MUTANTI A JEJICH VYUŽITÍ V
GENOMICE
Metody v genomice a proteomice (CG080)
Genomika – lekce 6
jaro 2017
Mgr. Markéta Žďárská, Ph.D.
Obsah
Transgenní rostliny a funkční genomika
Mutageneze, typy mutagenů
Přístupy přímé genetiky
EMS mutageneze
Poziční klonování
Sekvenování
Přístupy reverzní genetiky
Tilling
Reportérové geny
2
Transgenní organismy
transgen – gen (genetický mat.) přenesen
přirozeně nebo gen. inženýr. technik z jednoho
organismu na druhý
syntetické, modifikované nebo cizorodé geny
mohou být vnášeny do živočichů a rostlin
„non-native“ segment DNA
zachová si schopnost produkce RNA/proteinu v
transgenním organismu
může změnit norm. funci v genetickém kódu transgen.
organismu
transgenní organismy slouží ke studiu funkcí
genů 3
Transgenní organismy
GloFish are a type of transgenic zebrafish (Danio rerio) that have been
modified through the insertion of a green fluorescent protein (gfp) gene.
4
Funkční genomika
 cíl: hledání genů a určení jejich funkce v genomu
 2 různé přístupy:
› přímá genetika „forward genetics“
 fenotyp → gen
› reverzní genetika „reverse genetics“
 sekvence DNA (gen) → fenotyp
5
Mutageneze
mutanti – nástrojem obou přístupů
různé typy mutagenů
1. chemické
2. fyzikální (záření)
velký počet náhodných mutací, zasáhne všechny geny
3. biologické
• moderní
• inzerční mutageneze, menší počet mutací, zanechávají molekulární
značku
6
klasické
Chemické mutageny
 způsobují bodové mutace
1. při replikaci DNA ale i v nereplikující se DNA
› alkylační látky (vnáší alkylovou sk. na báze; náhodné)
 yperit (hořtičný plyn; Ch. Auberbach)
 ethylnitrosomočovina (ENU)
 ethylová sk. ENU reaguje většinou s thyminem
 Bill Russell (1951) myší kmen („T-test stock) pro testování různých
mutagenů
 ethylmethansulfonát (EMS)
 ethylová sk. EMS reaguje s guaninem v DNA, vytvoří O-6-ethylguanin
(místo G:C vznikají A:T)
 Maple J. & Moller SG, 2007 - Mutagenesis in Arabidopsis
› HNO2 (deaminace aminoskupin)
7
Chemické mutageny
2. pouze při replikaci
› analogy bází: 5-bromuracil, 2-
aminopurin
 způsobují chybné párování
› akridinová barviva: proflavin,
akridinová oranž
 způsobují adice či delece 1-více bazí →
změna čtecího rámce → nefunkční
genové produkty
› hydroxylamin
 specifická – indukuje tranzice pouze ve
směru G:C → A:T
8
Fyzikální mutageny
 ionizující: RTG, gama záření, radioaktivní uhlík 14C
› způsobují zlomy
 neionizující: UV záření 254nm je absorbováno bázemi −>
pyrimidinové dimery (naruší cukr-fosfátovou kostru)
 způsobují rozsáhlejší inzerce a přestavby chromozomů
 mohou odstranit i více genů nebo vnést nové regulační
sekvence
 nevhodné pro přesnou mutagenezi
9
Biologické mutageny
 inzerční mutageneze
1. T-DNA
› Agrobacterium tumefaciens je schopna vnést do rostlinného
genomu část své DNA
› důsledky začlenění T-DNA do genomu jsou různé, dáno povahou
inzertu a místem, kde se integruje
› způsobuje:
 inaktivaci genu
 aktivace (nese promotor, zesilovač)
2. Transpozony – transponovatelné genetické elementy
› pohyblivé genetické elementy, nejsou tak stabilní jako T-DNA
› mohou se přemístit z místa původní inzerce −> obnovení
normálního fenotypu
› v místě inzerce zůstává stopa i po opuštění genomu, nevhodné pro
rozsáhlou mutagenezi (Petersen et al, 2000)
10
T-DNA a transpozony
 inzerční mutageneze
 inzerce do:
› kódující oblasti
› nekódující oblasti –
ovlivnění sestřihu intronů,
genové exprese
  výhody:
› reverzibilní mutace
› snadno se mapuje a
region se lehce klonuje
  nevýhody:
› inzerce není náhodná 11
Jak obecně hledat mutaci?
