Mario Špír (office A7/305, lab. A7/323) JL CO) 1 RID 1 1 LABORATORY OF RECOMBINATION AND DNA REPAIR Proteinové komplexy v opravě poškozené DNA Poškodenie DNA Zdroje poškodenia: 1. endogénne - chyby pri replikácii DNA - bunkový metabolizmus (kyslíkové radikály) 2. exogénne - UV, rôntgenové a gamma žiarenie (ionizujúce žiarenie, rádioterapia) Wavelength (meters) 103 10-2 10"5 .5x106 10"8 10-10 10-12 ^XXVX\AA/WWW11I - mutagenně chemikálie (chemoterapia) vírusy Dôsledky neopravenej DNA exogenous endogenous aamage 0qO Metabolism aamag* repair Damage nuclear DNA \ unrepaired mitochondrial DNA unrepaireo Pathology cancer senesence apoptosis healthy cell rate or DNA damage = rate of repair up to 5O0.000 DNA modification events per cell per day diseased cell raxe or dna damage > rate of repair & Prometheus 2004 2i Aikyltransíerase Insertase Pyrimidine dinners UV Single and double x-rays strand breaks Alkylation Base damage DNA-protein crosslinks (P/-""^^ A DNA-DNA crosslinks: intrastrand interstrand DNA intercalation Depuri nation Mismatch repair defects (e.g., HNPCC) Excision repair ^ en2yme complex: J_ Glycosylases (base excision repair) Exonucleases Endonucleases Topoisomerases Polymerases Helicases (nucleotide excision repair) Xeroderma pigmentosum Btoom syndrome Cockayne syndrome AP endonuclease Mutácie ako zdroj rakoviny V prostredí bez mutagénov je pravdepodobnosť vzniku mutácie na bunkové delenie a gén 10~6, za život je to 1010 mutácií na gén mutácií: Génové (bodové) mutácie Chromozómové (štruktúrne aberácie) g 100 ti. 60 t> Výskyt rakoviny jako funkce věku 10 20 30 40 50 60 70 80| Věk v rocích Genómové (numerické aberáce chromozómov) © Espero Publishing, s.r.o. DNA opravné dráhy Direct reversals Excision repair - Base Excision Repair (BER) - Nucleotide Excision Repair (NER) Mismatch repair (MMR) - replication errors Recombinational repair (HR and NHEJ) - multiple pathways - double strand breaks and interstrand cross-links Tolerance mechanisms - lesion bypass (TLS) - recombination DNA-opravné proteínové komplexy Na opravu sú potrebné súčasne rôzne enzymatické aktivity Vzájomnou väzbou enzymaticky aktívnych a adaptorových proteínov vznikajú DNA-opravné komplexy špecifické k danému poškodeniu DNA Katalytické domény obsiahnuté v opravných komplexoch vedú k zvráteniu DNA poškodení Po oprave sa komplex opäť rozpadá na podjednotky Pri regulácii reverzibilnej formácie komplexov sú dôležité post-translačné modifikácie proteínov (fosforylácia, sumoylácia, ubikvitinácia,...). Enzýmy opravujúce DNA Glykozylázy Štiepia N-glykozidickú väzbu - odstraňujú poškodené bázy Nukleázy - exo / endo Štiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. Helikázy Odďelujú dve komplementárne vlákna DNA. Polymerázy DNA-dependentné nucleotidyltransferázy - Syntetizujú reťazec DNA z nukleotidov. Ligázy Katalyzujú tvorbu fosfodiesterových väzieb - spájajú dokopy dve vlákna DNA. Direct reversal priama oprava: fotoreaktivácia • Nedochádza k štiepeniu fosfodiesterových väzieb kostry DNA • Oprava pyrimidínových dimérov enzýmom fotolyázou s využitím energie svetla Pyrimidine dimer in UV-exposed DNA Complex of DNA with photoreactivating enzyme lAbsorption of light (>300 nm) Visible light light-harvesting kofaktory: FADH- (žltý) and 8-HDF (modrá) Release of enzyme to restore native DNA Base Excision Repair (BER) Opravuje menšie poškodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia). 1. Rozoznanie (DNAglykozylázy, OGG1) a odstránenie chybného miesta (Endonukleázy, APEX1 aAPEX2) 2. Procesing koncov DNA (polynucleotide kinase-phosphatase, PNKP) a vyplnenie medzery (polymeráza Pol (3) 3. Spojenie reťazcov DNA (DNA ligáza III) Kroky 2-3 sú takmer rovnaké u rôznych typov opráv, ale pri prvom kroku sa zúčastňujú špecifické protínové komplexy pre danú opravnú dráhu ó 6 6 6 6 A A A .