Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin •V nativním stavu z přirozeného materiálu –v dostatečném množství –požadované čistotě. •Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám –přečišťovací enzymy Materiál pro izolaci nukleových kyselin •Výchozím materiálem mohou být: –Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek) •Genomová •Plazmidová –Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány –Virové částice purifikované centrifugačními technikami –Nukleové kyseliny v elektroforetických gelech –Produkty PCR reakcí Metodické principy využívané při izolaci nukleových kyselin •Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením –Enzymů (lysozym a celulázy) –Detergentů (dodecylsulfát sodný) •Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant –Proteináza K nebo pronáza E –RNáza nebo DNáza •Kroky využívající různou rozpustnost –Fenolová extrakce –Adsorpce na pevný podklad •Centrifugace •Precipitace • Typy metod pro izolaci nukleových kyselin 1.Metody využívající rozdílné rozpustnosti •Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) •Obecně rozšířené, široké aplikace •Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK 2.Metody adsorpční •DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky •Vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů Typická fenolová extrakce •Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od nukleových kyselin. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. •Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny. •Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem. Účinnému vysrážení nukleových kyselin přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí. •Shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku. • ethanop precip principy izolace DNA II4 copy Základní složky roztoků •NaCl – iontová síla •Tris hydrochlorid – pufrovací činidlo •EDTA – chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz) Izolace plazmidové DNA •Výskyt u bakterií •Topologie molekuly –Dvouřetězcová DNA –Kružnicový tvar –Malá velikost –Více kopií v buňce •Metody založené na denaturaci a renaturaci –Alkalická lyze –Lyze varem Alkalická lyze pro izolaci plazmidové DNA 1.Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika 2.Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym) 3.Přídavek roztoku s NaOH •Denaturace bakteriálního chromozomu •ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU 4.Přídavek neutralizačního roztoku •Vysrážení chromozomální DNA s proteiny •RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA 5.Odstranění bakteriální DNA centrifugací 6.Purifikace plazmidové DNA Izolace RNA •Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly: –Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H2O, rukavice! –Extrakce v guanidinových solích –Extrakce Trizolem –Fenolové extrakce při pH 5-6 –Odstranění DNA DNázami bez RNáz –Selektivní srážení RNA pomocí LiCl –Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA Adsorpční metody •Využívají schopnost nukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979) –guanidin thiokyanát –guanidin hydrochlorid •Síla vazby závisí na –Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) –Iontové síle –pH roztoku •Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant •Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O •Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota ksgrafik.gif (18005 Byte) Mechanismus interakce DNA s oxidem křemičitým Izolace mRNA •mRNA tvoří pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná •Pro izolaci se využívají –Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, rRNA a tRNA –Metody využívající afinitu poly(A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy •Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA •Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem •Streptavidinem pokryté mikrozkumavky • •Streptavidinem pokryté magnetické částice • prod13b prod14c Analýza a kvantifikace •SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA –Vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou •Dostatečné koncentraci •Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant. –Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm. principy izolace DNA II6 copy