1. menší mutace
 nové jednonukleotidové polymorfismy (SNP) ve vytipované
oblasti
 změněný transkripční profil
 komplementace mutace transgenozí různých
 kandidárních genů ve WT formě
2. chromozomíální přestavby
 přestavby rozsáhlé → in situ hybridizace na metafázních
chromozomech – rozlišení 5 Mbp
 přestavby menší → komparativní genomová hybridizace (CGN)
 „DNA microarrays“ se sondami pokrývající různé části genomu
 hybridizace s genomickou DNA – rozlišení desítky Mbp
12
The upper DNA
molecule differs from
the lower DNA
molecule at a single
base-pair location (a
C/A polymorphism).
Přímá „saturační“ genetika
 založena na saturační mutagenezi „saturation screen“
› působení mutagenu na organismus −> analýza potomstva na
určitý fenotyp
› identifikace mutantů −> třídění do komplement. skupin
› mapování do obecných chromozomál. lokalizací pomocí
známých markerů (značek) a klonování, sekvenování
 existuje mutace pro každý lokus −> možnost určit
skupinu genů odpovědných za daný znak
 cílem je dosažení saturačního bodu −> odhalit všechny
geny odpovědné za fenotyp
 mutageny (RTG, EMS, transpozony)
› Příklady:
› rostliny bez reakce na světlo
› neschopnost bakterií růst v přítomnosti určitých cukrů,.. 13
Identifikace mutovaného genu u
mutantní linie vybrané na základě
fenotypového projevu
 na základě genetické mapy
1. mapování - (ko)segregační analýza
› nalezení přibližné pozice genu v genetické mapě, na základě
genové vazby s genetickými markery (znaky, které vykazují
polymorfismus = jsou rozdílné mezi rodičovskými genotypy)
2. nalezení konkrétní sekvence nesoucí mutaci
› chromosom „walking“
› sekvenace, srovnání s WT sekvencí
14
= znak se známou (snadno dohledatelnou) polohou v
genetické mapě, který vykazuje polymorfismus (je
rozdílný mezi rodičovskými genotypy)
1. Morfologické
2. Molekulární
DNA markery – detekovatelné rozdíly v sekvenci
DNA se známou či určitelnou polohou v genomu
dobře detekovatelné lokusy se známou pozicí na chromozomu
jednonukleotidové polymorfismy (SNP)
ideálně co nejvíce a rovnoměrně rozmístěny
Typy genetických markerů
15
Přirozená morfologická
variabilita Arabidopsis – ekotypy
„accessions“
Fig. 1: Geographical distribution of Arabidopsis thaliana (green
area on the world map) and overall phenotype of the rosette
of a subset of accessions grown under 3 contrasted
environment scenario.
http://www.mpipz.mpg.de/102840/reymond 16
DNA molekulární markery
(= proužek na elektroforéze či blotu)
 SSLP (Simple Sequence Length
Polymorphism)
› délka genomu (PCR produktů) amplif.
pomocí spec. primerů
 RFLP (Restriction fragment length
polymorfism) + Southern
› délka restrikčních fragmentů úseku
genomu, PCR po naštěpení genomové
DNA a ligaci adaptorů
 RAPD (Random amplified
polymorphism detection)
› délka náhodně amplif. úseků genomu
(krátké primery 8-10bp
 AFLP (Amplified fragment length
polymorphism)
› délka fragmentů genomu, PCR po
naštěpení genomové DNA a ligaci
adaptorů
17
Other Markers Acronym
Variable Number
Tandem Repeat
VNTR
Oligonucleotide
Polymorphism
OP
Inverse Sequencetagged
Repeats
ISTR
Inter-retrotransposon
Amplified
Polymorphism
IRAP
DNA molekulární markery
Arabidopsis thaliana
křížení dvou jeho ekotypů: Columbia a Landsberg erecta (Col X Ler)
rekombinační mapa obsahovala původně 67 markerů (Lister & Dean, 1993)
dnes přes 1300 markerů (Hou et al, 2010)
Arabidopsis thaliana physical map with
indication of the positions of the markers.