< U M U U M U U M n n n n n n n n ř c c í o 0 C í : DAMAGE TO TOP STRAND u u u uTr u u y n n n n n n n n ) Q O O O O O O O EXCISION OF DAMAGED REGION 6 6 6 6 oooooooo step 3 DNA LIGASE SEALS NICK vet: t o o 5 : vuvu uvuvu uvuvu sn*nAnÄnAn6 ) O O O O O O 00 NET RESULT REPAIRED DNA Opravuje veľké poškodenia nukleotidov (UV žiarenie) 1. Rozpoznanie proteínovými faktormi 2. Vystrihnutie poškodeného miesta aj s okolím v oboch smeroch (nukleáza). 3. Rozmotanie DNA (DNA-helikáza) 4. Syntéza na základe komplementárneho vlákna 5. Spojenie DNA ligázou on Repair (B) NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR pyrimidine dimer CTACGGTCTACTATGG au n MMMbMbPhb žŠUUU h LJ a a GAT C T A^ G C C A G A T JUCLEASE r /\ CGGTCTAc f T A C C H T G^G nun nnM nWWBnB isfíi GATGCCAGATGATACC DNA HELICASE C G G T C T A c\ A T G tut GATGCCAGATGATACC DNA helix with 12-nucleotide gap DNA POLYMERASE PLUS DNA LIGASE CTACGGTCTAĽ I A T G G SSSoSHIBIlnMaSS GATGCCAGATGATACC Opravuje väčšie jednoreťazcové poškodenia (pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky v DNA helixe) 5' GGR Á Transcription RNA Pol II 3' Damage recognition Rad7/16 Damage recognition Helix opening, lesion verification, 5'-3' dual incision Gap-filling DNA synthesis Oligonucleotide excision Ligation Upravené z Tatum & Li, 2011 NER u kvasiniek: A, globálna genomická (GG-NER) B, Transkripčne-spriahnutá (TC-NER). 1. Rozpoznanie poškodenia GG í TC 2. TFIIH rozpletie DNA (helikáza) 3. Rad2 (XPG u ľudí) štiepi DNA na 3 ' konci poškodenia, 5 ' koniec rozštiepi Rad1-Rad10 (XPF-ERCC1) komplex (endonukleázy). —> Dvojité štiepenie uvolní krátky jednovláknový úsek (25-30 nt) DNA na ktorom sa poškodenie nachádza 4. DNA polymeráza (ó alebo £) dosyntetizuje chýbajúcu sekvenciu 5. DNA ligáza Cdc9 (Ligase-I) spojí DNA. Poruchy NER u ľudí Xeroderma Pigmentosum • Výskyt: 1-4 na milión • Genetika: autozomalne recesívne (XPA-G) • Nemoc: nemoci kože; malignancia kože; neurologické a abnormality očí Cockayne's Syndrome 1 na milión autozomalne recesívne, gény (XPA, B, D & G) Zastavený rast, mentálne retardácia, dwarfism, hluchota, atrofie očí, intracranial calcifications; (bez zvýšenia vzniku rakovin) Trichothiodystrophy 1-2 na milión autozomalne recesívne, (TTDA, XPB a D) sulfur deficient brittle hair, mental and spomalenie rastu, peculiar face with receding chin, ichthyosis; (bez zvýšenia vzniku rakovin) Oprava chybného zaradenia báz Mismatch repair (MMR) Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^H a novo S^^^^^^^^^n^B^^^^^^^^^B nasyntetyzované vlákno DNA a špecificky ^^^^^^^^_^^^^^^^^^^^^^M opravuje chyby v dcérskom vlákne. 1. Bakteriálne MutS homológy (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste poškodenia 2. MutL homológy (Mlh1/Pms2) sa viažu na MutS homológy a štiepia dcérske vlákno (MutH endonukleáza u bakterií) 3. DNA helikáza rozpletie vlákna 4. Exonukleáza (Exo1, ... ?) rozštiepi dcérske vlákno 5. Vyštiepená DNA je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou a pripojená DNA ligázou. Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Oprava dvojreťazcových zlomov Vznik: Indukované radiáciou a chemikáliami Počas replikácie poškodenej DNA Slúži k iniciácii meiotickejrekombinácie Súčasť imunitnej odpovedi Dvojreťazcové zlomy DNA sú veľmi závažným druhom poškodenia - jediný DSB môže viesť k smrti bunky alebo preusporiadaniu genómu. Základné DSB-opravné dráhy: Homologická rekombinácia (HR) Väčšinou nevedie k chybám a na opravu používa homologickú sekvenciu ako templát. Je dominantná v S a G2 fáze (sesterská chromatída), u diploidov (homologický chromozóm). Nehomologické spájanie koncov (NHEJ) Priamo spája zlomené konce dokopy, často vedie k strate genetickej informácie. Dôležitá hlavne v G1 fáze u haploidov. Nehomologické spájanie koncov Non-homologous end joining (NHEJ) 1. Väzba MRX (Mrel 1 -Rad50-Xrs2 (NBS1 u ľudí)) komplexu, Ku heterodiméru (Yku70-Yku80) na zlomené konce DNA 2. Privolanie DNA ligázy IV (Dnl4) a jej pomocných proteínov Lif 1 a Nej1. 