratická eluce Gradientová eluce eluce
40 % acetonitrilu 20 – 80 % acetonitrilu ve 20 min
70 minut 15 minut
Kontinuální změna složení mobilní fáze. Snížení retence více zadržovaných látek
CHROMATOGRAFICKÁ ELUCE
Izokratická eluce Gradientová eluce eluce
40 % acetonitrilu 20 – 80 % acetonitrilu ve 20 min
70 minut 15 minut
Kontinuální změna složení mobilní fáze. Snížení retence více zadržovaných látek
TVORBA GRADIENTU
Nízkotlaký gradient
 Až čtyři složky mobilní fáze
 Vyšší zpoždění gradient
 Tvorba gradientu PŘED čerpadlem
Vysokotlaký gradient
 Vysokotlaká čerpadla
 Menší zpoždění gradientu
 Tvorba gradientu ZA čerpadlem
VÝHODY A NEVÝHODY GRADIENTOVÉ ELUCE
 Ekvilibrace kolony
 Převod metody
 Čistota rozpouštědel
 Kompatibilita detekce
 Odstranění nečistot
 Větší rozpětí (retence) látek
 Zvýšení píkové kapacity
 2D-LC
 Zaostření píků (citlivost detekce)
 Velké molekuly
 MS spojení
Nevýhody Výhody
TYPY GRADIENTŮ
Lineární Konvexní Konkávní
Skokové
Složky
 2, 3, 4, …
Mód
 RP, NARP, Ion pair, pH, IS, IEX, NP, HILIC
TYPY GRADIENTŮ
Lineární Konvexní Konkávní
Krokové
Složky
 2, 3, 4, …
Mód
 RP, NARP, Ion pair, pH, IS, IEX, NP, HILIC
TŘÍSLOŽKOVÉ GRADIENTY
Dvě Nova-Pak C18 kolony v sérii, 4 µm (3.9 x 150 mm I.D.)
 70 - 100% acetonitril – voda do 20 min,
 100% acetonitril do 36 min,
 100% acetonitril - 60% 2-propanol/acetonitril do 132 min.
Methyl estery (Ms),
mono-, di- and
triacylglyceroly
Ln - linolenové,
L - linolové,
O - olejové,
P - palmitové,
S - stearové,
G – gadoleové
kyseliny.
1 ml/min
UV detekce 205 nm
Částečně transesterifikovaný řepkový olej
GRADIENTY TEPLOTY
van´t Hoffova rovnice
Menší citlivost na změnu
 DT 4 – 5°C ~ Dj 1 % ACN
Tepelná stabilita kolon (60°C)
 bidentátové kolony, ZrO2 (100°C)
Pomalejší odezva
 nanoLC a mLC
Instrumentace
 Peltierův termostat1/T, K-1
logk
l𝑜𝑔 𝑘 = 𝐴 +
𝐵
𝑇
Spíš doplňkově
nebo ve specifických případech
ZPOŽDĚNÍ GRADIENTU
čerpadlo dávkovač kolona detektor
Zpoždění gradientu
(objem mobilní fáze)
Teoretický průběh
čas
mobilnífáze
čas
mobilnífáze
 1% aceton jako mobilní fáze B
 Silně ovlivněno instrumentací
 Nutno zahrnout do optimalizace
Reálný průběh
VD
VD
POČÁTEČNÍ KONCENTRACE
5 – 80 % za 30 minut 25 – 80 za 30 min
Čím vyšší, tím rychlejší eluce málo zadržovaných látek
A
KONCOVÁ KONCENTRACE
5 – 60 % za 30 minut 5 – 90 za 30 min
jK
Čím vyšší, tím rychlejší eluce více zadržovaných látek
ČAS GRADIENTU
5 – 60 % za 30 minut 5 – 60 % za 15 min
Čím vyšší, tím rychlejší eluce látek
tG
STRMOST GRADIENTU
5 – 60 % za 30 minut 5 – 60 % za 15 min
Čím vyšší, tím rychlejší eluce látek
B𝐵 =
𝜑 𝐾 − 𝐴
𝑡 𝐺
RETENČNÍ FAKTOR, ŠÍŘKA PÍKU A ROZLIŠENÍ
𝑘∗
=
1
1.15𝐵 +
1
𝑎
Eluční faktor v době eluce
𝑘 𝑒 = 2.31𝑚
∆𝜑
𝑉𝐺
𝑉 𝑀 + 10(𝑚𝐴−𝑎)
−1
Eluční faktor v polovině kolony
𝑤𝑔 =
