Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů
Obecné TFII komplexy, histon … a proces transkripce
Komplexy spojené s transkripcí
- velký žlábek má velikost odpovídající
rozměrům α-šroubovice a má
exponované vazebné skupiny
- nejčastěji interaguje Arg (pozitivní
náboj + vodíkové vazby)
• Zipper typ
• Helix-turn-helix
• Zinkový prst
• Histon, HMG-box
• β-barrel
• β-hairpin/ribbon
• Smíšené α/β
TFIIB RNA pol IITBP
Rpb4/7
TFIIA
TFIIE
TFIIF
• Velký žlábek má velikost
odpovídající rozměrům αšroubovice
a má exponované
vazebné skupiny
• Nejčastěji interaguje Arg
(pozitivní náboj + vodíkové
vazby)
• Průběh transkripce – skládání
komplexů
TBP
Histon
- histony vážou DNA sekvenčně nespecificky
- histonové podjednotky (H2A, H2B, H3, H4) obsahují svazky
3-4 šroubovic skládaných proti sobě (histon fold)
- DNA se obtáčí kolem válcovitého oktameru (2x4 histony)
- šroubovice se vážou na cukrfosfátovou kostru DNA
1KX3
Liljas a spol.
H3 H4
1KX3
- 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3
Skládání histonů do nukleosomu
- 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou šroubovice H3
(acetylovaný K56)
Ransom et al, Cell, 2010
H3-H4
Povrch/kontakt
tvoří lysiny a
argininy
H2A/H2B
McGinty a Tan, Chem Rev, 2015
(opačné barvy)
H2A/H2B váže dvě vlákna
H3/H4 váže jedno vlákno, ale
silněji (více objímá)
Konce histonů
- N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho dynamiku
- mohou posílit/oslabit interakce s DNA – rozvolnit nukleoproteinový komplex
Modifikace histonů
- např. acetylace lysinů (změna náboje) oslabí interakci s DNA a rozvolní vazbu
oktameru (zpřístupní DNA pro TBP)
- následně se TFIID váže na Ac-H4 (K8, K16) prostřednictvím bromodomény
TAF1 proteinu (reader/writer/eraser)
- AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB pokrývá sekvenci -102 až -47 básí upstream od TSS = tj. mezi
nukleosomy (nukleosom-free oblast)
- nukleosom downstream zakrývá TATA-box
- všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují s SAGA a CBP/p300
acetylásou - acetylace nukleosomu vede k remodelaci/přemístění a uvolnění TATA-boxu
- uvolní se TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polymerasy II
IFN-β enhanceosom
sekvence DNA může být
zcela zakryta
nukleosomem nebo
může být přístupná nebo
může být v oblasti mezi
nukleosomy
Agalioto et al, Cell, 2000
Panne, CO in SB, 2008
Motivy DNA vazebných domén
β-listy
α-šroubovice
• Zipper typ
– Leucinový zip
– Helix-loop-helix
• Helix-otáčka-helix
– Winged helix
• Zinkový prst
– ββα zinc-finger
– Hormon-receptor
– Loop-sheet-helix
– Gal4
• Histon, HMG-box
• β-hairpin/ribbon
• β- barrel
TBP, OB-fold,
OB-fold
(oligonucleotide/oligosacharide
binding)
- 4-5 anti-paralelních β-listů
(β-barel) zakončeno αšroubovicí
(kompaktní)
- vytváří úzkou jamku pro
jednořetězcovou ssDNA
(RNA, oligosacharidy)
- váže 2-5 nukleotidů (báze,
cukry i fosfáty)
- SSB/RP-A a TRF proteiny
(replikace, HR, telomery ...
Dr. Špirek)
Liljas, kniha (2SNS)
OB-fold (oligonucleotide/oligosachcaride binding, 1JMC)
Více OB – RPA70 (A+B) vytváří prodlouženou lineární kapsu
- protein-proteinové
interakce (integrita
komplexu + interakce s
dalšími proteiny/komplexy)
- Dr. Spirek
(cdc13 v kvasinkách)
CST komplex (RPA-like)
– regulace telomer
(obsahují ssDNA)
Flynn a Zou, CR in BMB, 2010
- oprava DNA
- část komplexu SHELTERIN
– chrání telomery (aby nebyly
považovány za DSB, reguluje
přístup telomerásy)
nespecifická
vazba
TTAGGGTTAG-
specifická
vazba
Bochkareva et al, EMBO J, 2002
Flynn a Zou, CR in BMB, 2010
Centrální část RPA komplexu (1L10) a model celého komplexu
- protein-proteinové
interakce (integrita
komplexu)
- celý komplex ~30nt
TATA-box vážící protein (TBP) –
klíčový pro sestavení
preiniciačního komplexu (PIC)
- 10 anti-paralelních β-listů
pokrývá MŽ
- Interkalují se postranní
řetězce Phe (hydrofobní v.)
