Elektroforetické separační metody •Princip –Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli –Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny •Cíl –Dělení molekul na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějím separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů Gelová elektroforéza •Základ •Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči •V případě nukleových kyselin bývá nosičem nejčastěji gel •Pro přípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají různou porozitu v závislosti na koncentraci gelu •Výhody •Elektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci •Dělit lze všechny důležité biomakromolekuly •Změnou podmínek lze dělit podle různých hledisek •Rychlost •Lze pracovat s mikrokvanty nebo preparativně v mikrogramových množstvích •Rozdělené molekuly lze snadno prokázat a ve funkční formě izolovat z gelu Používané nosiče •Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny –agarózou –polyakrylamidem •Vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry •Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru •Optimální velikost separovaných molekul –agarózové gely 100 bp až 50 000 bp –polyakrylamidové 10 až 1000 bp • • Uspořádání gelové elektroforézy •Horizontální • • • • •Vertikální “ ” “ ” Agarózové gely BEZJMÉ~1 BEZJMÉ~4 BEZJMÉ~3 Koncentrace agarózy Rozsah dělení ds DNA 0,3 % 5 – 60 kb 0,6 % 1 – 20 kb 0,7 % 0,8 – 10 kb 0,9 % 0,5 – 7 kb 1,2 % 0,4 – 4 kb 1,5 % 0,2 – 3 kb 2,0 % 0,1 – 2 kb Separační schopnosti gelu v závislosti na koncentraci agarózy Příprava agarózového gelu loading polymerized1 pouring [microwave] Bezjména-1 kopie Aparatura pro horizontální elektroforézu • ra_subcell1 GTElectrophoresisCells Příprava polyakrylamidových gelů •Složení: kopolymer akrylamidu a N,N,- metylenbisakrylamidu •Monomer je neurotoxin a mutagen •Katalyzátor – tetramethylethylendiamin (TEMED) •Iniciátor – persíran amonný (NH4)2S2O8 •Radikálová polymerace •V důsledku přítomnosti bifunkčního agens N,N,- metylenbisakrylamidu řetězce kroslinkují a vytvářejí gel • Koncentrace polyakrylamidu v gelu Rozsah dělení dsDNA 3,5 % 1000 – 2000 bp 5,0 % 80 – 500 bp 8,0 % 60 – 400 bp 12,0 % 40 – 200 bp 15 % 25 – 150 bp 20 % 6 – 100 bp Separační schopnosti elektroforetických gelů v závislosti na koncentraci akrylamidu Polyakrylamid Bezjména-9 + Bezjména-7 Aparatura pro vertikální elektroforézu Polyakrylamidové gely se připravují obtížněji než agarózové. Obvykle se lijí mezi dvě skla oddělená mezerníky. protean_fig_4 protean_fig_1 protean_fig_6 Bez názvu Typy polyakrylamidových gelů •Nedenaturující gely –Gely pro separaci dvouřetězcových molekul v nativním stavu –Jsou používany pro separaci malých fragmentů dsDNA a heteroduplexů •Denaturující gely –Gely separující jednořetězce –Jsou používány při sekvencování •Denaturující gradientové gely –Fragmenty DNA se pohybují gelem, v němž se zvyšuje koncentrace denaturačního agens •Močovina •Formamid –Používají se pro separaci stejně dlouhých fragmentů lišících se svou sekvencí •Nanášecí pufry slouží při elektroforéze NA –Zvýšení hustoty vzorku - to umožní, že DNA klesne na dno jamky –Obarvení vzorku pro snadnější nanášení –Přidání pohyblivého barviva do vzorku pro možnost sledování průběhu elektroforézy • •Rozdělení nanášecích pufrů –Založené na sacharóze –Založené na glycerolu –Kombinované – – Pufry pro nanášení vzorků Přehled pohyblivých barviv v nanášecích pufrech 0,5 – 1,4 % agaróza 4 % polyakrylamid 6 % polyakrylamid Xylencyanol 4 kb 170 bp 105 bp Bromfenolová modř 300 bp 40 bp 25 bp Oranž G 50 bp - - Bromkresolová zeleň Pouze pro alkalickou agarózovou elektroforézu 100 bp Migrace barviv je více ovlivněna nábojem než velikostí molekuly Používané elektroforetické pufry Pufr Zkratka Pracovní koncentrace Zásobní koncetrace Tris-acetátový TAE 1×: 0,04 M Tris-acetát 1 mM EDTA 50× Tris-fosfátový TPE 1×: 0,09 M Tris-fosfát 2 mM EDTA 10× Tris-borátový TBE 0,5×: 45 mM Tris-borát 1 mM EDTA 5× Alkalický 1×: 50 mM NaOH 1 mM EDTA 1× Tris-glycinový 1×: 25 mM Tris 250 mM glycin 0,1 % SDS 5× Provedení elektroforézy elfo •elfo.mov Elektroforetická pohyblivost DNA •Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. •Velikost fragmentu DNA o neznámé velikosti lze proto stanovit srovnáním jeho elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí fragmentů o známé velikosti, označovaných jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy. •Těmi bývají většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním, např, fága lambda. Vztah mezi velikostí DNA a její elektroforetickou pohyblivostí v agarózovém gelu gelconc Metody detekce •Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. •Molekuly DNA lze snadno zviditelnit –Přímým barvením vhodným barvivem •Nejjednodušší a nejlevnější •Barvivo se váže na DNA •Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů –Příklad: Spolehlivě detekovatelné množství DNA v proužku na gelu je 1-2 ng. Aby byl detekován fragment o velikosti 200 bp pocházející ze sekvence dlouhé 20 kb, musí být do jamky na gel naneseno 200 ng DNA. –Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA •Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence •Každý fragment má stejný počet konců, intenzita značky není závislá na