Dvoudimenzionální elektroforéza Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ - PROTEOMIKA CEITEC – Středoevropský technologický institut NCBR – Národní centrum pro výzkum biomolekul PřF proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DE ? Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein 2DE 1DE HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí …kryomlýn PŘÍPRAVA VZORKU solubilizace močovina, thiomočovina, detergenty redukce DTT, TBP inhibice proteáz, fosfatáz, glykosyláz odstranění kontaminant MĚŘENÍ KONCENTRACE PROTEINU lyzační pufr vs. hydratační pufr !  žádný celkový náboj  0.5 – 4%  použitelné ve vysokých koncentracích močoviny  neionogenní  zwitterointové  SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY ZÁKLADNÍ PRAVIDLA  jednoduchý postup  zabránit proteolýze  čerstvé reagencie  čerstvý vzorek  odstranit pevné částice - centrifugace  odstranit kontaminanty KONTAMINANTY  soli, zbytky pufrů  malé endogenní molekuly  iontové detergenty  nukleové kyseliny  polysacharidy  lipidy  fenolické látky …PVPP, Sephadex …FASP 2-DE • první rozměr • druhý rozměr IEF SDS-PAGE 1. ROZMĚR IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU ! ROZSAH STRIPU denaturace SDS  redukce DTT  alkylace IAA  EKVILIBRACE STRIPU ! 2. ROZMĚR SDS-PAGE migrace aniontů v elektrickém poli podle MW ! STRIP GEL + - + FOKUSACE SDS-PAGE - ekvilibrace orientace gelu KYSELEJŠÍ pI ALKALIČTĚJŠÍ VYŠŠÍ MW NIŽŠÍ ! 2-DE INSTRUMENTACE  Protean IEF  Protean Dodeca Cell  Densitometer GS-800  FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu  po elektroforéze  před elektroforézou  specifické pro protein  specifické pro PTM  viditelné spektrum  fluorescence Sypro Ruby Coomassie silver 1.4 ng 36 ng 0.6 ng DETEKCE PROTEINU V GELU PTM specifická barvení Pro-Q Diamond Pro-Q Emerald BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby Ag Sypro Ruby • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU biologické replikáty technické replikáty biologická variabilita technická variabilita stejný organismus za stejných podmínek stejný vzorek stejně Difference Gel Electrophoresis DIGE Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu Biomarkery v lidské plasmě separace identifikace DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTIONtrypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSE KVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFRS GELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAKP ASAEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLSD SLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEEA NATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSYD LTGGAYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGDKN LESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLEKQT AYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEESATV TATSPIKTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWADKL DKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFVKERS DAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQASLSNPR VSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMVAVALGG LASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESIDLDELN ENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFNDKSDPV KAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQFIGTRTIN TSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFPAEDVQVI VEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLVYKQQTLQ A MS 2D or not 2D ?  vizuální aspekty  reprodukovatelnost  dynamický rozsah  extrémní proteiny (membránové,basické...)  nesnadná automatizace  postdigesční extrakce • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification LITERATURA INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 Basics and recent advances of two dimensional – polyacrylamide gel electrophoresis Sameh Magdeldin et al. Clinical Proteomics 2014 MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE  velké objemy vzorku  možnost koncentrace na koloně  membránové proteiny, basické proteiny  není nutno barvit  peptidy – přímo na MS  automatizace  vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr  LC - sériová analýza  GE současně pro více vzorků PROTI PRO Název prezentace v zápatí CO ROZHODUJE KOLONA  náboj  hydrofobicita  biospecifická afinita  velikost molekuly ionex reverzní fáze afinitní gelová TYPY LC SEPARACE … a kombinace Název prezentace v zápatí Kolona může vypadat různě . . . Název prezentace v zápatí C18 C4 MC SCX Zip Tip Millipore Glygen TopTip NuTip LITERATURA - MULTIDIMENSIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE Hyphenated dimensions in separation science P.Q.Tranchida et al. Journal of Chromatography 2012 Multi-dimensional Liquid Chromatography in Proteomics Xiang Zhang et al. Anal Chim Acta 2010 Multidimensional separation of peptides for effective proteomic analysis H.J.Issaq et al. Journal of Chromatography 2005 Multi-dimensional liquid phase based separations in proteomics Hong Wang, et al. Journal of Chromatography 2003 G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE GENOM PROTEOM IZOFORMY PTM asi 200 typů (fosforylace, glykosylace, acylace, methylace…) KONCENTRAČNÍ ROZSAH asi deset řádů PREFRAKCIONACE MS 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu Abundantní proteiny v lidské plazmě odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG AFINITNÍ DEPLECE CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library PROTEOMINERPREFRAKCIONACE PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator IEF • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace v roztoku na IPG stripu offgel pivo 70 proteinů OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů digest směsi proteinů IEF směsi peptidů na IPG stripu frakce stripu IPG-IEF Blue Native Electrophoresis BNE • separace proteinů v nativním stavu • separace membránových komplexů • solubilizace neionogenními detergenty • náboj udělen Coomassie G-250 • BN PAGE gel (strip/band) dále zpracován G-250 SDS 2DE BNE SDS-PAGE SDS 8M Urea Peptides DTT IAA spin spin spin incubation spin proteins nucleic acids Lysate 8M Urea Ammonium Trypsin SDS DTT IAA bicarbonate PROTEINS PEPTIDES Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) Filter Aided Sample Preparation FASPFASP Filter aided sample preparation PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI GELOVÁ CHROMATOGRAFIE ! For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.