- vytvaří ohyb (kink) a
rozplétá dsDNA
- Konsensní sekvence:
TATA(A/T)A(A/T)(A/G)
1YTB
TBP a TFIIA (β-barrel – neovlivní DNA strukturu)
Liljas a spol.
1NH2
TBP
TFIIA
- TFIIA (2 podjednotky) komplex interaguje s TBP a DNA a
zajišťuje jeho správnou pozici
- brání represorům v inhibici vazby TBP na TATA-box (koaktivátor
některých sekvenčně specifických trans. faktorů)
- β-barrel váže DNA (neovlivňuje strukturu)
Figure 6-16 Molecular Biology of the Cell
Začátek/iniciace transkripce –
TFIID (nukleace komplexů)
TFIIA
13
Bieniossek et al., Nature, 2013
- jádro komplexu (symetrické) tvoří
TAF4, 5, 6, 9 a 12 - po připojení všech
podjednotek TFIID komplexu včetně
TBP vzniká funkční (asymetrický)
holokomplex (PIC)
cryoEM
- TFIID (1MDa, TAFs) komplex a TBP jsou klíčové pro
rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení
transkripčního systému (nukleace PIC)
Cianfrocco et al, Cell, 2013
- footprint analýza ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže
na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box)
|
Louder et al, Nature, 2016
pro další postup transkripce je klíčový TFIIB – propojuje TFIIDTFIIA
s RNApol II
- TFIIB (C-konec = CTD1 a CTD2) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od
ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (blízko TATA boxu)
TFIIA
- TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje TFIIDTFIIA-DNA
komplex na pol II (do jeho aktivního centra/cleft)
- Zn-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem
RNApol II
- B-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem, B-core/CTD1 s
wall, B-linker s CC clamp
- umístění TFIIB determinuje pozici počátku transkripce
- pozice B-reader (v RNA tunelu) limituje iniciační krok (12nt RNA)
- po dosažení 12nt RNA dochází k disociaci TFIIB (elongace…)
Video
ukázka RNA polymerásy
TFIIB propojuje RNApol II s již
sestaveným TBP/TFIID+TFIIA
(postupným odhalováním detailů struktur, mutagenezí
podjednotek, funkčními testy (in vitro a in vivo) byly identifikovány
všechny TFII a určeno pořadí jejich působení)
bez TFIID
He et al, Nature, 2013
- cryoEM komplexu
TBP(bez TFIID) + TFIIA
+ TFIIB + RNApol II
- po navázání pol II
disociuje TAF1/2 …
Rekonstrukce celého PIC
He et al, Nature, 2013
- biotin-DNA navázána na streptavidinové
kuličky – na DNA nachytány in vitro
sestavené komplexy – odštěpeno SalI a
cryoEM - postupně rekonstituován celý PIC
TBP(bez TFIID) + TFIIA
+ TFIIB + RNApol II + TFIIF + TFIIE + TFIIH
He et al, Nature, 2013
TFIIB
TBP
TFIIA
TFIIF
- TFIIF (navázaný na
pol II) stabilizuje DNA v
prohlubni/cleft pol II a
pomáhá TFIIB s
nastavením startu
(WHD z RAP30
podjednotky váže přímo
DNA: BREdownstream)
- váže TFIIE a pomáhá
tak stabilizaci komplexu
RNA pol II
Dimerizace WHD
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
- TFIIF (navázaný na
pol II) stabilzuje DNA v
prohlubni/cleft pol II a
pomáhá TFIIB s
nastavením startu
(WHD z RAP30
podjednotky váže přímo
BREdownstream)
- změna natočení
TFIIA-TFIIB-TBP-pol II
- TFIIF váže TFIIE a
pomáhá tak stabilizaci
komplexu
- tandem 4x WHD
uzamyká DNA v
RNApol II prohlubni
TFIIE
He et al, Nature, 2013
cleft
DNADNA
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
- TFIIH (10 podjednotek,
450KDa), podkomplex
CDK7-cyclin H-MAT1
fosforyluje pol II (Rpb1)
- XPB v kontaktu s DNA
rozvíjí dvoušroubovici
lidský PIC komplex
He et al, Nature, 2013
helikása
lešení/scaffold
- XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER)
- XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER)
Kompletní PIC i s TFIID komplexem Louder et al, Nature, 2016
TBP
TFIIB
Rpb4/7
TFIIA
RNA pol II
TFIIE TFIIH
Gibbons et al, PNAS, 2012
TFIIF
mediator
- celý mechanismus aktivace
transkripce od vazby aktivátoru …
uvolnění chromatinové struktury
… zahrnuje ještě další komplexy
(jako např. mediator)
Příště
Dr. Blažek:
Úloha Cdk
kinás v
regulaci
transkripce a
buněčného
cyklu
Thomas et al., CRiBMB, 2006
začátek transkripce - faktory
Dr. Špirek
Dr. Blažek
IFN-β enhanceosom
DNA není rovná volná kolej …,
ale obrovský nukleoproteinový
komplex
před i v průběhu transkripce
musí být proteiny (nukleosomy)
rozvolněny či odstraněny a poté
opět navázány
Agalioto et al, Cell, 2000
Panne, CO in SB, 2008
…rozbalování
nukleosomů
- v opačné pořadí lze nukleosom
rozbalit
- chaperony (ATP-dependent
remodelační “stroje”, „chaperony pro
komplexy“) pomáhají sbalit i rozbalit
nukleosomy
- histon chaperon komplex FACT (facilitates chromatin transcription) je
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
-rozeznává histon H2A-H2B heterodimer
(interferuje s vazbou na DNA
