‹#›
1
Rozdělení enzymů, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny NK
•A. Podle typu substrátu
•- DNA enzymy
•- RNA enzymy
•B. Podle typu reakce
•- enzymy syntetizující NK (anabolické) = polymerázy
•- enzymy odbourávající NK (katabolické) = nukleázy
•- enzymy modifikující NK
•- enzymy spojující molekuly NK = ligázy

‹#›
2
•
Enzymy syntetizující DNA

‹#›
3
•
Enzymy syntetizující RNA

‹#›
4
•
Katabolické enzymy

‹#›
5
•
Katabolické enzymy

‹#›
6
Enzymy modifikující DNA

‹#›
7
Enzymy spojující molekuly DNA

‹#›
8
Restrikční endonukleázy (RE)
•součást restrikčně modifikačních systémů bakterií
•omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech (např. fág namnožený v E.coli kmeni
C nemůže účinně infikovat E.coli kmen K – degradace fágové DNA)
•DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací
•původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem

‹#›
9
Restrikce bakteriofága

‹#›
10
Význam RE
•nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA •prostředek pro studium struktury, organizace,
exprese a evoluce genomu
•základ pro genové inženýrství

‹#›
11
Vlastnosti RE
•štěpí dvouřetězcové molekuly DNA ve specifických místech
•většina RE rozeznává palindromy (obrácené repetice)
•štěpí oba řetězce DNA
•rozdělují se do tříd I, II a III

‹#›
12
Tři třídy RE
•rozdělení založeno na způsobu štěpení, molekulové hmotnosti a požadavcích na kofaktory •RE třídy I
a III nesou v jediném proteinu aktivitu modifikační a restrikční •v genovém inženýrství se téměř
výhradně používají RE třídy II
•

‹#›
13
RE třídy I (EcoK, EcoB)
•vážou se na specifické sekvence
•katalyzují náhodné štěpení v místech vzdálených až několik 1000 pb od místa vazby
•molekulová hmotnost dosahuje cca 300.000
•zajišťují modifikaci (metylaci) i restrikci DNA
•vyžadují kofaktory ATP, Mg2+ a S-adenosylmetionin
•nevhodné pro analýzu sekvencí DNA nebo genové inženýrství

‹#›
14
RE třídy II
•vážou se na specifické (4-6 pb) sekvence nukleotidů
•katalyzují štěpení dvou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním
sousedství
•k štěpení dochází vždy ve stejném místě
•štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA •rozeznávací sekvence mají téměř
vždy charakter obrácených opakování: stejná sekvence je štěpena ve stejném místě v obou řetězcích
•molekulová hmotnost: 20.000 - 100.000
•kofaktor: pouze ATP

‹#›
15
Charakter cílových míst RE třídy II

‹#›
16
Orientace je důležitá

‹#›
17
Produkty štěpení RE
•tupé konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě)
•
•ostré konce (po štěpení řetězců v různých místech, která jsou obvykle vzdálena 1-4 nukleotidy)
• - 5´přečnívající
• - 3´přečnívající

‹#›
18


‹#›
19
Názvosloví RE
•např. EcoRI
•1. písmeno: počáteční písmeno jména rodu produkční bakterie •2. a 3. písmeno: první dvě písmena
jména druhu bakterie •označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) •římská číslice
vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z téže bakterie
•

‹#›
20


‹#›
21
Izoschizomery
•různé RE, které mají stejné cílové sekvence (odlišní producenti, většinou stejná reakce)
•izoschizomery mohou mít odlišnou citlivost k metylovaným bazím v cílové sekvenci

‹#›
22
Relaxovaná aktivita
(uvolněná, star-aktivita)
•schopnost RE štěpit kromě cílového místa také jiné - příbuzné sekvence
•
•většinou za neoptimálních reakčních podmínek

‹#›
23
Jednotka RE
•množství RE, které kompletně rozštěpí 1mg
•DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální
•teplotě a v optimálním prostředí

‹#›
24
Počet restrikčních míst  pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí

‹#›
25
DNA ligázy
•enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby mezi
5´fosfátovou skupinou jednoho řetězce a 3´OH skupinou druhého řetězce za spotřeby ATP nebo NAD
•fyziologický význam při replikaci, rekombinaci a reparaci DNA •analogické RNA ligázy katalyzují in
vitro podobné reakce při ligaci ssRNA

‹#›
26
Působení DNA ligáz

‹#›
27
Použití DNA ligáz
•příprava rekombinantních molekul DNA
•možno spojovat fragmenty DNA různého původu (restrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované
molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.)

‹#›
28
PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍCH MOLEKUL DNA
Přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení fragmentů DNA pocházejících z různých zdrojů

‹#›
29
Běžné typy DNA ligáz
•T4-DNA-ligáza
•izolace z buněk E.coli infikovaných fágem T4
•spojuje lepivé i tupé konce DNA
•opravuje jednořetězcové zlomy („nicks“) v dvouřetězcové DNAm RNA a u hybridů DNA/RNA •vyžaduje
přítomnost fosfátové skupiny na 5´konci a OH skupiny na 3´konci molekuly
•
•Bakteriální DNA ligáza
•izolace z E. coli
•spojuje jen DNA s lepivými konci

‹#›
30
Polymerázy
•syntetizují nukleové kyseliny postupným doplňováním nukleotidů k 3´OH konci stávající molekuly
nukleové kyseliny •není známá žádná polymeráza prodlužující 5´konec DNA •matricí (templátem) je
jednořetězcová DNA nebo RNA •polymerázy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce

‹#›
31
Polymerace DNA

‹#›
32
DNA polymeráza I (Kornbergův enzym)
•zdroj - E.coli
•katalyzuje 3 různé reakce:
•1. Polymerázová aktivita: Prodlužování polynukleotidového řetězce ve směru 5´- 3´
–matrice je čtena ve směru 3´- 5´
–tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3´OH skupiny rostoucího řetězce a 5´P dNTP za
tvorby pyrofosfátu
–požadavek přítomnosti primeru

‹#›
33
DNA polymeráza I (Kornbergův enzym)
•2. Exonukleázová aktivita 5´- 3´i 3´- 5´
–hydrolýza řetězce DNA v obou směrech
•
•3. Degradace DNA ve směru 5´-3´a současná syntéza degradovaného řetězce
–oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo
– („proof-reading“)
–využití při značení DNA („nick translace)
•

‹#›
34
Schématické znázornění tří aktivit DNA pol I

‹#›
35
Klenowův fragment DNA polymerázy I
•jeden ze dvou produktů proteolytického štěpení DNA polymerázy I subtilizinem
•polymerázová aktivita 5´- 3´
•exonukleázová aktivita 3´- 5´
•Využití: při značení DNA („fill-in“ 3´zkrácených konců a pomocí „random hexamers“)
•sekvenování DNA Sangerovou metodou
•syntéza druhého řetězce cDNA

‹#›
36
Terminální transferáza
•katalyzuje přidání deoxynukleotidů k 3´OH konci molekul DNA •substrátem jsou přečnívající,
zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA nebo ssDNA
•nevyžaduje matrici ani primer
•zdroj: telecí brzlík
•využití: přidání homopolymerních konců k 3´koncům DNA
•značení 3´konců DNA

‹#›
37
Příklad reakce katalyzované terminální
deoxynukleotidyl transferázou

‹#›
38
Výhody terminální transferázy
•možnost připojení dlouhých úseků komplementárních nukleotidů na 3´koncích vektoru a insertu
•velikost připojených úseků nemusí být stejná (pokud se jedná o úseky větší než 20 nukleotidů,
jejich párování je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě) •v
transformovaných buňkách se nespárované oblasti opraví reparačními mechanismy

‹#›
39
Připojení homopolymerních konců ke klonované DNA terminální transferázou

‹#›
40
Zpětná (reverzní) transkriptáza
•RNA-dependentní DNA polymeráza
•přepis genetické informace z RNA do DNA
•požadována přítomnost primeru a matrice
•poskytuje v první fázi hybrid RNA/DNA, po odstranění rna působením hydroxidů nebo RNázy H lze
zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA
•syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA polymeráza I
•
•zdroj: retroviry
•M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus)
•AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
•RSV (Rous Sarcoma Virus)

‹#›
41
Zpětná (reverzní) transkriptáza
•Aktivity:
•polymerázová
•5´- 3´exoribonukleázová
•3´- 5´exoribonukleázová (RNázaH)
•
•Využití:
•tvorba cDNA - specifická (primer oligo dT)
• - nespecifická (primer komplementární k 3´oblasti hledané mRNA)

‹#›
42
Syntéza cDNA

‹#›
43
Nukleázy
•Nukleáza Bal31
•katalyzuje průběžné odbourávání dvouřetězcové DNA od obou konců bez tvorby intramolekulárních
zlomů
•Aktivity:
•endonukleázová specifická pro jednřetězcovou DNA a RNA
•exonukleázová 5´- 3´
•exonukleázová 3´- 5´
•Podmínka aktivity:
•přítomnost iontů Ca2+ (možnost inaktivace chelatačními činidly)

‹#›
44
Nukleázy
•Nukleáza Bal31
•Zdroj:
•bakterie Alteromonas espejiana
•Využití:
•cílené zkracování DNA
•odstranění restrikčních míst
•zavádění delecí
•restrikční mapování

‹#›
45
Nukleázy
•Nukleáza S1
•endonukleáza specifická pro jednořetězcovou DNA
•Zdroj:
•bakterie Aspergillus oryzae
•Využití:
•odstraňuje jednovláknové struktury z DNA (odstranění nespárovaných smyček)
•hydrolýza jednořetězcových konců

‹#›
46
Mapování nukleázou
S1

‹#›
47
Nukleázy
•Nukleáza ExoIII
•katalyzuje postupné odstraňování 5´mononukleotidů z 3´OH konců dvouřetězcové DNA •na dvouřetězcové
DNA postupně odstraňuje jedno vlákno od 3´konce •funguje pouze na takové ds DNA, která má
5´přečnívající konce
•Zdroj:
•bakterie E.coli
•Využití:
•vytváření jednosměrných delecí
•příprava jednořetězcových substrátů pro sekvenování DNA dideoxy terminační metodou

‹#›
48
Nukleázy
•DNázaI
•nespecifická deoxyribonukleáza
•substrátem je dvouřetězcová i jednořetězcová DNA
•za přítomnosti kofaktoru Mg2+ jsou místa štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích •za
přítomnosti kofaktoru Mn2+ jsou přednostně štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě
•Zdroj: hovězí pankreas
•Využití:
•nízké koncentrace: vytváření jednořetězcových zlomů v ds DNA
•vyšší koncentrace: odbourání DNA z roztoků RNA
•

‹#›
49
Ribonukleázy
•
•Ribonukleáza A
•nespecifická ribonukleáza
•Zdroj: hovězí pankreas
•Využití:
•odbourání RNA z roztoků DNA
•Ribonukleáza H
•sekvenčně specifická ribonukleáza, rozpoznávající hybridní molekuly RNA:DNA
•

‹#›
50
Působení enzymů používaných při manipulaci s DNA