4𝑉 𝑀(1 + 𝑘 𝑒)
𝑁
Šířka píku
𝑅 𝑠 =
𝑉𝑅(2) − 𝑉𝑅(1)
𝑤𝑔
Rozlišení píků
Předpoklad konstantní šířky píku v gradientové eluci
PÍKOVÁ KAPACITA
Maximální počet píků, které lze rozdělit v rámci jedné analýzy
Izokratická eluce
Gradientová eluceP
5 10 VR,Z/VR,1
100
200
RETENCE V GRADIENTOVÉ ELUCI
logk
jACN
Retence vs. složení mobilní fáze
log 𝑘 = log 𝑘0 − 𝑚 ∙ 𝜑 = 𝑎 − 𝑚 ∙ 𝜑
Retenční faktor
v čisté vodě
Koncentrace
(acetonitrilu)
Llyod R. Snyder Teorie lineární síly rozpouštědla (Linear Solvent Strength theory, LSS)
Směrnice gradientu Eluční faktor v polovině kolony
ekvivalent k
Konstanta odpovídající
síle mobilní fáze
PREDIKCE RETENCE V GRADIENTOVÉ ELUCI
logk
jACN
Retence vs. složení mobilní fáze
log 𝑘 = 𝑎 − 𝑚 ∙ 𝜑
Pavel Jandera
𝑉𝑅 =
1
𝑚 ∙ 𝐵
𝑙𝑜𝑔 2.31𝑚𝐵 𝑉 𝑀10 𝑎−𝑚𝐴 − 𝑉𝐷 + 1 + 𝑉 𝑀 + 𝑉𝐷
Konstanty a a m Několik gradientů (6)
lineární
regrese
nelineární
regrese
Gradient Elution in Column Liquid Chromatography, Theory and Practice, P. Jandera J. Churáček, Elsevier, 1985, str. 509,
Reverzní fáze
PREDIKCE RETENCE V GRADIENTOVÉ ELUCI
Normální fáze
 Nižší viskozita mobilní fáze (nižší tlak)
 Chemicky vázané stacionární fáze jsou
stabilnější v čisté organice
 Lepší rozpustnost látek v organické mobilní fázi
 Analýza vysoce hydrofobních látek (neúměrně
zadržovaných v RP systému)
 Separace pozičních izomerů a stereoizomerů
 Bezproblémová extrakce do nepolárních
rozpouštědel (problém v RP)
 Separace syntetických polymerů nerozpustných
ve vodě
Stacionární fáze
silikagel, polární skupiny
Mobilní fáze
A: hexane, heptan
B: dichlormethan, metyl tert-butyl ether,
alkoholy, estery, nitrily
𝑘 = 𝑘0 𝜑−𝑚
Chromatografie iontové výměny
Formálně podobné NP systému
Separace malých anorganických iontů nebo
oligonukleotidů, nukleových kyselin, peptidů
a proteinů.
ϕ odpovídá molární koncentraci elektrolytu v mobilní fázi a parametr m stechiometrickému koeficientu výměny.
VYSOKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKYlogk
jACN
logk
jACN
Malé molekuly Vysokomolekulární látky
 Pomalá difúze
 On/off efekt
 Nižší dynamický rozsah eluce
 Gradientová eluce
𝑚 = 0.48𝑀0.44
𝑉𝑅 =
1
𝑚 ∙ 𝐵
𝑙𝑜𝑔 2.31𝑚𝐵 𝑉 𝑀10 𝑎−𝑚𝐴
− 𝑉𝐷 + 1 + 𝑉 𝑀 + 𝑉𝐷
Přístupnost
Velikost
J. Chromatogr. A 1167 (2007) 63–75.
VYSOKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY
„Srážecí-rozpouštěcí“ chromatografie (GPEC)
Nadávkování směsi polymerů do „srážecí“
mobilní fáze (metanol). Postupné zvyšování
koncentrace „rozpouštěcí“ mobilní fáze
(THF). Eluce podle rozpustnosti/molární
hmotnosti.
Lze použít k určení parametrů velikosti
a distribuce polymerů.
0 – 60 % THF v 5 min
J. Polym. Sci. – Polym. Chem. 38 (2000) 2767-2778., J. Sep. Sci. 25 (2002) 909–916., J. Sep. Sci. 40 (2017) doi:10.1002/jssc.201700048
GPEC eluce v první
dimenzi separace
polymerů.