18
Poziční klonování
(positional cloning, map-based
cloning)
izolace genu pouze na základě znalosti jeho pozice na mapě
nemusí být známa funkce genu (mechanismus působení, biochemická,
podstata produktu)
mapování genu na základě jeho genetické vazby s molekulárním
markerem a následnou izolaci tohoto genu díky známé pozici na
chromozomu
potřeba standardní linie, která je zkřížena s mutantní linií, aby mohla být
provedena rekombinační analýza s markery
cíl pozičního klonování:
gen s požadovanou mutací lokalizovaný v intervalu mezi dvěma nejbližšími
markery
úsek dostatečně malý −> vybrat kandidátní gen, v němž je pak možné různými
způsoby identifikovat mutaci
obecně složité a časově náročné
19
Lukowitz et al, 2000
Poziční klonování - schéma
1. Křížení mutantní linie se standardní linii
odlišného, genetického pozadí a vytvořeni
segregující generace (většinou F2) −>
mapovací populace
2. Přibližná lokalizace mutantního lokusu
rekombinační analýzou s genetickými markery
(20-30 rostlin)
› „bulk segregation analysis“
a) analýza směsi DNA všech vzorků z rostlin
určitého fenotypu najednou pro jednotlivé
markery −> snížení množství potřebných
PCR reakci (Lukowitz et al., 2000)
b) stanovení vazby je multiplex PCR s
použitím fluorescenčně značených
primerů (všechny markery najednou u
jednotlivých vzorků) (Ponce et al, 1999)
20Lukowitz et al, 2000
Poziční klonování - schéma
3. identifikace dvou markerů vzdálených od
sebe <10% rekombinace a definující
genetický interval obsahující mutaci (cca
100 rostlin)
4. rozšířená analýza markerů (1000 rostlin)
a selekce rostlin, kde došlo k rekombinaci
5. rekombinační analýzy ke zúžení
definované oblasti na interval < 1%
rekombinace (250 kb)
identifikace mutantního genu ve vymezené
oblasti
21Lukowitz et al, 2000
Poziční klonování - aplikace
22
 Arabidopsis
› mapa pozičně klonovaných genů obsahující 620 mutantních genů s
fenotypovým projevem (Meinke et al, 2003)
› počet genů Arabidopsis izolovaných metodou pozičního klonování každým
rokem narůstá → objasnění dalších funkcí genů modelové rostliny
 Pšenice (Tritium aestivum)- zemědělské plodiny
› molekulár.markery:
 SSR (Simple Sequence Repeat)
 SCAR (Sequence – Characterised Amplified Region)
› izolování genů s markery komplikovanější – hexaploid
› nedostatečná znalost genů kódujících zemědělsky užitečné znaky (zatím cca
20), např. plísně a rezistence k nim
 Geny chorob
› Huntingtonova choroba -je vzácné dědičné neurodegenerativní
onemocnění mozku charakteristické nekoordinovanými trhavými pohyby těla
a snížením mentálních schopností
› Cystická fibróza (CF) je smrtelná lidská dědičná nemoc, která postihuje
převážně dýchací a trávicí soustavu
Identifikace mutantního genu nalezení
konkrétní sekvence nesoucí mutaci
 test na alelismus, tj. zkřížení testované mutantní linie s linií s
„knock-out“ kandidátním genem a sledování, zda zůstane
mutantní fenotyp
 molekulární komplementace (u recesivních mutací)
› transformace mutantní rostliny sekvencemi standardní DNA z
vymezeného úseku a určení, která obnoví standardní fenotyp
 analýza celé sekvence DNA vymezeného genetického
intervalu −> hledat změny, které způsobily mutaci
› SSCP(Single Stranded Conformational Polymorphism)
› HMA (Heteroduplex Mobility Assay)
› DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
› dHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography)
› hybridizace na čipech
› pyrosekvencovani
› „chromozome walking“
 sekvenování
23
„Chromosome walking“
nalezení optimálně dvou markerů
obklopujících mutovaný gen
knihovny velkých fragmentů genomové
DNA (redundantní, náhodné):
YACs, BACs
= yeast (bacterial) arteficial chromosome, ~
300 (100) kbp
hledání překryvů na základě
hybridizace koncové sekvence
Mutovaný
gen X
24
Genomic DNA is shown in blue. Selected clones from a library
of cloned genomic DNA fragments are shown in red. The initial
probe, probe a, is specific to gene A or exon A and allows
identification of clones 1 and 2. A new probe, probe b, is
prepared from one end of clone 2 and used to isolate new
clones 3 and 4 from the genomic library. Probe c, prepared from
clone 4 is used to identify clone 5, etc. The orientation of the
clones is determined by restriction mapping of the clones. Clone
6 contains the desired gene B or exon B.
