Neurofyziologie smyslů Na NS je postavena naše osobní identita. Prožívání, vědomí a paměť jsou na NS vázány. Včetně jejich poruch. Nejsložitější biologická soustava s mimořádným postavením mezi ostatními. Neurofyziologie Molekulární neurovědy Neurofarmakologie Zobrazovací metody Bouřlivý rozvoj: Paměť Závislosti Deprese Neurodegenerativní poruchy Lokalizace mozkových funkcí Vědomí, kognice Přednostně řešené problémy: Brno: CEITEC https://www.ceitec.cz/vyzkum- mozku-a-lidske-mysli/rp8 Doktorské studium Neurovědy http://www.med.muni.cz/index.p hp?id=599 Pracoviště : Nobel prices related to neuroscience 1904 Ivan Petrovich Pavlov (Russia) "in recognition of his work on the physiology of digestion, through which knowledge on vital aspects of the subject has been transformed and enlarged" 1906 Camillo Golgi (Italy) and Santiago Ramón y Cajal (Spain) "in recognition of their work on the structure of the nervous system" 1914 Robert Bárány (Vienna) "for his work on the physiology and pathology of the vestibular apparatus" 1932 Sir Charles Scott Sherrington (Great Britain) and Edgar Douglas Adrian (Great Britain) "for their discoveries regarding the functions of neurons" 1936 Sir Henry Hallett Dale (Great Britain) and Otto Loewi (Great Britain) "for their discoveries relating to chemical transmission of nerve impulses" 1944 Joseph Erlanger (USA) Herbert Spencer Gasser (USA) "for their discoveries relating to the highly differentiated functions of single nerve fibres" 1949 Walter Rudolf Hess "for his discovery of the functional organization of the interbrain as a coordinator of the activities of the internal organs" 1949 Antonio Caetano de Abreu Freire Egas Moniz "for his discovery of the therapeutic value of leucotomy in certain psychoses" 1952 Physics: Felix Bloch (USA) and Edward Mills Purcell (USA) "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith" 1961 Georg von Békésy (USA/Hungary)"for his discoveries of the physical mechanism of stimulation within the cochlea" 1963 Sir John Carew Eccles (Australia), Alan Lloyd Hodgkin and Andrew Fielding Huxley (Great Britain) "for their discoveries concerning the ionic mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and central portions of the nerve cell membrane" 1967 Ragnar Granit (Sweden/Finland), Haldan Keffer Hartline (USA) and George Wald (USA) "for their discoveries concerning the primary physiological and chemical visual processes in the eye" 1970 Sir Bernard Katz (Great Britain), Ulf von Euler (Sweden) and Julius Axelrod (USA) "for their discoveries concerning the humoral transmittors in the nerve terminals and the mechanism for their storage, release and inactivation" 1973 Karl von Frisch (Germany), Konrad Lorenz (Austria) and Nikolaas Tinbergen (Great Britain) "for their discoveries concerning organization and elicitation of individual and social behaviour patterns" 1977 Roger Guillemin and Andrew Schally for their discoveries concerning "the peptide hormone production of the brain 1979 Allan M Cormack and Godfrey Newbold Hounsfield for the "development of computer assisted tomography„ 1981 Roger W. Sperry, for his discoveries concerning "the functional specialization of the cerebral hemispheres" 1981 David H. Hubel and Torsten N. Wiesel, for their discoveries concerning "visual system". 1991 Erwin Neher (Germany) Bert Sakmann (Germany) "for their discoveries concerning the function of single ion channels in cells" 1994 Alfred G. Gilman (USA) Martin Rodbell (USA) "for their discovery of Gproteins and the role of these proteins in signal transduction in cells" 1997 Jens C. Skou (Denmark) "for the first discovery of an ion-transporting enzyme, Na+, K+-ATPase" 2000Arvid Carlsson, Paul Greengard and Eric Kandel for their discoveries concerning "signal transduction in the nervous system 2003 Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield for their discoveries concerning magnetic resonance imaging 2004 Richard Axel, Linda Buck for their discoveries of odorant receptors and the organization of the olfactory system 2013 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof "for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic, a major transport system in our cells". http://nobelprize.org/medicine/laureates/1981/ 2014 John O'Keefe, May-Britt Moser, Edvard I. Moser. „For their discoveries of cells that constitute a positioning system in the brain". 