3. Hľadanie komplementarity medzi prevismi dvoch koncov DNA. 4. Úprava koncov - syntéza DNA (Pol4 DNA polymeráza) 5. Religácia koncov pri oprave nekompatibilných koncov väčšinou dochádza k deléciám alebo inzerciám, vznikajú chyby -error prone Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1) komplex (MRX, MRN) : heterohexamer • Červené trojuholníky predstavujú miesta mutácií spojených s ľudskými chorobami • M - metylácie • P - DNA poškodením indukované fosforylácie (A) Hook (B) Mre11«| Flexible adapter Head Nbs1 Capping domain Phosphoesterase N117S W210C Rad50 M P Mre11 Rad50ATPNasc ^ Nbs1 • FHA iBRCT1.BRCT2 Zn Hook F Mre11 i a ATPase -C A K1Cy^X X1313Y Mre11 ATM Williams era/., DAM flepa/r, 2010 u Minus ATP j, Plus ATP -|—» a ■ ■ i J^-m 1—» i íl tm 1 Po naviazaní ATP dochádza k dimerizácii ATPzových domén Rad50 a následnej zmene z otvoreného komplexu na zatvorený Homologická rekombinácia 1. MRX sa viaže na zlomené konce DNA. 2. Nukleolytická degradácii 5' reťazcov. 3. Väzba RPA na 3' jednovláknové konce 4. Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5. Rad51 -filament hľadá homologickú DNA (Rad54). 6. Tvorba D-loopu 7. Predĺženie 3 ' konca filamentu (DNA polymeráza ó) • SDSA (synthesis dependent strand annealing)- novo nasyntetizované 3 ' vlákno je vytlačené z D-loopu (Srs2 a Mph1 helikázy) a nasadne naspat' na druhý koniec dvojvláknového zlomu (Rad52). Následuje syntéza DNA (Pol 5) a ligácia. • DSBR (double strand break repair) - tvorba double Holliday Junction - rozrušený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozštiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1-Rad10, Yen1). DSB ecBCD komolex - baktérie 5' cnannel to RecD \* RecB-f b rdhg cavity |3'channel to nuclease Singleton etal., Nature, 2004 u baktérií spracováva konce dvojvláknového zlomu v DNA Helikázovou aktivitou rozplieta dvojvláknovú DNA Nukleázovou aktivitou vlákna štiepi Stimuluje väzbu RecA rekombinázy na 3 ' jednovláknovú DNA Single strand annealing • Single-strand annealing (SSA) prebieha ak dôjde k zlomu v mieste dlhších repetícií DNA (rDNA) 1. Resekcia 5' vlákna na koncoch zlomenej DNA ako u HR. 2. Priame nasadnutie jednovláknových 3' reťazcov, (Rad52 a Rad59) 3. Nehomologické sekvencie na koncoch sú odstránené Rad1-Rad10 endonukleázou -NER. Štiepenie je stimulované MMR proteínmi Msh2-Msh3. 4. Syntéza DNA a ligácia. SSA vždy vedie k delécii DNA sekvencie ohraničenej repetíciou - je mutagénna. Upravené z Altmannová etal., Biomolecules, 2012 Translézna DNA syntéza Translesion synthesis (TLS) • Proces umožňujúci toleranciu poškodenej DNA. • Postupujúca replikačná vydlica narazí na neopraviteľné poškodenie DNA Dlhodobé zablokovanie replikačnej vidlice vedie k smrti bunky. Replikácia poškodenej DNA vytvorí sesterskú chromatídu ktorá môže byť využitá ako templát pre opravu HR. Štandardné DNA polymerázy (ó, £) sú nahradené transléznymi polymerázami, ktoré vedia vložiť bázy aj oproti poškodeným nukleotidom (pyrimidínové diméry, abázické miesto, oxidovaná, deaminovaná báza). Niektoré TLS polymerázy zaraďujú správne bázy oproti špecifickým poškodeniam (Pol q), iné často zaraďujú nesprávne bázy (^ Rev1). David Kowalski Poškodenie DNA indukuje sumoyláciu DNA-opravných proteínov Sumoylation Targets among Proteins Involved in DNA Replication. Repair, and the DNA Damage Response That Were Identified in This