Sekvenování - klasické - Sanger
 enzymatická metoda je založena na sekvenaci pomocí
detekce ukončení prodlužujícího se vlákna DNA
 sekvenaci předchází příprava DNA knihovny
› DNA sestřižena na kratší úseky
› naklonována do DNA vektorů
› amplifikována in vivo (v bakteriálních buňkách, ze kterých jsou
plazmidy nesoucí klonované fragmenty následně extrahovány)
 sekvenace probíhá ve čtyřech nezávislých reakcích
 vznikají fragmenty DNA o různé délce zakončené
značenými dideoxynukleotidy
 díky délce čtených úseků, které dosahují 700 až 800 bp stále
nejpoužívanější a nejpřesnější
25
Sekvenování - klasické - Sanger
26
Pyrosekvenace –
„Next-generation sequencing“
na sekvenaci syntézou komplementární DNA
liší se způsobem, jak je detekováno začlenění daného nukleotidu −> nevyžaduje elfo
vyvinul v roce 1996 ve Stockholmu profesor Pål Nyrén se svým studentem Mostafou Ronaghi
Reakční směs:
DNA polymeráza,ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza;
substráty adenosinfosfosulfát a luciferin
do směsi jsou postupně vkládány nukleotidy různých typů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
světelné záření −> začlenění 1 nebo více
nukleotidů do vznikajícího řetězce
světlo vzniká v důsledku enzymatické
reakce, na jejímž začátku je uvolnění
pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu
a na jejímž konci je spotřeba vzniklého ATP
luciferázou k oxidaci luciferinu
před přidáním dalšího nukleotidu je původní
nukleotid (již obsažený v roztoku) rozložen
27
„Next-generation sequencing“
28
29
„Next-generation sequencing“
„Next-generation sequencing“
30
„Next-generation sequencing“
31
„Next-generation sequencing“
32
„Next-generation sequencing“
33
Mnohonásobné prosekvenování jednoho úseku DNA
kompenzuje vyšší chybovost sekvenačních metod nové
generace.
Využití sekvenačních metod
nové generace
 celé genomy
› resekvenování −> hledání sekvenčních variant v lidské
populaci
› de novo sekvenování −> nemodelové organismy
 transkriptom (RNA-seq)
› Identifikace dosud neznámých transkiptů
› míra transkripce jednotlivých genů - přesnější než
„microarrays“
 cílené −> určitá část genomu, skupiny genů
› náhodné oblasti genomu −> na základě délky po
restrikčním štěpení genomové DNA (RAD-seq)
› hybridizace k cca 100bp próbám se vyberou fragmenty
DNA, kt. se sekvenují (Hyb-seq)
34
Využití sekvenačních metod nové
generace
35
Velkokapacitní náhodná
mutageneze a „screening“
systematická mutageneze –postupné
EMS mutageneze
místo hledání urč. fenotypu (přímá), kdy se hledá gen zájmu se
změnami v nukleotidech
běžně „screen“ 1000 nebo 10000 jedinců
využití PCR genu zájmu −> hledání drobných změn v migraci
PCR produktu na gelu či koloně
všechny změny nevyřadí („knockout“) gen, některé se neprojeví
-„silent“, na neesenciálních AMK pozicích
metody běžně užívané:
DHPLC –“Denaturing High Performance Liquid Chromatography“
DGGE – „Denaturing Gradient Gel Electrophoresis“
SSCP – „Single-Stranded Conformation Polymorphism“
36
Příklad využití EMS mutageneze
(Feraru et al, 2010)
A fluorescence imaging-based forward genetic
screen“
As a tool for the screening to identify novel components of plant intracellular
trafficking, they used a well characterized plant cargo, the auxin efflux carrier
PIN1 (Petrasek et al., 2006).
With this strategy,they aimed to identify novel regulators at different stages of
subcellular protein trafficking.
EMS-mutagenized PIN1pro:PIN1-GFP (for green fluorescent protein)
population using epifluorescent microscopy for seedlings displaying aberrant
PIN1-GFP distribution in the root.
From 1500 M1 families, they identified several protein affected trafficking
(pat) mutants defining three independent loci (mapping with simple sequence
length polymorphism (SSLP) and cleaved amplified polymorphic sequence
(CAPS and dCAPS) markers
The At3G55480 candidate gene was sequenced and a point mutation that
caused a stop codon was found at the position 705 downstream of ATG)
37
Příklad využití EMS (Feraru et al, 2010)
38
Figure 1. The pat2 Mutant Displays Ectopic
Intracellular Protein Accumulation.
(A) to (D) Both PIN1-GFP ([A] and [B]) and
aleurain-GFP ([C] and [D]) accumulate
intracellularly in pat2-1 (B) or pat2-2 (D) root
cells compared with
control ([A] and [C]).