2017 Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash and Michael W. Young "for their discoveries of molecular mechanisms controlling the circadian rhythm". Neurofyziologie Studium nervových a doprovodných buněk, způsobu jak jsou sestaveny do funkčních celků, které vedou, zpracovávají, ukládají informaci a zprostředkují chování. Eichler, K. et al. Nature 548, 175–182 (2017). Jak to může vypadat v praxi: Kombinace 3D schématu neuronové sítě a Eichler, K. et al. Nature 548, 175–182 (2017). Jak to může vypadat v praxi: světlem aktivovaných neuronů. Výsledkem je určitý pohyb a chování. Smyslová neurofyziologie Proč studovat smysly: Vrátka do vědomí, kontakt s vnějším světem. Určují chování. Používají obecné molekulární principy signalizace.  to, co se děje na membránách smyslových buněk a jak smyslové podněty zasahují do metabolismu buněk.  Paralely se známými signálními drahami diferenciace, imunity, apoptózy…  Společně využívané „vyzkoušené“ recepční a signální děje smyslů a buněčné komunikace Upozornění na: Schopnost organizmů rozpoznávat i nepatrné změny vnějšího prostředí a reagovat na ně v případě ohrožení je jednou z nejdůležitějších podmínek zachování života. Selekční tlak byl natolik silný, že schopnosti receptorů jsou často na samé hranici fyzikálních možností. Jednotlivé fotony, jednotlivé molekuly, pohyby nanometrových amplitud, nesmírně slabé elektromagnetické pole fascinují fyziology. Výzkum molekulární podstaty transdukčních mechanismů chemických signálů, mechanických podnětů, ale i např. infračervené detekce, elektrických polí nebo magnetického pole jsou výzvami fyziologii s velkým potenciálem pro aplikace. Proč smysly: Vstup do NS, potřeba rychlé motorická reakce, kontakt s vědomím. Kontakt se světem Předpoklad: některé buňky dokážou reagovat na různé formy energie (chemické, mechanické, elektromagnetické). Metabolická reakce se pak zobrazí jako změna elektrického membránového napětí. Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, růstový f. … VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Smyslový a ne-smyslový signál? Buněčné „oči“ a „uši“ Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Smyslový a ne-smyslový signál? Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Smysly jsou propojené s kůrou, mechanismy ale stejné Kapitoly z neurofyziologie smyslů – výběr kapitol Fyziologie membrán: - klidový potenciál - akční potenciál - iontové kanály - šíření signálů a synapse Fyziologie smyslů: - obecné principy - čich a chuť - hmat a sluch - zrak a další smysly Psychofyziologie: - zpracování zrakové informace - učení a paměť http://www.physpharm.fmd.uwo.ca/undergrad/medsweb/ http://entochem.tamu.edu/index.html http://web.neurobio.arizona.edu/gronenberg/nrsc581/index.html http://www.biol.sc.edu/~vogt/courses/neuro/neurobehavior.html http://instruct1.cit.cornell.edu/courses/bionb424/links.htm http://nelson.beckman.uiuc.edu/courses/neuroethol/ http://www.blackwellpublishing.com/matthews/default.html http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/neurophysiology/index.html Internet a něco z jeho neomezené nabídky: http://www.hhmi.org/biointeractive/click/index.html http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/neurobiology.html http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/animations01.02.html Materiály, prezentace, metody. Každý týden začneme 10minutovým rozborem zadaného článku Budete prezentovat ve dvojici. Hodnotit prezentaci budou Vaši spolužáci (a já). Čeho si všímat: - proč byl článek napsán? - základní myšlenka, hypotéza, jaká je otázka a způsob řešení? - na co přišli? - základní pohled na metody a nějaká metodická zajímavost - shrnutí „Pro media“ Jak s prezentacemi článků? Fyziologie nervových membrán: řeč elektrických potenciálů Předávání a zpracování informací: elektro - chemická spolupráce Znakem toho, že je buňka živá, je mimo jiné to, že lze na její membráně - mezi extra a intracelulárním prostředím - změřit rozdílnou koncentraci různých kladných a záporných iontů, projevující se elektrickým napětím, které nazýváme klidovým potenciálem. Ten je vlastní všem živým buňkám a pro většinu z nich trvalý a neměnný, ale u některých typů buněk (nervové, svalové), s tzv. vzrušivou membránou, existuje schopnost tento klidový potenciál velmi rychle měnit – generovat akční potenciály. Je elektricky nabitá membrána výlučně nervová vlastnost? Vztah chemické a elektrické řeči. Buňky používají k předávání informací chemickou řeč, jsou to chemické povely, které určují vývoj, diferenciaci, metabolismus buněk. Parakrinní. Na větší vzdálenosti u mnohobuněčných živočichů musela existovat dobře fungující cirkulační soustava nesoucí endokrinní signály. I v živočichovi s dokonalou cirkulací je ale důležité některé povely posílat přesně k cíli, ale hlavně rychle ... Jde o motorické reakce. …a to je úkolem nervové soustavy, přesněji řečeno buněk se vzrušivou membránou (nervové a svalové). Jinak se ovšem neurony v zásadě neliší, využívají stejné mechanismy signálních kaskád jako jiné buňky. Chemické látky na synapsí nebo i mimo synapse mají možnost ovlivňovat metabolismus neuronů. Náš mozek není jen soustavou elektrických spojů. Je to houba nasáklá hormonální polévkou. Neurony se tedy chovají jako jiné buňky – závislé metabolismem na chemické polévce kolem. Co umí navíc je, že převádějí ale některé chemické povely na elektrické signály. Vztah chemické a elektrické řeči. To, co je pro vzrušivé membrány typické, je schopnost generovat akční potenciály, ale k těm se sahá až tehdy, když už není třeba žádnou informaci zpracovávat a je třeba ji poslat velmi rychle na určité místo. Akční potenciál je velmi odolný vůči rušení a tedy nezpracovatelný. To, co se „vymyslí“, je vhozeno do e-pošty a už to nelze vzít zpět – dokud nenarazí na další přepojovací centrum v podobě synaptických propojení. Pro vzrušivé membrány se schopností rychlého a zacíleného vedení informací (akčních potenciálů, aktivně znovu a znovu generovaných) k tomu přistupuje řeč elektrických potenciálů místních (šířících se s velkým úbytkem jen v místě vzniku). Klasická elektrofyziologie Světlo ve službách neurofyziologie - optogenetika Larva zebrafish (Dánio). https://www.youtube.com/watch?v=lppAwkek6DI 1012 | VOL.11 NO.10 | OCTOBER 2014 | NATURE METHODS Světlo ve službách neurofyziologie - optogenetika Světlo ve službách neurofyziologie - optogenetika Studium nervového systému člověka in vivo. NMR (nuclear magnetic resonance) MRI (magnetic resonance imaging) BOLD fMRI (blood oxygen level-dependent) - Ale: Demystifying BOLD fMRI Data. The Scientist PET (positron emission tomography) http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/animations01.01.html http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/animations01.02.html http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/47155/title/New-and-Old- Techniques-in-Modern-Neuroscience/&utm_campaign=NEWSLETTER_TS_The- Scientist- Daily_2016&utm_source=hs_email&utm_medium=email&utm_content=36340549& _hsenc=p2ANqtz--IYy4TGk3YTmhWRL2t7ks01lk74vwPMI3zboP5ZMZ- pDpziw43kJkF41CampM1ogkW0iuZHr1LcLPSm9Iek0IwMln8EQ&_hsmi=36340549 / Membránový (klidový) potenciál Gibbs-Donnanova rovnováha Důsledkem přítomnosti nabitých částic v roztoku oddělených selektivně propustnou membránou, je přítomnost potenciálového rozdílu (napětí). Rovnováha, které se ustaví, výsledkem vyvážení osmotických a elektrostatických sil ovlivňujících ionty. Důsledkem pouhého uvěznění negativně nabitých velkých molekul v buňce, např. proteinů, je malý negativní potenciál. Pokud se ještě rozjede Na/K pumpa, ustavuje se nová rovnováha, která je opět kompromisem mezi elektrickými a koncentračními silami. Negativní napětí intracelulárně bude mnohem větší. Rovnováha animace Gibbs Donnanova rovnováha - animace Finální situace Na/K ATP-áza nabíjí membránu Ouabain Inhibitor Na/K pumpy Šípový jed rostlinného původu Při otravě se koncentrace srovnají a napětí pomalu zmizí Ouabain (from Somali waabaayo, "arrow poison„) also known as g-strophanthin, is a plant derived toxic substance that was traditionally used as an arrow poison in eastern Africa for both hunting and warfare. Ouabain is a cardiac glycoside and in lower doses, can be used medically to treat hypotension and some arrhythmias. K+: Na+: INTRA (-) EXTRA (+) KONCENTRACE NÁBOJ Rozdílné postavení iontů http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/ani mations02.01.html Rozdílné postavení iontů RT [ion]e Eion = ------ ln --------- zF [ion]i [ion]e Eion = 61mV log --------- [ion]i RT PK[K+]e + PNa[Na+]e + PCl[Cl-]i Er = -- ln --------------------------------- F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cl-]e Rovnovážný potenciál – pro daný iont Nernstova rovnice Goldman-Hodgkin-Katz rovnice R – plynová konstanta T – teplota F – Faradayova k. Dosadíte-li do N. rovnice gradient, vyjde Vám rov. potenciál Kdyby v buňce nebyly žádné jiné ionty nebo by je membrána nepropouštěla a naopak kdyby byla ideálně propustná pro uvažovaný iont, byl by celkový klidový potenciál membrány roven právě spočítaným rovnovážným potenciálům pro daný iont. Zjistíme, že rovnovážný potenciál iontu, který je nejlépe propustný, je určující pro celkový potenciál membrány a že přítomnost špatně propustného iontu vnáší do systému nerovnováhu, která může být využita při vyvolávání velmi rychlých změn při vzniku akčních potenciálů. V rovnici vystupují koncentrace a propustnosti jednotlivých iontů. Vyplývá z ní, že iont má tím větší vliv na membránové napětí, čím je jeho permeabilita větší. Vysvětluje se tak chování membrány (depolarizace a hyperpolarizace při změně propustnosti pro daný iont). Klidové membránové napětí Er tedy leží mezi rovnovážnými napětími všech iontů, přičemž příspěvek každého iontu je vážen jeho koeficientem permeability. Klidové napětí se pohybuje okolo -90mV, což je hodnota souhlasící s klidovými potenciály pro dobře propustné ionty K+ a Cl-. Protože ovšem i Na+ ionty mohou v malé míře procházet, je skutečné Er mírně menší. Zatímco u dobře propustných iontů K+ nebo Cl- se ustavuje bez problémů dynamická rovnováha s nulovým čistým tokem, přítomnost špatně propustného Na+ (100x menší propustnost než pro K+) vše mění, protože pro něj se rovnovážný stav ustavuje mnohem pomaleji a vnáší sem nerovnováhu: chtěl by dovnitř, ale nemůže. Síla, která žene iont přes membránu se jmenuje driving force nebo hnací síla (řídící napětí). Tato síla je určena rozdílem mezi stávajícím membránovým napětím Em a rovnovážným napětím Eion pro daný typ iontu. Například vtok kalciových iontů do buňky by se zastavil, až by uvnitř buňky stouplo kladné napětí na hodnotu rovnovážného napětí pro kalcium, tedy +130mV. Protože je ale uvnitř buňky -90mV, je Ca2+ hnáno dovnitř buňky silou 130+90=220mV. Ke vtoku ovšem nedojde, protože propustnost membrány pro tyto ionty je nepatrná. Podobně hnací síla pro Na+ je 157mV, zatímco pro dobře procházející K+ jen 4mV. Že existuje vůbec nějaká hnací síla pro K+ je důsledek mírného posunu Er do kladných hodnot v důsledku existující propustnosti pro Na+. Je jasné, že kdyby neexistoval nějaký mechanismus, který by obnovoval nerovnoměrné rozložení špatně procházejících iontů, po delší době by se ustavila rovnováha i pro ně, ale existují mechanismy, které nerovnováhu udržují, ovšem za spotřeby energie, nejdůležitějším je Na K pumpa. Existence nerovnováhy pro má zásadní význam pro vznik podráždění a vyvolání nervového signálu. Předávání informací nervovou soustavou může probíhat jen proto, že mezi vnějškem a vnitřkem nervové buňky existuje rozdíl potenciální energie pro Na ionty, na jehož udržování je ovšem potřeba iontovým pumpám neustále dodávat energii ve formě ATP (u některých buněk připadá na NaK pumpu až 70% celkové energetické spotřeby). https://neuroscience5e.sinauer.com/animations02.02.html Hnací síla = Driving Force -90mV – (Rovnovážný potenciál) Na: 157 mV K: 8 mV Ca: 219 mV ! Ionty odpovědné za vznik membránového potenciálu leží v tenké vrstvě u membrány. Počet kationtů, který je schopen přechodem membrány změnit napětí o 100mV je pouze 1/100.000 celkového počtu kationtů v cytosolu.  Stačí tedy malá a rychlá změna k AP.  Jeden AP koncentrace nezmění. Sherwood Jen 6 kationtů vně navíc na pozadí 440.000 iontů ostatních je schopno nabít membránu. Stačí tedy přemístit jen nepatrná množství a potenciál se výrazně změní. Klidový potenciál  Uložená energie pro řadu membránových „strojů“ (sekundární aktivní transport) signálů (Ca signály, fertilizace vajíčka).  V neuronech na generování, zpracování a šíření elektrických signálů:  Akční potenciál – vhodný pro dálkový, nezkreslený a rychlý přenos signálů  Místní potenciál – vhodný pro zpracování, syntézu, modifikaci informací Klidový potenciál Akční potenciál 50. léta http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/neu rophysiology/index.html Jak se dnes měří a jak vypadá? Informace, kterou přenáší, je zapsána do frekvence.  