Marek Adamus •Ubikvitony 30.3.2017 Opakování §dědičnost: §autosomální vs. gonosolmání, dominantní vs. recesivní §struktury proteinů §α-šroubovice / α-helix §β-skládaný list / β-sheet §fold – prostorové uspořádání, motiv Post-translační Modifikace Proteinů §(jen) eukaryotické buňky §mnohonásobné zvýšení variability proteinů a jejich komplexů §stabilizace, transport, lokalizace, aktivace... §fosforylace, glykosylace, acetylace, ubikvitinace... Proteome-Complexity-Figure-650px §ubique = všudypřítomný §A. Ciechanover, A. Hershko, a I. Rose – Nobelova cena 2004 §malý protein (8,5 kDa, 76 aminokyselin) §nachází se ve všech eukaryotických buňkách §vysoce konzervovaná primární struktura §vlastnosti: §flexibilní C-konec – – připojení na ε-aminoskupinu lysinu §lysiny v sekvenci ubikvitinu – – isopeptidová vazba •Ubikvitin ε §nevzniká samostatně, ale vždy jako fúzní / polyprotein §jsou známy 4 geny pro ubikvitin u lidí §ubikvitin-ribozomální protein (UbL40 a UbS27) §regulace množství ubikvitinu dle translační aktivity §polyubikvitin §odpověď na stresové podmínky •Exprese Ubikvitinu Herrmann et al., Circulation Research, 2007 Zajímavost: UbL40 u rýže – akumulace mRNA „defective pollen production and male sterility“ S27 – 40S subunit ribosomu L40 – 60S sub. •Ubikvitin •SUMO-1 •NEDD8 •Ubikviton §a covalently attachable or genetically built-in ubiquitin superfold Welchman et al., Nature Reviews, 2005 §ubikvitony – proteiny obsahující „β-grasp fold“ http://pre08.deviantart.net/7011/th/pre/i/2014/012/5/1/hand_holding_a_candle___precut_by_montvalent stock-d71w4ib.png •Hochstrasser, 2009 •Ponder et al., 2007 •Ubikvitony Modifier Identity (%) E1a E2a Comments Ubiquitin 100 Uba1& Uba6 many Protein degradation, histone regulation NEDD8 55 Uba3-Ula1 Ubc12 Substrates: cullins, p53 SUMO1–4 18 Uba2-Aos1 Ubc9 Transcriptional regulation, protein localization Urm1 ND Uba4 – Related to MoaD, ThiS; β-grasp fold ISG15 32/37 Ube1L UbcH8 Interferon response UFM1 ND Uba5 Ufc1 β-grasp fold FUBI/MNSFβ 38 – – Derived from ribosomal protein precursor FAT10 32/40 Uba6 – Ubiquitin-independent degradation Ubl-1 40 – – Nematode ribosomal protein precursor BUBL1, 2 variable (up to 80%) – – Putative autoprocessed proteins (ciliates) •Woelk et al., 2007 •Lidé: • §E1 – 2 enzymy (UBA1, UBA6) § § §E2 – 35 § § §E3 – 600 - 1000 • • •Konjugace Ubikvitinu §regulace na několika úrovních E1 ubikvitin aktivujici E2 ubikvitin konjugujici / prenasejici E3 ubikvitin ligujici / ligasa •Konjugace Ubikvitinu – E1 a E2 •A: aktivace ubikvitonu •B: přesun ubikvitonu na Cys v aktivním místě E1 •C: vazba dalšího aktivovaného ubikvitonu •D: přesun z Cys E1 na Cys E2 •Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 §E3 ubikvitin ligasy specificky rozeznávájí koncové proteiny §vazebná místa pro E2 a protein • •2 hlavní třídy: §RING (Really Interesting New Gene) E3 ligasy (až 95%) §HECT (Homologous to E6-AP Carboxy Terminus) E3 ligasy § •Konjugace Ubikvitinu – E3 •E2-Ub → E3-Ub → Protein-Ub •E2-Ub → Protein-Ub •Rotin & Kumar, 2009 Koncove proteiny = specificky konecny substrat ubikvitinace •RING E3 Ligasy •Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009 §složené RING E3 ligasy §tvořené několika modulárními podjednotkami §tzv. cullin-RING E3 – RING box protein (RBX1 a 2) + Cullin + substrát rozeznávající proteiny § •RING E3 Ligasy •Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009 §obsahují RING ( RING finger) doménu §6 – 7 Cys a 1 – 2 His koordinuje 2 Zn2+ §RING doména se váže s E2 •2 velké podskupiny: §jednoduché RING E3 ligasy §RING doména a substrát vazebná doména se nachází na stejném polypetidu •Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 •Jednoduché RING E3 Ligasy §p53 (TP53) – „strážce genomu“ §odpověď buňky na stres – zastavení buněčného cyklu, indukce apoptosy §přes 50 % známých typů rakovin má defekt ve funkci p53 §MDM2 (Mouse Double Minute 2 homolog) – E3 ligasa §hlavní regulační prvek stresové odpovědi mediované p53 §p53 indukuje expresi MDM2 → MDM2 inhibuje expresi p53 §fyzické nasednutí na DNA a inhibice transkripce §podpora transportu p53 z jádra §ubikvitinace p53 – indukce degradace §Deaktivace MDM2 – cílená léčba aktivací p53 a následně apoptosy §Nutlin, RITA, PRIMA-1 (II. fáze klinických testů – 2012) •Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Nutlin rita prima jsou male molekuly, vazou se do aktivniho mista pro ubi u mdm2 (nutlin, rita na akceptorove místo u p53), nebo nejakym zpusobem podporují stabilitu p53 (prima). •Cullin-RING E3 Ligasy §E3 ubikvitin ligasovy komplex §Culliny §hydrofóbní proteiny §tvoří lešení pro další podjednotky §je známo 7 cullin proteinů u člověka §RING box protein §RBX1 a RBX2 §substrát specifické proteiny •Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009 •Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 •Cullin-RING E3 Ligasy §APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) – E3 ligasa §komplex složený z (asi) 12 podjednotek a několika koaktivátorů – 1,5 MDa §obsahuje cullin podjednotku (Apc2) a RING podjednotku (Apc11) §pro vazbu substrátu nezbytné koaktivátory Cdc20 a Cdh1 §nezbytný pro správný průběh buněčného cyklu, rozdělení sesterských chromatid v anafázi… §ubikvitinace securinu → aktivace separasy → štěpení kohezinu → rozdělení sesterských chromatid k opačným pólům buňky The anaphase promoting complex/cyclosome: a machine designed to destroy •Peters, Nature Reviews, 2006 •U-Box E3 Ligasy §strukturní motiv podobný RING schopný vázat E2 ligasy §konformace založena na vodíkových můstcích, neváže Zn2+ §CHIP (C terminus of HSC70-Interacting Protein) / STUB1 (STIP1 homology and U-Box containing protein 1) §rozeznává HSP70 a HSC70 §ubikvitinuje nesprávně složené proteiny → degradace §asociace s parkinem – podporuje jeho ubikvitinační aktivitu §disfunkce CHIP spojená s ataxií – porucha koordinace pohybů § §Cystická Fibróza – degradace nesprávně složeného CFTR §CFTR – chloridový ABC transportér (česky: transmembránový regulátor vodivosti J ) §U-box (zelená) §RING (fialová) •Ohi et al., Nature Structure Biology, 2003 •HECT E3 Ligasy §HECT (Homologous to E6-AP Carboxy Terminus) §zhruba 28 HECT E3 u člověka §HECT doména se skládá ze 350 aminokyselin u C-konce prot. §obsahuje katalytický Cys → vazba ubikvitinu § E2 ligasa HECT s kat. Cys ohybová doména •Rotin & Kumar, 2009 •HECT E3 Ligasy §E6-AP ubikvitin ligasa §rakovina děložního čípku §HPV (Human PapillomaVirus) nese gen pro protein E6 §E6 je exprimován v hostitelské buňce a váže se na E6-AP §E6-AP ubikvitinuje p53 a napomáhá vzniku rakoviny § § §Angelmanův syndrom §exprese E6-AP není rovnocenná – varianta genu zděděná po linii otce je umlčována §v mozku je exprimována převážně matčina alela §mutace genu vedoucí k nefunkčnímu proteinu → syndrom §poruchy vývoje