•pat2 mutant lytic vacuoles display altered morphology and
accumulation of proteins
• unlike other mutants affecting the vacuole, pat2 is
specifically defective in the biogenesis, identity, and
function of lytic vacuoles but shows normal sorting of
proteins to storage vacuoles
• PAT2 encodes a putative b-subunit of adaptor protein
complex 3 (AP-3)
•AP-3 b functions in mediating lytic vacuole performance
and transition of storage into the lytic vacuoles
independently of the main prevacuolar compartment-based
trafficking route
Nepřímá „reverse“ genetika
dnes −> post-genomická éra
známe geny (sekvence)
neznáme
funkce genů
většinou >50% predikovaných genů u eukaryot
fenotypy, které způsobí mutace v těchto genech
39
TILLING
(Targeting induced local lesions in
genomes)
 získání (nalezení) bodových
mutací ve vybraném genu
 bodové mutace
› potenciální změny regulace,
interakce, …
 představena na
Arabidopsis thaliana
(McCallum et al, 2000)
 Princip
› náhodná indukce bodových
mutací (EMS)
› následné hledání linií s mutací
v cílovém genu pomocí PCR
a heteroduplexní analýzy
(McCallum et al, 2000)
40
TILLING – detekce mutací,
strategie
amplifikace cílového
fragmentu (koncově značené
primery)
reasociace s wt DNA
štěpení heteroduplexu (ss
nuclease-CEL I)
elektroforéza (separace podle
velikosti na různých
platformách; LI-COR )
vizualizace koncově
značených fragmentů
Metoda pracuje s amplifikovanými fragmenty o velikosti kolem 1 kb a
mutaci je schopna analyzovat s přesností na 10 bp (Henikoff et al, 2004). 41
ATP http://tilling.fhcrc.org
TILLING: A five step process
1. You decide whether your gene is worth TILLING.
”I have an insertion in my gene but the knockout phenotype is
lethal.” ....TILLING can provide the sub-lethal phenotypes you want.
“The knockout phenotype is interesting.”.....TILLING can provide an
allelic series that may help you better ascertain the function of your gene.
“I have an insertion in my gene that knocks out gene function but
my plants have no phenotype.”.....TILLING is not for you. In this scenario,
a gain-of-function mutation is needed to investigate the potential in vivo role of
this gene.The large majority of phenotypes arising from our populations will
cause full or partial loss of function.
”I have a candidate gene and I want to know the knockout
phenotype.”....There are very good reasons why you should start by insertional
mutagenesis rather than by TILLING. First, only a small percentage of EMS-induced
mutations will yield a change likely to truncate the protein (~5%). Second, the Arabidopsis
community has access to excellent insertional mutagenesis resources. Third, if a knockout
mutation causes no phenotype, then the TILLING allelic series is not expected to either.
42
ATP http://tilling.fhcrc.org/
TILLING: A five step process
2. You find the best the region to be targeted and
place your order.
3. ATP screens the region for mutations.
4. ATP sequences the mutation and enters it in
our public database.
5. ATP sends you a mutant report and you order
seed.
43
44
TILLING centres
Several TILLING centers exists over the world that focus on agriculturally
important species:
Rice – UC Davis (USA)
Maize – Purdue University (USA)
Brassica napus – University of British Columbia (CA)
Brassica rapa – John Innes Centre (UK)
Arabidopsis – Fred Hutchinson Cancer Research
Soybean – Southern Illinois University (USA)
Lotus and Medicago – John Innes Centre (UK)
Wheat – UC Davis (USA)
Pea, Tomato - INRA (France)
Tomato - University of Hyderabad (India)
45
Rostliny s inzercí v určitém genu
veřejně dostupné kolekce mutantů na různých místech genomu
inzerce ve většině genů Arabidopsis thaliana
výběr in silico, objednání semen rostlin s inzercí v určitém genu
Gen1 Gen2 Gen3
= místa inzerce T-DNA v jednotlivých mutantních liniích
1 2 3 4 5 6 7 8 číslo linie
46
Reportérové geny
gen připojený k regulač. sekvenci genu zájmu
(bakterie, rostliny, živoč., buněč. kultury)
reportéry – k detekci exprese genu v organismu,
nemohou se přirozeně vyskytovat ve studovaném org.
fluorescentní (GFP)
β-galactosidaza (GUS)
47
TCS::GFP
48(Zurcher et al, 2013)
GUS systém
49
(Mason et al, 2004)
Děkuji za pozornost 
Central European Institute of Technology
c/o Masaryk University
Žerotínovo nám. 9
601 77 Brno, Czech Republic
www.ceitec.eu | info@ceitec.cz
This work was supported by the Program
of „Employment of Newly Graduated
Doctors of Science for Scientific
Excellence“ (grant number
CZ.1.07/2.3.00/30.0009) co-financed from
European Social Fund and the state
budget of the Czech Republic.