CG080 – Metody v genomice a proteomice
Analýza protein-proteinových
interakcí
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
doporučená přednáška: Struktura a funkce proteinových komplexů (CG030)
Informační zdroje
Golemis a Adams: Protein-protein interactions …
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS …
Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ...
http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1 – viz níže
Metody analýzy proteinových komplexů
- ultracentrifugace, gelová filtrace,
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- cross-linking MS, (cryo) elektronová mikroskopie …
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- martix/beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC …
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
Vúvodnípřednášce„Strukturaa
funkceproteinovýchkomplexů“
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- matrix/beads-based:
- ko-imunoprecipitace
- ko-purifikace – gelová filtrace
- pull-down
- analýza proteinových domén
- analýza interakčních povrchů
- použití peptidů
- hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC …
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
Vúvodnípřednášce„Strukturaa
funkceproteinovýchkomplexů“
Tagy (a protilátky):
Myc, FLAG, V5,
S-tag, GFP,
GST, Streptactin
(biotin-streptavidin),
MBP …
Protein Tag
- ko-imunoprecipitaci
lze využít i pro analýzu
protein-proteinových
interakcí – uměle
vnesené konstrukty
(např. transfekce
plasmidů do buněk)
riziko nepřímých
interakcí
Y
Y
Hudsonetal,PLoSOne,2011
Protein A-protilátka
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- TAP-tag („Tandem-affinity purification“, jiné tagy a protilátky)
Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může
pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat (více
Dr. R. Dopitová)
Totalextract
FT
Solublefraction
25
35
40
55
70
1.
Input
15
10
25
35
40
55
70
15
10
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
FT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Elution fractions – 10ml Elution fractions – 1,5ml
Nse3
His-
Nse1
Strep-
Nse4
1. His-tag purification 2. Strep-tag purification
Strep
Strep
6xHis
Nse4Nse3Nse1
Nse4 protein se samostatně exprimuje málo a je málo rozpustný
Exprese ze stejného plasmidu (RNA, proteiny na stejné hladině,
na stejném místě – ko-translace na polyribosomech)
Ko-purifikace
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
AU
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0% Buffer B
60.00 120.00
Rack Pos.:
Tube #:2
A
4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1
B
3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41
15
25
35
40
55
70
input
29A
30A
31A
32A
33A
34A
35A
36A
37A
38A
39A
40A
41A
42A
1B
2B
3B
4B
5B
6B
7B
8B
9B
10B
11B
12B
Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1
Nse1,-3,-4
Nse1,-3
Nse1
3. Gelová filtrace
Nse3
Nse1
Nse4
agregáty
Mutace
ovlivňuje dimer
Van Crabben et al, JCI, 2016
Nse4 protein se
dobře exprimuje
v TNT (v buňkách je
nerozpustný)
Pull-down (variace) Silné interakce - oba proteiny
v TNT (nM-pM)
Slabé interakce
(µM) bait v přebytku
(bakt. exprese) a
prey v TNT
Palecek et al, JBC, 2006
PAGE
PAGE => Western (anti-GST)
Podobný princip jako při ko-purifikaci
in vitro TNT (transcription
and translation) systém
methionin S35 (2 partneři)
výhody:
- není třeba proteiny purifikovat
- není třeba protilátky k detekci
- není toxický efekt pro buňky
- lépe rozpustné …
Charakterizace
interakcí - domény
Sergeant et al, MCB, 2005
Doyle et al, Mol Cell, 2010
Ubírat či přidávat
SMC5=
Spr18
MS spektrum celého proteinu
(normální pokrytí sekvence)
MS spektrum precipitátu
(obohacená interakční část)
P. Reichman (Diplomová práce)
Charakterizace
interakcí
– detailní mapování
1
2
3
4
1 2 3 4
Podobně jako při ELISA
jamky jsou potažené streptavidinem
peptidy se přes biotin ukotví
Lze mapovat epitop pro protilátky (vazbu)
Peptidy jsou na N-konci biotinylované
Peptidové mapování
Charakterizace interakcí – peptidové mapování
Podobně jako při ELISA
jamky jsou potažené streptavidinem
peptidy se přes biotin ukotví
Guerineau et al, PLoS One, 2012
Peptidové mapování
Analýza Nse3-Nse4 interakce
Délka: 25 AMK
Posuv: 5 AMK
Knihovna: 18 peptidů
Nse4 peptidy
90 AMK
Charakterizace interakcí – „alanin scan“
EID2 peptidy (paralog Nse4)
Délka: 25 AMK
Posuv: mutace po 1 AMK
Knihovna: 20 peptidů
A
Interakce NSE3-NSE4 (obecně MAGE-EID)
detailně zmapovány pomocí pull-down,
peptidů, mutageneze …
hydrofobní šroubovice Nse4 proteinu sedí v
kapse Nse3 proteinu …
Guerineau et al, PLoS One, 2012
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní:
- transkripční 2-hybridní systém - domény
- reverzni systém – analýza PPI
- více-hybridní systémy
- inhibice PPI
- membránový systém - pathway
- komplementační systémy - fold
- BiFC, DHFR
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
Uetz and Finley, 2005
Traven et al.: EMBO Report, 2006
Při studiu mechanismů
transkripce v kvasinkách
S. cerevisiae byl vyvinut
tzv. Y2H
Na spínaní/regulaci
metabolismu galaktosy
se podílí transkripční
faktor Gal4p – váže
specifické sekvence v
UAS genů (Gal enzymů)
a aktivuje jejich
transkripci
Dvou-hybridní
systémy
(kvasinkové)
doc. J. Paleček: Biologie kvasinek (C9045)
Gal4p
Transkripční
komplex
Luban & Goff, CO Biotech, 1995
DB
DB
AD
AD
DB
AD
DB
AD
Y2H
- DNA-vazebná doména (DB) bez
aktivační domény (AD)