tzn. rozrušení vazby H2A-H2B s DNA)
FACT komplex
Hondele et al., Nature, 2013
Histonové H3-H4 chaperony
Ransometal,Cell,2010
- ASF1 (antisilencing function) – interferuje s tetramerizačním povrchem H3-H4
- CAF1 (chromatin assambly factor) – interferuje s vazbou H3-H4 k DNA)
Ransom et al, Cell, 2010
Histon chaperony - replikace
- procesy jako replikace, transkripce, oprava DNA vyžadují odstranění
nukleosomů (obsahují ssDNA) … a poté zase jejich nabalení … (feedback:
inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly nukleosomů)
250-300bp – cca nukleosom
H3K56Ac
Histon chaperony
- nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky
rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem
- acetylace K56 (šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší)
- pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí
remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován)
Ransom et al, Cell, 2010
- poškozená DNA signalizuje/spouští
„DNA damage checkpoint“ - kinasy
- H2A.X varianta je fosforylována (v
okolí poškození ~50kb během 15min;
H2A u kvasinek)
- H2A.Z varianta je zainkorporována v
okolí poškození (SWR a Chz1 –
remodelační komplexy) a pomáhá
resekci DNA
- po opravě poškození je γH2A.X
vyměněn FACT komplexem za
nefosforylovaný H2A.X (a H2A) …
- nefosforylovaný H2A.X je chráněn
před FACT ribosylací (PARP1)
Oprava poškozené
DNA – histonové
varianty
Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Histonové varianty
(u kvasinek γH2A
fosforylovaný H2A)
Mattiroli et al., EMBO Rep, 2015
Mattiroli et al., EMBO Rep, 2015
mají (mírně) odlišné vlastnosti
výsledný chromatin se liší od
„normálního“
Mattiroli et al., EMBO Rep, 2015
Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén.
(A) Typický chromozom vykazující doménové členění. (B) V kvasinkách
brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí…
(D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3.
Variantní histony
- CenH3/CENP-A … specificky v centromerách
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
(integrita centromer a telomer)
- možnost nově zabudovat histonové varianty pomocí chaperonů
a remodelačních komplexů
- nejznámější: CenH3/CENP-A (specificky v centromerách –
ukotvení kinetochor – klíčový pro segregaci chromosomu)
- H2A.X klíčový v opravě DNA
- H2A.Z v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
Figure 4-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
specifický chromatin s CENP-A histonem kotví kinetochory tah
mikrotubulů (a kohesiny) zajišťují správnou segregaci v
anafázi – CENP-A musí mít jiné vazebné schopnosti …
Repetitivní sekvence vytvářející
specifický chromatin – CENP-A
histon, který kotví kinetochoru
(kolem je pericentromerický
heterochromatin a SMC
komplexy)
tah mikrotubulů a kohesiny
zajišťují správnou segregaci v
anafázi
Centromery
- neodstraňují histony, ale pomáhají při výměně histonových variant (SWR)
nebo „sklouznutí“ (INO80, RSC) tj. remodelování nukleosomu
Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
Remodelační komplexy
Billon a Cote, BBA, 2012 Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
- SWR komplex specificky zaměňuje H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B
bromodoména
RSC remodelovací komplexSNAPSHOT,Cell(144),2011
RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
Gerhold a Gasser, TiCB, 2014
- RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí
nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a
posouvá se)
- nukleosom je zavěšen na SWR-C
komplexu – komplex váže ještě dimer,
který je schopen vyměnit
- nukleosom je uchopen INO80
komplexem (přes podobné složení
podjednotek – fungují odlišně)
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
Average human chromosome:
DNA molecule: ~4 cm
Mitotic chromosome ~4 µm
10 000x
Genome sizes:
human 3 billion bp 2 m
field bean 13 billion bp 9 m
trumpet lily 90 billion bp 60 m
salamander <120 billion bp 80 m
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- vytváří základní strukturu
- nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1)
- HMG, HP proteiny
- vytváří specializované domény
- centromery, telomery
- podílí se na dynamice struktury
- kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex
přednášky prof. Fajkuse:
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041)
Dynamika chromatinuDr. Grobsky
Figure 4-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
mitotický interfázní
Figure 4-72 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
- H2A, H2B, H3, H4 histony vytváří
nukleosomy = první úroveň
organizace
- histon H1 propojuje nukleosomy
….