Buď nevznikne vůbec, nebo vzniká stále stejně velký.  Vznikne při určitém stupni depolarizace The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1963 "for their discoveries concerning the ionic mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and central portions of the nerve cell membrane" Sir John Carew Eccles Alan Lloyd Hodgkin Andrew Fielding Huxley 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize Australia United Kingdom United Kingdom Australian National University Canberra, Australia University of Cambridge Cambridge, United Kingdom London University London, United Kingdomb. 1903 d. 1997 b. 1914 d. 1998 b. 1917 Iontová hypotéza Vzniku AP Hypotéza, zvaná iontová, vysvětlující tyto děje na membráně nervových a svalových buněk byla rozpracována a dokázána anglickými vědci pozdějšími nositeli Nobelovy ceny Alanem Hodgkinem a Andrewem Huxleym současně s K. Colem a H. Curtisem v USA v poválečných letech, kdy značně pokročily možnosti elektrotechniky, zejména v konstruování citlivých elektronických obvodů. Jimi vyvinutá technika napěťového zámku (voltage clamp) umožňuje ovládat membránový potenciál a současně registrovat proudy tekoucí přes membránu v důsledku jeho experimentálních změn. Obě skupiny pracovaly na obřích nervových vláknech sépie a použily dvě podélné kovové elektrody, z nichž jedna po zavedení do axonu umožňuje řízení membránového potenciálu a druhá snímá proudy tekoucí přes membránu. Metoda je postavena tak, že se měří hodnota proudu, který je nutno na membránu dodávat, aby bylo udrženo určité uměle nastavené membránové napětí. Dodávaný proud kompenzuje iontové toky a jeho velikost je tedy s nimi shodná Hodkgkin & Huxley napěťový zámek, 1963. Dodávaný proud kompenzuje iontové toky tak, aby napětí zůstalo konstantní. Proud je registrován. Voltage clamp http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/voltage_clamp.html Jak zajistit, že měříme jen jeden iont a ne směs mnoha? Blokátory kanálů pomohou zaměřit se jen na určitý iont Na – TTX (Tetrodotoxin) – „ucpe“ ústí kanálu K – TEA (Tetraethyl amonium) Čtverzubec Tetraodon - fugu Nebo lze naplnit axon jen roztokem s vybraným iontovým složením. Když se použijí přirozené koncentrace Na a K, tvoří se přirozené AP. a) Záleží tedy hlavně na nich, b) energie je uložena v koncentraci, protože žádné jiné zdroje nejsou, c) membrána a její vlastnosti jsou podstatné pro vznik a šíření AP Voltage clamp ještě jednou Pro Na platí, že napětí -60mV je ještě podprahové a nevyvolá žádný proud iontů. Po překročení prahu, který je asi -50mV, vyvolá nastavení -30mV prudký vtok Na iontů do buňky, který ovšem nemá dlouhého trvání. Tato doba influxu se zkracuje s tím jak snižujeme negativní napětí směrem k 0mV. Nastavíme-li napětí na membráně dokonce na +60mV Na tok iontů se obrátí, protože jsme se dostali nad rovnovážné napětí pro Na. Pro K ionty je charakteristické, že s klesajícím membránovým napětím roste intenzita jejich výtoku z buňky ven mnohem pomaleji než pro Na, ale zato trvá mnohem delší dobu. Z takto stanovených iontových proudů přes membránu byl sestaven časový průběh propustnosti membrány pro oba ionty. Během vzestupné fáze Na propustnost značně převýší draslíkovou. Propustnost membrány pro Na je závislá na napětí a s klesajícím záporným napětím na membráně roste. Tím ovšem ještě více podpoří vtok Na iontů a další depolarizaci. Díky této pozitivní zpětné vazbě je dosaženo překmitu napětí velmi rychle. Dříve, než však membránový potenciál může dosáhnout rovnovážného potenciálu sodíku, začne působit samozavírací inaktivační mechanismus a propustnost membrány pro Na začne samovolně opět prudce klesat. Tento mechanismus je rovněž pozitivně závislý na hodnotě depolarizace a má proto charakter negativní zpětné vazby. Navíc se již díky rostoucí depolarizaci zvýšila i propustnost pro K, která je tedy také negativně zpětnovazebná, protože tlumí aktivující stimul. K uniká z buňky ven a tím vrací potenciál nitra buňky do záporných hodnot směrem k rovnovážnému potenciálu draslíku. Membrána tedy přešla od stavu převažující K propustnosti přes převažující Na propustnost opět k původnímu stavu. Akční potenciál