intelektu, epileptické záchvaty, záchvaty smíchu https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/24/Giovanni_Francesco_Caroto_001.jpg/800px-G iovanni_Francesco_Caroto_001.jpg Giovanni Francesco Caroto (1480 – 1555 /1558) •Varianty Ubikvitinací §polyubikvitinové řetězce – běžnější oproti monoubikvitinacím §ubikvitin – 7 lysinů a C-konec pro připojení dalšího ubikvitinu •Komander, Biochemical Society Transactions, 2009 •Varianty Ubikvitinací •Komander, 2009 •Husnjak & Dikic, Annual Review of Biochemistry, 2012 •Varianty Ubikvitinací §Uzavřená konformace §Otevřená konformace •Důsledek Připojení Ubikvitinu §připojení ubikvitinu přes flexibilní C-konec §neovlivňuje (většinou) konjugovaný protein přímo •→ slouží jako povrch pro protein-proteinové interakce § interakční partner obsahuje UBD (Ubiquitin Binding Domain) §je známo 20 rodin s rozdílnou topologií UBD místa §ubikvitin obsahuje hydrofobní místo kolem Ile46 → vazebné místo pro UBD (zvažováno i Ile36, Leu8, Val70) § •Bishop et al., EMBO J, 2010 •Degradace Proteinů v 26S Proteasomu §velký (2 MDa) multiproteinový komplex – až 60 podjednotek) §hlavní dráha pro specifickou degradaci proteinů §odstranění proteinů konjugovaných s Lys48 ubikvitinovým řetězcem §rozeznáván je řetězec 4 a více ubikvitinů § §skládá ze 2 subkomplexů: • § § § 20S 19S 19S •20S centrální subkomplex §tvar soudku s katalytickým místem uvnitř §Tvořen 4 kroužky ze 7 podjednotek v uspořádání α7β7β7α7 §proteolytické pouze β1,2 a 5 •19S regulační subkomplex §skládá se z nejméně 18 podjednotek, které tvoří víko a základnu (bázi) §báze – hexamer ATPáz → rozmotávání 3D struktury peptidu za spotřeby ATP §víko – váže a odštěpuje ubikvitin z proteinu § •Lasker et al., PNAS, 2012 [USEMAP] •http://pdb101.rcsb.org/motm/166 víko báze α kroužek β kroužky •http://www.bostonbiochem.com/products/proteasome •Architektura 26S Proteasomu 20S 19S 19S α kroužek báze víko •Průběh Degradace 1.protein určený k degradaci je označen K48 typem ubikvitinace 2.ubikvitinový K48 řetězec je rozeznán proteasomem 26S §jsou rozeznávány řetězce o délce 4 a více ubikvitinů 3. ATPasy v 19S podjednotce postupně rozruší prostorové uspořádání proteinu 4.(částečně) linearizovaný protein vstupuje do 20S podjednotky 5.celkem 6 míst s proteolytickou aktivitou štěpí protein §specifické štěpení za hydrofobní, kyselou a bazickou aminokyselinou §v aktivním místě obsahují Thr (nukleofilní atak) 6.vznikají nejčastěji 7-9 aminokyselin dlouhé peptidy, které jsou po uvolnění dále štěpeny v cytosolu na jednotlivé aminokyseliny 7.ubikvitin je před vstupem do 20S odštěpován a recyklován – 8. [USEMAP] Bhattacharyya et al., Nature Reviews, 2014 https://www.youtube.com/watch?v=4DMqnfrzpKg •Imunoproteasom §speciální typ proteasomu – odlišný typ proteolytických 20S β podjednotek §výsledkem štěpení jsou delší peptidy vhodné pro imunitní odpověď §peptidy jsou prezentovány na povrchu buňky vázané v rámci MHC třídy I (major histocompatibility complex) §MHC I jsou rozeznávány cytotoxickými T-lymfocyty Miller et al., Current Cancer Drug Targets, 2016 http://www.eurekaselect.com/images/graphical-abstract/ccdt/14/6/0005U.jpg §11S podjednotka – vazba místo 19S podjednotky (víko) §navození konformační změny β1, β2, and β5 have been classified as caspase-like, trypsin-like, and chymotrypsin-like for cleavage after acidic, basic, and hydrophobic amino acids Nova β1i nestepi za