- Jaké jsou další organizační
úrovně?
- SMC jsou nezbytné pro vytváření
chromatinových smyček
SMC6 SMC5
- SMC jsou nezbytné pro
vytváření chromatinových
smyček
- podílí se na regulaci
segregace chromosomů a
na opravě DSBs
- složení SMC komplexů
- dlouhá ramena SMC,
dimerizace přes hinge,
ATPase heads
přemostěny ATP a
kleisinovou podjednotkou
- SMC proteiny vytváří
kroužky, které drží DNA
Haering and Jessberger, Exp Cell Biol, 2012
Komplexy SMC
Složení:
SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony
non-SMC podjednotky (2 – 6)
Prokaryota Eukaryota (esenciální)
homodimer 2x
- nejlépe prostudovaný kohesin – objímá
DNA – pojme 2 vlákna (chromatinová
smyčka nebo sesterské chromatidy)
Haering a Gruber, Cell SnapShot, 2015
Bonora et al, CO in GD, 2014
Kohesin interaguje s CTCF …
- CTCF „izoluje“ transkripční
faktory a reguluje trankripci
- interaguje s kohesinem a podílí
se na utváření vyšších
chromatinových struktur
Carlsten et al., TiBS, 2013
… a kohesin interaguje s mediatorem
- mediator interaguje s GTFs a
RNA polymerázou
(zprostředkuje interakce mezi
GTFs a aktivátory transkripce)
- kohesin interaguje s
mediátorem a napomáhá tvorbě
transkripčních smyček
Bodnar & Spector, Cell, 2013
Phillips-Cremins et al, Cell, 2013
- kohesin se podílí na regulaci
„cell-specific“ transkripce a
chromatinové struktury (ukazuje
se jak úzký vztah mezi těmito
úrovněmi existuje)
- kombinace interakcí kohesinu s
CTCF a mediátorem jsou klíčové
pro „buněčnou specificitu“
Maeshima et al, Chromosoma, 2014
Chromatinové domény mají různou strukturu smyček a vláken
– lokalizace domén v prostoru jádra – ukotvení
(heterochromatinu v blízkosti membrány NP)
Kschonsak a Haering, BioEssays, 2015
Kondensin I „zužuje“ zatímco
komplex II kondensuje podélně
(osově)Hirano, CSHPB, 2015
Kondensin tvoří centrální osu (červená) – organizuje
nepravidelné smyčky chromatinových vláken
Woodcock a Ghosh, CSHPB, 2010
Zakari et al., WIREs Dev Biol, 2015
Yen et al., Cell, 2013
- na navlečení kohesinu na DNA a jeho
stabilizaci se podílí mnoho faktorů (loading
faktor NIPBL/MAU2, acetylace ESCO1)
- kohesin je odstraněn z ramen při
kondenzaci, ale na centromerách ho chrání
shugoshin
- v anafázi je otevřen separasou
Kohesin a SMC5/6 napomáhají při opravě dvou-řetězcových
zlomů v G2/M fázi (kohesin drží homologní sesterské chromatidy
při sobě – lepší HR)
Haering a Gruber, Cell SnapShot, 2015
Mannini et al, Hum Mut, 2013
Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012
mutace podjednotek kohesinu a jeho
regulačních faktorů způsobují
kohesinopatie (např. Cornelia de Lange
syndrom = transkripční defekt) a různé
typy nádorů (defekt segregační – 95%
nádorů je aneuploidních)