není schopna aktivace transkripce
Je možné propojit domény jakýmkoli
linkerem a transkripci reaktivovat
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2) Transformace plasmidů do kvasinek
MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze
tedy selektovat na uracilovou auxotrofii + reversní systém
tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)
- Testuje se
schopnost růstu
kvasinek na médiu
bez histidinu (nebo
adeninu – červená/bílá)
- lze použít i pro
hledání proteinových
interakčních partnerů
(screen knihovny)
Kvasinkový
kmen
kvantitativní
auxotrofie
(media bez …)
FACSorting
rezistence
(media s aureob)
Reportérové geny
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
His3
His3
“alanin scan” konservovaných AMK ukázal hydrofobní kapsu
“alanin scan” konzervovaných
AMK ukázal hydrofobní kapsu
na povrchu Nse3 …
… do níž se váže hydrofobní
šroubovice Nse4 proteinu
Pomocí in silico (MD) analýzy
byl vytvořen model dimeru
Nse3-Nse4 (docking)
Reversní systém (Y2H)
- při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě
kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374
je vhodnější
pozitivní selekce
(screenovat na
rostoucí
kvasinky)
Split-hybrid systém
represor
bez represoru
Uetz et al, Nature, 2000
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat α buňky
Kvasinkový, lidský …
„INTERACTOM“
High-throughput – testovány
knihovny 6000x6000 proteinů
(kombinace pomocí párování
místo transformace)
YX
Interakce vyžadující post-translační modifikace
Reporter genminimálníGAL1 UAS
transkripceDBD
AD
enzym
Guo et al, Nat Biotech, 2004
- Některé protein-proteinové interakce jsou závislé na post-translačních modifikacích
- v buňce jsou přítomny např. acetylasy i deacetylasy, ale nemusí docházet k
acetylaci hybridního proteinu – řešením je „připojení“ příslušného enzymu k hybridu
- konstitutivní modifikace a enzym ve stechiometrickém poměru k substrátu (nejsou
nutné kofaktory regulující interakci/modifikaci)
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein)
2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2
sekvence
3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR)
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra & Liu, PNAS, 1996
dexamethasone
glucocorticoid receptor - FKBP12
Tři fúzní (hybridní)
makromolekuly
(2x protein a 1x
nízkomolekulární ligand)
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní:
- transkripční 2-hybridní systém - domény
- reverzni systém – analýza PPI
- více-hybridní systémy
- inhibice PPI
- membránový systém - pathway
- komplementační systémy - fold
- BiFC, DHFR
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
Broder et al, Cur Biol, 1998
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní:
- transkripční 2-hybridní systém - domény
- reverzni systém – analýza PPI
- více-hybridní systémy
- inhibice PPI
- membránový systém - pathway
- komplementační systémy - fold
- BiFC, DHFR
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
Protein-fragment complementation
Shekhat & Ghosh, CO in ChB, 2011
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Kodama & Hu, Biotechniques, 2012
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Propojuje se zpět fold/struktura nikoli 2 domény jako u Y2H
(lokalizace proteinů do tkání, buněčných kompartmentů …)
Pekarova et al, Plant J., 2011
Dihydrofolát reduktása/methotrexát
Aktivní DHFR je
vytvořena propojením
dvou separovaných částí
enzymu – odbourává pro
kvasinky toxický
methotrexát (screen)
Tarrasov et al, Science, 2008
Lze selektovat
tj. použít pro
screen
Bruckner et al, IJMS, 2009
Přehled kvasinkových PPI biotechnologií
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC …
- proximity-based
- FRET
- PLA
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
FRET (Forster/fluorescence resonance energy transfer)
- fluorescence prvního (CFP) proteinu o vhodné vlnové délce
excituje druhý protein - (pokud je dostatečně blízko) - druhý
protein emituje (YFP, fluorescence) záření detekované v
mikroskopu
Hybridní!!
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC …
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based:
- crosslinking
- protein painting
- H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
Přednáška doc. Zdráhala minule …
- estery reagují s Lys (ε-amin) a amino-koncem
- homofunkční spojí proteiny dohromady v
jednom kroku (velmi komplexní vzorky pro MS)
- intra- (struktura) nebo intermolekulární (PPI)
Crosslinking
A.
ester
Sinz, MS Reviews, 2006
Paramelle et al, Proteomics, 2013
B.
Hydrogen Exchange
(P. Muller, MOU)
Trcka et al, JBC, 2014
Protein painting
Luchini et al, Nat Comun, 2014
Luchini et al, Nat Comun, 2014
Protein painting
AO50
Bruckner et al, IJMS, 2009
Metody analýzy proteinových komplexů
- ultracentrifugace, gelová filtrace,
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- cross-linking MS, (cryo) elektronová mikroskopie …
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- beads-based: pull-down (in vitro), coIP …
- hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC …
- proximity-based: FRET, PLA …
- MS-based: painting, H-exchange …
- kvantitativní: SPR, ITC …
- ko-krystalizace, NMR analýza …
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
doporučená přednáška: Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii (C7230), doc. C. Hofr
přednáška doc. Marka příště …