kanály Propagace, Voltage clamp http://sites.sinauer.com/neuros cience5e/animations02.03.html Až 100.000 AP bez Na/K pumpy. RT [ion]e Eion = ------ ln --------- zF [ion]i [ion]e Eion = 61mV log --------- [ion]i RT PK[K+]e + PNa[Na+]e + PCl[Cl-]i Er = -- ln --------------------------------- F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cl-]e Rovnovážný potenciál – pro daný iont Nernstova r. Goldman-Hodgkin-Katz r. Až 100.000 AP bez Na/K pumpy. Koncentrace během jednoho AP zůstávají téměř stejné. Co se mění, jsou hodnoty propustnosti Pk, které řídí změny potenciálu Er. K čemu ještě voltage clamp? Když je potřeba zamezit zpětnovazebným dějům závislým na napětí, které by komplikovaly měření – možnost zmrazit napětí membrány. Lze tak řešit např. problémy: - Otevírají se Na nebo zavírají K kanály? - Když nás zajímají změny potenciálu při mechanickém fráždění vláskové buňky. Zamknutí membrány vyšachuje napěťově sensitivní kanály a iontové toky jsou důsledkem jen mechanické manipulace. Výsledek: Různé proudy přes membránu po pohybech cilií u různých hodnot „zamknutého“ napětí. Z polarity toků: Není to ani K ani jen Na, jsou to neselektivní toky kationtů. Aby mohla být Na propustnost opět prudce zvýšena, musí být při repolarizaci znovu dosaženo určité minimální záporné hodnoty, což však vyžaduje určitý čas. Během této doby - refrakterní fáze, která následuje těsně po podráždění ( asi 1ms), nelze vyvolat další akční potenciál. Frekvence AP je tudíž omezená. Elektrická vodivost membrány je překvapivě závislá na potenciálu, který je na membránu aplikován. Navíc se ukázalo, že membránové vodivosti pro ionty draselné a sodné jsou různé a na sobě nezávislé. Kinetiku aktivace a dezaktivace popsali H+H systémem nelineárních diferenciálních rovnic, všeobecně známých jako HH rovnice. Kanály a patch clamp Kanály – prostředek udržování integrity buňky a komunikace Často i mimo neurony: Hlídají objem, osmolalitu, pH, klidové napětí -> transport, signalizaci (Ca) Už jste se potkali s kanály? Buněčná migrace Increasing evidence suggests that ion channels and pumps are involved in the regulation of cell proliferation and migration, and channel proteins have been shown to form macromolecular complexes with cell adhesion molecules and other signaling proteins. …it is being increasingly suggested that regulation of ion channels and pumps could contribute to cancer progression. Frontiers in Cellular Neuroscience | www.frontiersin.org 1 March 2015 | Volume 9 | Article 86 Buněčnými receptory buňky „vidí“ své okolí. NS „vidí“ jen to, co zasáhne funkci kanálů. Vrátkované kanály nejsou jen na nervových buňkách !  Leukocyty, stejně jako rakovinové buňky mají napěťově vrátkované kanály  Parametium – trepka  Rostlinné buňky Nevrátkované – určují klidový potenciál Vrátkované – přijímají signály a řídí místní i akční potenciály – příjem a zpracování informace NS Kanály – prostředek udržování integrity buňky a komunikace Kanály – typy vrátkování Ligandem řízené: Ionotropní transdukce – receptor přímo na kanálu Ligand se váže extracelulárně (transmitter-gated) Metabotropní transdukce  Intracelulárně  Ion gated  Nucleotide gated  Fosforylací řízený Struktura – Transmembránové proteiny Rekonstrukce podle vlastností X ray krystalografie – prostorový vzhled proteinů tvořících kanály Proteinový krystal – obsahuje i 109 molekul a může přitom zůstat funkční X ray krystalografie – vzhled proteinu 4 domény, 6 segmentů  Citlivý na napětí  Selektivní  Schopný inaktivace Na kanál Citlivý na napětí Selektivní Polární vodný obal zabraňuje průniku přes membránu K iont nemůže být stabilizován jako Na a tak neprojde filtrem. Selektivita K+ kanálu Streptomyces Negativně nabité AK lákají kationty. Z cytosolu se pór otevírá do vestibulu. To umožňuje K iontům zůstat hydratované i v polovině membrány. V úzkém selektivním filtru řada O tvoří řadu dočasných vazebných míst pro dehydratovaný K. O atomy soutěží s vodními molekulami o vazbu na K. K musí ztratit svůj vodní obal a místo s vodou interaguje s O. Selektivita K+ kanálu Streptomyces Menší sodík nevstupuje, protože karbonylové kyslíky jsou příliš daleko na to, aby se kompenzovala energetická ztráta odhození vodního obalu. Schopný inaktivace Schopný inaktivace Proteáza aplikovaná intracelulárně zrušila inaktivaci – musí být intracelulárně Také K kanál je schopen inaktivace, ale později než Na. Tři stavy Na kanálu Refrakterní fáze kanálu – omezení frekvence AP Kanál musí projít fází repolarizované membrány aby byl znovu aktivovatelný Ne vždy je kanál pórem mezi 4mi doménami. Cl kanál je dimer, kde každá podjednotka má svůj pór. Jsou asymetrické a dohromady tvoří selektivní filtr. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991 "for their discoveries concerning the function of single ion channels in cells" Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie Goettingen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut für medizinische Forschung Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944 b. 1942 Patch Clamp – Technika, která „vidí“ kanály při práci Neher & Sackman Terčíkový zámek, 1991 Tepelné vibrace membrány a vibrace kanálu. Záznam koresponduje s fázemi AP Animace patch clamp https://www.jove.com/video/55627/electrophysiological-method-for-whole- cell-voltage-clamp- recordings?utm_source=joveglobal&utm_medium=email&utm_campaign=2 017newsletters062117 http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/50227/title/Robotic- Patch-Clamping-Gains-Eyes/&utm_campaign=NEWSLETTER_TS_The- Scientist- Daily_2016&utm_source=hs_email&utm_medium=email&utm_content=55 843454&_hsenc=p2ANqtz-_vNp_o-2- DPakc5dEQGZxQcKcyvfhvY827y8AWZ8NTN26AQt5MoFnRlA3X1Iz5upS 0lbVAMccbiDxONemRx0MyGAI66Q&_hsmi=55843454/ Pravděpodobnostní děj Roderick MacKinnon, M.D., a visiting researcher at the U.S. Department of Energy's Brookhaven National Laboratory, is a recipient of the 2003 Nobel Prize in Chemistry 'for structural and mechanistic studies of ion channels.‚ His research explains "how a class of proteins helps to generate nerve impulses – the electrical activity that underlies all movement, sensation, and perhaps even thought. The work leading to the prize was done primarily at the Cornell High Energy Synchrotron Source [CHESS] and the National Synchrotron Light Source [NSLS] at Brookhaven. The proteins, called ion channels, are tiny pores that stud the surface of all of our cells. These channels allow the passage of potassium, calcium, sodium, and chloride molecules called ions. Rapid-fire opening and closing of these channels releases ions, moving electrical impulses from the brain in a wave to their destination in the body."1 "Potassium channels act as both gateways and gatekeepers on cell membranes, controlling the flow of ions and enabling brains to think, muscles to move, and hearts to beat. Malfunctioning ion channels contribute to epilepsy, arrhythmia, and other diseases."2 Roderick MacKinnon and Ion Channels The Nobel Prize in Chemistry 2003 "for discoveries concerning channels in cell membranes" "for the discovery of water channels" "for structural and mechanistic studies of ion channels" Peter Agre Roderick MacKinnon 1/2 of the prize 1/2 of the prize USA USA Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, MD, USA Rockefeller University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute b. 1949 b. 1956 Kanály a metody mol. genetiky Vápníková komunikace a Ca kanály Calcium ions generate versatile intracellular signals that determine a large variety of functions in virtually every cell type in biological organisms, including the control of heart muscle cell contraction as well as the regulation of vital aspects of the entire cell cycle, from cell proliferation to cell death. In the nervous system, calcium ions preserve and, perhaps, even extend their high degree of versatility because of the complex morphology of neurons. In presynaptic terminals, calcium influx triggers exocytosis of neurotransmittercontaining synaptic vesicles. Postsynaptically, a transient rise of the calcium level in dendritic spines is essential for the induction of activity-dependent synaptic plasticity. In another cellular subcompartment, the nucleus, calcium signals can regulate gene transcription. Importantly, intracellular calcium signals regulate processes that operate over a wide time range, from neurotransmitter release at the microsecond scale to gene transcription, which lasts for minutes and hours. Thus, the time course, the amplitude, and, most notably, the local action site in welldefined cellular subcompartments are essential