VÝVOJ METODY GRADIENTOVÉ ELUCE
𝑉𝑅 =
1
𝑚 ∙ 𝐵
𝑙𝑜𝑔 2.31𝑚𝐵 𝑉 𝑀10 𝑎−𝑚𝐴 − 𝑉𝐷 + 1 + 𝑉 𝑀 + 𝑉𝐷
Matematická optimalizace více parametrů
(pozor na lokální maxima a minima!)
 Několik iniciačních analýz (větší rozsah koncentrací a časů)
 Získání konstant a, m
 Vhodné kritérium optimalizace (Rozlišení, RS) a jeho
závislost na vybraném parametru (strmost gradientu,
počáteční koncentrace, …)
 Nalezení optimálních podmínek
Zdeněk Uhlíř
Jednoparametrová optimalizace
𝐵 =
𝜑 𝐾 − 𝐴
𝑡 𝐺
Dvouparametrová optimalizace
 Synergický efekt (tG, T nebo tG, A)
 Hledání optimálních podmínek
VÝVOJ METODY GRADIENTOVÉ ELUCE
𝑉𝑅 =
1
𝑚 ∙ 𝐵
𝑙𝑜𝑔 2.31𝑚𝐵 𝑉 𝑀10 𝑎−𝑚𝐴 − 𝑉𝐷 + 1 + 𝑉 𝑀 + 𝑉𝐷
Matematická optimalizace více parametrů
(pozor na lokální maxima a minima!)
www.pametnik.cz
 Několik iniciačních analýz (větší rozsah koncentrací a časů)
 Získání konstant a, m
 Vhodné kritérium optimalizace (Rozlišení, RS) a jeho
závislost na vybraném parametru (strmost gradientu,
počáteční koncentrace, …)
 Nalezení optimálních podmínek
Zdeněk Uhlíř
Jednoparametrová optimalizace
𝐵 =
𝜑 𝐾 − 𝐴
𝑡 𝐺
Dvouparametrová optimalizace
 Synergický efekt (tG, T nebo tG, A)
 Hledání optimálních podmínek
PŘEVOD METODY
𝑉 𝑀
𝑉𝐺
=
𝑉 𝑀
𝑡 𝐺 𝐹𝑚
=
𝑑 𝑐
2 𝐿
𝑡 𝐺 𝐹𝑚
= 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎
Základní předpoklad
Pozor na zpoždění gradientu
 Použít „dlouhé“ rovnice
 Dávkovat do „začátku“ gradientu
(ne každý systém to dovoluje)
mobilnífáze Reálný průběh
VD
Složitější optimalizace
než v izokratické eluci
Průměr
a délka kolony
PŘEVOD METODY
Systém 1 Systém 2
L – délka kolony
dc – průměr kolony
dp – velikost částic
Vi – dávkovaný objem
F – Průtok mobilní fáze
p – Pracovní tlak
N – účinnost
tg – čas (v) gradientu
𝑉 𝑀
𝑉𝐺
=
𝑉 𝑀
𝑡 𝐺 𝐹𝑚
=
𝑑 𝑐
2 𝐿
𝑡 𝐺 𝐹𝑚
= 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎
PŘEVOD METODY
Systém 1 Systém 2Průtok mobilní fáze
𝐹2 = 𝐹1 ∙
𝑑 𝑐(2)
2
𝑑 𝑐(1)
2 ∙
𝑑 𝑝(1)
𝑑 𝑝(2)
Dávkovaný objem
𝑉𝑖(2) = 𝑉𝑖(1) ∙
𝑑 𝑐(2)
2
∙ 𝐿2
𝑑 𝑐(1)
2
∙ 𝐿1
Profil gradientu
𝑡 𝑔(2) = 𝑡 𝑔(1) ∙
𝑉 𝑀(2)
𝑉 𝑀(1)
∙
𝐹1
𝐹2
Účinnost
𝑁2 = 𝑁1 ∙
𝑑 𝑝(1)
𝑑 𝑝(2)
∙
𝐿2
𝐿1
𝑝2 = 𝑝1 ∙
𝐿2 ∙ 𝐹2
𝐿1 ∙ 𝐹1
∙
𝑑 𝑝(1) ∙ 𝑑 𝑐(1)
𝑑 𝑝(2) ∙ 𝑑 𝑐(2)
2
Pracovní tlak
“The ignorance of the world often
makes people believe that life should be
black and white – that you must choose
sides – and so the world of colorful
gradients goes unadmired.“
A.J. Darkholme
Rise of the Morningstar