délce fragmentu •Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky •Je citlivější než barvící metody, ovšem dražší –Hybridizací se značenou sondou – Fenantridinová barviva – Etidium bromid •Interkalační barviva vázající se bez sekvenční specifity na nukleové kyseliny s četností 1 molekula na 4–5 bp DNA •Mutageny a karcinogeny •EtBr a PI se váže jak na DNA, tak na RNA •Po vytvoření komplexu EtBr-DNA je pozorována ~20 - 30 × vyšší fluorescence •Citlivost 1-5 ng DNA, 5 ng RNA (254 nm) •Polyakrylamid zháší fluorescenci EtBr, není možné detekovat méně jak 10 ng DNA Structure: 2KB Etidium bromid (fenantridinium, 3,8-diamino -5-etyl-6-fenyl-bromid) Image Srovnání výsledků Amesova testu u EtBr a SYBR 1305dna eb Agarózový gel obarvený etidiumbromidem pozorovaný pod UV-světlem • Bez názvu 1 kopie Spectra: 15KB • vysoká afinita k NA • 1000× vyšší fluorescence po vazbě na NA • 25 – 100 × citlivější než EtBr • Vhodná pro ds DNA, ssDNA a RNA • 60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm) • mnohem méně mutagenní než EtBr Komerční kyaninová barviva - SYBR® Green a SYBR® Gold SYBR EtBr ob1ryxqz ob124a12 SYBR Green I SYBR Gold Barvení stříbrem •Barvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr •Citlivost 100 pg DNA v PA •dsDNA, ssDNA i RNA •Lepší citlivost vykazuje u polyakrylamidových gelů než u agarózových •Barvení zahrnuje 3 kroky: –Fixace (metanol, ledová kyselina octová a glycerol) –Barvení (uhličitan sodný, dusičnan amonný, dusičnan stříbrný a kyselina wolframovokřemičitá) –Zastavení (ledová kyselina octová) silver Dokumentace •Používané vlnové délky UV-světla –254 nm –302 nm –365 nm Bezjména-6 Pulzní gelová elektroforéza •Při konvenční gelové elektroforéze se molekuly DNA pohybují od katody k anodě přímočaře a plynule a rychlost pohybu je úměrná jejich velikosti. •Rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. •Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb. •Větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí a nerozdělí se. •K jejich separaci se využívá pulzní gelová elektroforéza. •Gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v časových intervalech periodicky mění. •Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. •Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. •Techniky pulzní elektroforézy se využívá k separaci neporušených molekul DNA (např. chromozomů kvasinek) nebo restrikčních fragmentů o velikosti několika megabází. Horní limit velikosti separovaných molekul je 6 000 – 10 000 kb. • Základní termíny týkající se PFGE •Pulzní pole (pulsed field). Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují. •Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time). Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno. •Reorientační úhel (reorientation angle). Úhel mezi dvěma střídajícimi se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují. •Homogenní pole (homogeneous field). Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli. • PFGE-reoruhel Princip separace molekul v pulzním poli •A. Molekuly DNA o různých velikostech v prostředí bez elektrického pole •B. Separace molekul v konvenční gelové elektroforéze (molekuly o velikosti 50 - 500 kb se pohybují stejnou rychlostí) •C. Při pulzní elektroforéze je elektrické pole E1 přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby mohla DNA ve směru druhého pole migrovat, musí se nejdříve reorientovat ve směru u nového pole. Čím jsou molekuly větší, tím delší dobu spotřebují ke své reorientaci, a dochází tak ke zpomalení jejich pohybu. •Pokud jsou obě pole stejná (směr, napětí, pulzní časy), bude výsledná dráha pohybu přímá, složená z jednotli- vých !cik-cak“ kroků. • PFGE-princip1 Pohyb DNA v agarózovém gelu při PFGE PFGE-princip2 Používané standardy velikostí pro PFGE •Konkatemery plazmidů •Konkatemery DNA fága lambda –Velikost monomeru 48,5 kb •Makrorestrikční fragmenty bakteriálních genomů –Staphylococcus aureus –Escherichia coli •Chromozomy kvasinek –Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) –Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb) –Hansenula wingei (1,0-3,1 Mb) –Candida albicans (1,0-4,0 Mb) •Chromozomy Dictyostelium discodium (3,6-9,0 Mb) •Chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb) CHEF MAPPER50 copy kopie 25-90 s 1 800 s 60-120 s Pulzní časy Kapilární gelová elektroforéza •CGE.AVI ce-animation •Kapilární gelová elektroforéza (CGE) je proces umožnující elektroforetickou separaci nukleových kyselin na základě jejich velikosti. •CGE relativně malých fragmentů DNA se provádí v povrchově modifikovaných křemenných kapilárách. •Horní limit velikosti separovaných molekul je 50 kb. Použití kapilární gelové elektroforézy •Pro CGE jsou používány dva typa gelů: –relativně vysoce viskózní gely chemicky ukotvené na stěnu kapiláry (chemické gely) –roztoky polymerů s relativně nízkou viskozitou (fyzikální gely) •CE má následující využití v diagnostice na úrovni nukleových kyselin: –Kvalitativní a kvantitativní kontrola oligonukleotidů –Kvantifikace genové exprese –Detekce sond hybridizujících s DNA v kapiláře –Studium interakce DNA s proteiny –Genotypizace –Automatické sekvencování nukleových kyselin CE-chart-genotyping Příklad elektroforetogramu z kapilární elektroforézy