determinants for the function of intracellular calcium signals. Neuron 73, March 8, 2012 ª2012 Elsevier Inc. Vápníková komunikace a Ca kanály Ca metabolismus a vápníková komunikace, kanály Vizualizací Ca iontů lze měřit a lokalizovat aktivitu neuronů Vápníková signalizace in vivo Časné geny spuštěné aktivitou neuronů Ca aktivita Neuronů Fluorescenční stanovení Ca Ca v myokardu a jeho podíl na tvaru AP Ca v myokardu a jeho podíl na tvaru AP Ca oscilace Jak měřit změny intracelulárního vápníku Intracelulární vápník je centrální veličinou, na které závisí téměř všechny buněčné regulační mechanizmy. Volného intracelulárního vápníku je v buňkách nepatrně, a proto stačí přidat (nebo ubrat) jen mizivé množství, aby to vyvolalo okamžité a hluboké změny v jeho koncentraci. O tom se vědělo již dávno. Problém byl však v tom, že experimentální sledování změn tak nízkých vápníkových koncentrací není zrovna jednoduché. V 80. letech vyvinul Robert Tsien fluorescentní látky, zejména fura-2 a fluo-3, které mění své optické vlastnosti v závislosti na přítomnosti i nepatrných množství vápníku. Nové látky přinesly pokrok. Není třeba je do buněk složitě vpravovat. Před použitím se esterifikují, což jim dodá schopnost snadno prostupovat lipoidními membránami. Jakmile se takto dostanou do buňky, vrhnou se na ně intracelulární esterázy, látka je hydrolyzována a tím ztratí svoji lipofilní vlastnost. Zůstane tedy uvězněna v buňce jako v kleci. Prakticky probíhá sledování hladiny intracelulárního vápníku tak, že po inkubaci s některým z výše uvedených optických indikátorů jsou buňky umístěny pod speciálně upravený mikroskop, kde jsou střídavě osvětlovány dvěma vlnovými délkami. Na obě vlnové délky odpovídá indikátor fluorescencí (s maximem obvykle kolem 540 nm). Vtip je v tom, že na jednu vlnovou délku (většinou kolem 340 nm, záleží na typu fluorescenční látky) odpovídá hlavně ta část látky, která vytvořila s intracelulárním vápníkem komplex, při druhé (obvykle 380 nm) odpoví zbytek, tedy ta část, která zůstala volná. Změny hladiny vápníku poruší rovnovážný stav mezi látkou, která vytvořila s vápníkem komplex, a tou, která zůstala volná, a tím se také mění měřená fluorescence. Tato metoda dnes umožňuje sledování změn vápníku během různých experimentálních postupů. Kanály citlivé na jedy a anestetika  Eter používán jako celkové anestetikum (1846), nahrazen chloroformem, (toxicita), N2O,  Lidokain, Xylokain – lokální anestetikum, blokuje Na kanály a brání vzniku AP Na kanál a bolest 514 | SEPTEMBER 2015 | VOLUME 16 www.nature.com/reviews/neuro V lidském genomu je několik tisíc genů kódujících iontové kanály. Přes 150 jich kóduje napěťově citlivé kanály. Iontové kanály a rakovinné metastázy Rakovinné buňky projevující velkou schopnost metastázovat obsahují v membránách značný počet sodíkových kanálů (Na+) řízených napětím. Jestliže jsou sodíkové kanály zapojeny přímo do metastázové kaskády, pak by po jejich blokádě měla schopnost vytvářet metastázy klesnout. Když se metastázujícím nádorovým buňkám prostaty zablokují sodíkové kanály tetrodotoxinem, pohyblivost buněk klesne a také přestanou vysílat výběžky. Druhou vlastností metastázujících buněk je, že se na své cestě k novým místům osídlení „probourávají“ tkáněmi pomocí proteolytických enzymů. Vylučování enzymů i jiných látek je v buňce často spojeno s depolarizací, vyvolanou otevřením napěťově citlivých sodíkových a vápníkových kanálů. Tak se vylučují například neurotransmitery v mozku i na periferii a zřejmě i některé enzymy, které rakovinným buňkám otevírají cestu k tvorbě metastáz. A právě tetrodotoxin pomohl prokázat, že u jednoho typu prostatických nádorových buněk klesá vylučování exocytů po zablokování sodíkových kanálů. Zpomalí anestetika zhoubné bujení? František Vyskočil Publikováno: Vesmír 79, 312, 2000/6 Potenciál buněk a K-Ras signálování o tom.pdf Plasma membrane depolarization can trigger cell proliferation. By responding to voltageinduced changes in phosphatidylserine spatiotemporal dynamics, K-Ras nanoclusters set up the plasma membrane as a biological field-effect transistor, allowing membrane potential to control the gain in mitogenic signaling circuits. SCIENCE sciencemag.org 21 AUGUST 2015 • VOL 349 ISSUE 6250 Membránové napětí v řízení citlivosti na mitogenní signály.