acidic ale taky za hydrophylic -> na C konci pro prezentaci pro T bunky je třeba hydrofobni int. NK – ihibuji se vazbou na MHC – když není, tak degradace bunky •Nemoci Spojené s Proteasomem §Parkinsonova choroba 1.juvenilní typ §autosomálně recesivní forma Parkinsonovy choroby §mutace v genu PARK2 vede k neaktivní formě parkinu (součást E3) → nedochází k degradaci cílových substrátů proteasomem §kumulace těchto proteinů vede k apoptóze neuronů syntetizujících dopamin 2.spojená s Lewyho tělísky §autosomálně dominantní forma PC §mutace / multiplikace genu SNCA pro α-synuclein → nesprávná degradace / zvýšená koncentrace vede k inhibici 26S proteasomu §Lewyho tělíska – shluky konjugovaného α-synucleinu uvnitř neuronů §Lewy Body Dementia §podobné PC, postiženy jsou neurony produkující acetylcholin § •Přehled K48 Ubikvitinace §degradace proteinů pomocí konjugace s ubikvitinem u člověka KEGG pathways, 2016 •Ubikvitinace K63 §nevedou nutně k degradaci proteinu §NF-κB (nuclear factor kappa-B) §regulace odpovědi na buněčný stres, podíl na produkci imunoglobulinů §velmi konzervovaná signalizační dráha §NF-κB se zkládá z podjednotek p50, p65 a inhibiční IκB 1.IκB kinasa (IKK) je ubikvitinována K63 řetězcem 2.na ubikvitin nasedá kinasa a fosforyluje β podjednotku IKK 3.fosforylovaná β IKK je monoubikvitována 4.tím dochází k aktivaci IKK a fosforylaci IκB 5.fosforylovaná IκB je ubikvitinována K48 řetězcem a degradována v proteasomu 6.NF-κB se váže na promotory pro RNA polymerasu a pomáhá indukovat transkripci 7. IκB je rovněž indukována, což vede k následné inhibici NF-κB §zajímavost: HIV nese ve své sekvenci místa pro nasedání NF-κB •SUMO §small ubiquitin-like modifier §malý protein (12 kDa, 100 aminokyselin), u člověka 4 varianty – SUMO-1,2,3,4 §SUMO-1 netvoří řetězce a konjuguje s proteiny za fyziologických podmínek §SUMO-2,3 konjuguje za stresových podmínek §SUMO-2,3 sekvenčně podobné, SUMO-4 téměř výhradně v ledvinách §průběh sumoylace je podobný ubikvitinaci (E1 → E2 → E3 → protein) •Wilkinson & Henley, Biochemical J., 2010 •… •SUMO §konsenzuální sekvence pro SUMO-2,3 ψKxD/E •hydrofóbní aminokyselina (Val, Leu, Ile ,Phe, Tyr, Trp) •SUMO lysin •jakákoli aminokyselina •asparagová / glutamová kyselina §SUMO interaguje se SIM (SUMO-interacting motif) §SIM je méně konzervovaný – 3-4 hydrofobní aminokyseliny následuje blízká, záporně nabitá oblast (Asp, Glu; fosforylovaný Ser, Thr) §SUMO může stericky bránit interakci, působit jako interakční povrch, působit jako induktor interakce •Sumoylace Komplexu MCM §MCM (minichromosome maintenance complex) - podjednotky Mcm2-7 § součástí helikasového podkomplexu, který je součástí replisomu §MCM nasedá na DNA (na „počátek replikace“) → dochází k fosforylaci Mcm4 → vazba dalších 2 kofaktorů Cdc45 a GINS a vznik CMG replisomové helikasy §po nasednutí DNA může být MCM sumoylován → nedochází k fosforylaci → ochrana před předčasným rozplétáním DNA §desumoylací MCM může dojít k fosforylaci a sestavení CMG § § •MCM •GINS •Cdc45 •SUMO •fosfát •1. •2. •CMG The name GINS is an acronym created from the first letters of the Japanese numbers 5-1-2-3 (go-ichi-ni-san) in a reference to the 4 protein subunits of the complex: Slf5, Psf1, Psf2, and Psf3. •Sumoylace PML jaderných tělísek §jaderná tělíska – malé kruhovité útvary v jádře buněk §důležité pro regulaci transkripce, senescence, virové odpovědi, reakce na stres §PML (promyelocytic leukemia) protein – obsahuje SIM motiv a SUMO lysiny §PML protein tvoří homodimer, který agreguje sumoylací a interakcí se SIM §tato síť následně skrze SIM interaguje s další řadou proteinů § §akutní promyeloidní leukémie §zapříčiněna z 98 % fúzí PML-RARA (retinoic acid receptor alpha) §léčba As2O3 – arsen indukuje tvorbu disulfidických můstků a zesíťování PML-RARA §SUMO dependentní ubikvitin ligasa rozezná sumoylace jako signál k degradaci §dochází k ubikvitinaci a degradaci proteasomem •Matunis et al., Developmental Cell, 2006 One hypothesized function of the dots is as a 'nuclear dump' or 'storage depot'. §proteiny mohou být modifikovány SUMO nebo ubikvitinem, případně obojím §připojení SUMO a ubikvitinu mívá odlišný efekt §SUMO může s ubikvitinem soutěžit o Lys •Srovnání SUMO a Ubikvitinu •NEDD8 §NEDD8 (Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 8) §81 aminokyselin, 9 kDa, 60 % sekvenční podobnost s ubikvitinem §nezbytný pro většinu cullin RING E3 ligas §váže se na cullinové jádro, čímž umožní interakci s E2 §neddylace probíhá téměř analogicky k ubikvitinaci – před konjugací dochází k maturaci NEDD8 odštěpením 5 aminokyselin od C-konce proteinu • http://www.bioon.com/3g/id/577000/ •ISG15 §ISG15 (Interferon stimulated gene 15) §165 aminokyselin, 17 kDa, 2 domény, 29 a 31 % sekvenční podobnost s ubikvitinem §přítomný pouze u vyšších eukaryot §u člověka podobně jako NEDD8 přítomen v cytoplasmě v neaktivní formě, maturace odstraněním krátkého úseku na C-konci proteinu §například ryby mají pouze aktivní formu §exprese indukována interferony, součástí dráhy odpovědi na virové infekce https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e6/Protein_ISG15_PDB_1z2m.png PDB: 1Z2M •Ubikvitin D §Ubikvitin D (FAT10) §podobný ISG15 – obsahuje 2 domény spojené linkerem §není podrobně prozkoumaný §společně s NUB1L (NEDD8 ultimate buster 1-long) je schopen vyvolat degradaci proteinu v 26S proteasomu §pravděpodobně funguje v opozici k neddylaci § §HIVAN (HIV-associated nephropathy) §jedna z nejčastějších příčin úmrtí HIV pozitivních pacientů §HIV Vpr protein indukuje expresi FAT10 v renálních buňkách a způsobuje deregulaci buněčného cyklu a apoptosu §navíc Vpr interaguje s FAT10 a je kolokalizován v mitochondriích §inhibice FAT10 brání Vpr indukované apoptose •Pup §Pup – „prokaryotický ubikvitin“ §produkt PUP genu u bakterií kmene aktinomyceta (aktinobakterie) §nejběžnější zástupce v půdě, zahrnuje mnoho patogenů (Mycobacterium leprae, tuberculosis) §60 - 70 aminokyselin, 7 kDa, nesdílí sekvenční ani strukturní motiv s ubikvitinem §nemá konzervovaný motiv, C-konec vykazuje sekvenční homologii §spíše rozvolněný, hydrofobní interakce u C-konce mohou vytvářet šroubovice PDB: 3M9D •Pup §pupylace – připojení Pup proteinu na lysin cílového proteinu §pupylovaný protein je následně degradován prokaryotickým proteasomem §pouze 1 pupylační enzym PufA a 1 depupylační Dop §tato dráha není esenciální – úloha a vznik proteasomu v bakteriích? http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0167488913001237-gr1.jpg Striebel et al., BBA, 2014 •Co si pamatuji z přednášky? §Co je to ubikvitin? §Jaký je rozdíl mezi pojmy ubikvitin a ubikviton? §Jak probíhá ubikvitinace? §Co se může dít s proteinem po ubikvitinaci? §Jsou nějaké proteiny podobné ubikvitinu? §Existuje ubikvitin nebo ubikvitinu podobny protein u prokaryot?