Study Process Sumoylated Proteins Replication Dpbll. Mcm2.Afo»4, Mcm5. Mcm6. MgsL Orel, Orc4, Oreo, Pift, Poll, Pol2, Pol 12, Pol32. Pnl, Pri2, Rad27. Rfc2. Rfc3, Rttl07, Slx4 fAbfl, Orc3. Pob3. Rfcl, Tof2. Topi, Topi) Re combinational repair Mreli. Pso2. Rad50, Sae2, Sawl, Sine 6, XrsZ Yeul (Rad52, Rad59, Rfal, Rň2, Sqsl, Smc5, Srs2) NHEJ Li/1 (Yku70, YkuSff) Postreplicative repair Rad5 (Pol30) Base excision repair Apttl, Magi, Oggl (Ntgl) Nucleotide excision repair Radl, Rn2(Radio) Mismatch repair MĽiL Msh3. Msh6, Pmsl Checkpoint signaling DdcL Bmil Proterns that were previously found to be sumoylated are in parentheses. Italic: sumoylation is induced by MMS. Bold: human homologs are sumoylated (Golebiowski et at. 2009). Underline: phosphorylated by checkpornt kinases (See Table SI). Note that several proterns function in multiple processes but are assigned to one category for simplicity. Cremona etal., Mol. Cell., 2012 SUMO stabilizuje DNA-opravné komplexy (HR) Následný rozpad komplexov stabilizovaných pomocou SUMO-SIM interakcií Regulácia tvorby DNA opravných komplexov pomocou PTMs posttranslačných modifikácií proteínov Nakladá DNA polymerázu na DNA a viaže ďalšie proteíny pri DNA oprave a replikácii Metódy štúdia DNA opravných mechanizmov Genetická analýza mutantov a ich vzťahov Analýza citlivosti mutantov na látky spôsobujúce špecifické poškodenie DNA Eseje využívajúce úpravu DNA Fluorescenčná mikroskopia MreH-TFF RHa1-CFP nwrae DIC - analýza (ko)lokalizácie DNA opravných proteínov v bunke, ich časovej následnosti Metódy štúdia DNA opravných mechanizmov in vitro metódy _ Analýza biochemickej aktivity Väzba na DNA Nukleázová esej Helikázová esej Polymerázová esej Rekonštrukcia opravných mechanizmov Elektrónová mikroskopia 7.5 15 30 60 - - - - Srs2 (nM) - - - - 7.5 15 30 60 SUMO-Srs2 (nM) ■var 4i . Srs2 SUMO-Srs2 20 40 Srs2 [nM] Kolesár, unpublished Krejci etal., Nature, 2003 Prečo študujeme ľudské rekombinázy? Table 2. List of" diseases linked to or associated with either recombination mediators or their interacting partners, synthetic lethality interactions are also shown (216,291,292) Genes Synd r ome s.'d i s orders í. 'íincei's Synthetic lethality BRCAJ BRCA2 RAD54B RAD5IB RAD5IC BLM WRN RECQL4 p53 FANCM PALB2 Fanconi anaemia (FAN CD J) Fanconi anaemia (FANCO) Bloom Werner Rot h in und-Tli om s on Li-Fraumeni Fanconi anaemia (FANCM) Fanconi anaemia (FANCN) Potential associations with diseases RAD5J DMCJ Infertility XRCC2 XRCC3 RAD5ID DSSl Split hand/split toot malformation Breast, prostate, ovarian cancer Breast, prostate, ovarian cancer Colon cancer, non-Hodgkin lymphoma Lipoma, uterine leiomyoma Breast, ovarian cancer Breast, pancreatic, lung cancer, etc. Breast, pancreatic cancer Breast cancer in BRCAJ and BRCA2 carriers Breast cancer Basal cell carcinoma, malignant melanoma, bladder cancer, breast cancer Breast cancer Skin squamous cell carcinoma PAR P J PARP1, RAD52 PARPI, FEM PAR PI RAD52 EMSA of RAD-51-ssDNA complexes ± RFS-1-RIP-1 Mg-ATP Mg-AMPPNP qK) rO rO qO ^ 05 05 ^ 0, ^ ^ ^ ^ ^ [RAD-51](nM) (.05 <£5 <£5 <£5 05 05 V5

05 [RFS-1-RIP-1] (nM) 0 0.4 5 11 13 21 4 0 0.5 34 46 57 85 27 % bound Mg-ADP No nucleotide + EDTA 05 05 c?> c?> 05 o? c? 05 9r ^ o? c? O? [RAD-51] (nM) 05 05 v>

05 05 ^ 05 ^ 05 [RFS-1-RIP-1] (nM) ••••• 0 0.3 7 9 18 31 11 0 0.3 41 15 11 11 36 % bound For a fixed concentration of RAD-51 in the presence of nucleotide and magnesium, more molecules of radiolabeled DNA display retarded migration due to the formation of DNA-protein complexes in the presence of RFS-1-RIP-1. © M. Taylor RFS-1-RIP-1 stimulates RAD-51 recombinase activity Preliminary EM data suggest that RFS-1-RIP-1 complex remodels the Rad51 filaments to shorter ones