Strukturní biologie + signalizace Jaromír MAREK, Centrum strukturní biologie, CEITEC MU Obsah •Přenos signálu •G-proteiny a GPCR •Fosforylace •Signální dráhy Přenos signálu •Strukturovaný a diferencovaný systém •Přenos informace „na dálku“ •Přenos „přes rozhraní“ •Konverze signálu •Specifický/modulovaný přenos • •Nosič signálu (molekula) •Vysílač + přijímač, vypínač/přepínač • • • 15_3 15_3 Receptory signálu •Přenos informace přes membránu • •Receptory spojené s G proteiny •Receptory-membránové kanály •Katalytické receptory • 15_7 Přenos signálu GPCR •G-proteiny (guanine nucleotide-binding proteins) – molekulární přepínače •Alfred G. Gilman + Martin Rodbell (N.C. – fyziologie - 1994) •Externí signál řídí funkci = konverzi GTP na GDP • • • • • •Aktivace G-proteinů – pomocí integrálních membránových receptorů GPCR (G protein-coupled receptor) •Brian Kobilka + Robert Lefkowitz (N.C. – chemie - 2012) 500px-Guanosintriphosphat_protoniert 500px-Guanosindiphosphat_protoniert GPCR signální dráhy •Široké spektrum přenášených signálů (sensorické dráhy, hormony, neurotransmitery, …) •Receptor serotoninu (přenašeč nervových vzruchů), opinoudů, histaminu, … •Vlastní objev G-Proteinů – reakční dráha adrenalinu •Háďátko (Caenorhabditis elegans) – 5%DNA jsou GPCR •Lidský genom - přinejmenším 800 GPCR (~ 4% DNA kódující proteiny), +200 (2012) se známou funkcí • Rhodopsin GPCR - struktura •Rhodopsin (oční pigment, objev Franz Christian Boll - 1876) •Vzruch = fotony -> strukturní změna (cis -> trans) v retinalu (vitamín A) • • • • • • • • • •George Wald (N.C. – fyziologie - 1967) RetinalCisandTrans Sekundární struktura GPCR G-proteiny a strukturní biologie GP-schema G-proteiny a strukturní biologie C:\Users\Jushisa\Desktop\nrm2299-f1.jpg Beta2Receptor-with-Gs Popis atomárních detailů GPCR – krystalografie, kryoEM Etapy určování (bio)struktur 1.Výběr genu 2.Příprava rekombinantního proteinu, čištění, zahušťování… 3.Krystalizace 4.Difrakční experiment 5.Fázový problém + příprava modelu 6.Zpřesňování modelu 7.Publikace/užití výsledku 373px-X_ray_diffraction 1. Výběr genu GP-gen 2. Příprava studovaného materiálu GP-purifikace 2.a Nekrystalografické výzkumy (integrovaná strukturní biologie) •NMR •EPR •Fluorescence •Metody výpočetní chemie •… GP-nonPX 3. Krystalografie membránových proteinů membran-proteiny_structures_2012 3-4. Krystalizace + difrakční experiment GP-krystaly 3. Krystalizace ideálního protein. komplexu GP-krystaly-teorie 3. Krystalizace reálného protein. komplexu GP-krystaly-realita 3. Krystalizace membránového komplexu GP-krystaly-membrana První RTG struktury GPCR GPCR-struktury-2007 Sekundární struktura GPCR •7 a-šroubovic •nízká 1D homogie • •Flexibilní struktura GPCR_activation GP-GCRP G-proteiny a strukturní biologie GP-schema G-proteiny a strukturní biologie GPCR-struktury-2007-schema G-proteiny a strukturní biologie GPCR-struktury-2012-schema Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – problémy/řešení Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – kryoEM GP-cryoEM Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – RTG /atom. rozlišení GP-neaktiv-vs-aktiv GPCR-cyklus G-proteiny •GTP fosfohydrolázy •Heterotrimer/heterodimer • abg, bg komplex Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – RTG /atom. rozlišení komplex-neaktiv Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – RTG /atom. rozlišení komplex-aktiv Strukturní charakterizace flexibilního komplexu – RTG /atom. rozlišení komplex-aktiv-neaktiv 1024px-Adenylate_kinase Aktivace enzymů AC –adenyl cykláza cAMP – cyklický AMP (+vypnutí = PDE, fosfodiesteráza) 645px-Activatoin-Adenylate_cyclase-outlined Regulace iontových kanálů GPGIC_schematic Fosforylace •Posttranslační modifikace proteinové struktury •30% proteinů může být modifikováno •Reverzibilní fosforylace - Edmond Fischer and Edwin Krebs (N.C. – fyziologie - 1994) •Kovalentní vazba fosfátu na O-H (Ser, Thr, Tyr) •Kovalentní vazba fosfátu na N-H (His) •Kinázy/fosfatázy • • • • • •Lidský genom ~ 500 kináz HK_mechanism Dvoustupňová fosforylace two-step-his Kinázy •Modifikace (doménové/dimerické) struktury •Enzym – změna aktivity katalytické domény •Vazebné místo pro přenos signálu •Dimerní struktura • • 15_28 Transmembránové kinázy etylen-rec Model – nerealistické poměry velikostí protein:přenašeč, nerealisticky velké změny struktury (pákový přenos) Fosforylační kaskády 11-11-EnzymeCascade-L • modifikace + zesílení signálu • „Druhý posel“- Earl Wilbur Sutherland (N.C. – fyziologie - 1971) • Směšování a ovlivňování signál. drah 11-18-CellSignalSpecific-L 2 signály: kinázy a G-proteiny GP-kinases • „Druhý posel“ • cAMP-dependentní kináza • cAMP – cyklický AMP • cAMP - deaktivuje fosfodiesteráza • C – katalytická doména, R – přijímač Přenos signálu a centrální dogma 11-17-SignalGeneActivate-L dogma-struct-biol