Translace - překlad genetické informace
Složky translačního aparátu:
• mRNA
• 20 standardních aminokyselin (+ SeCys. Pyrrolyzin))
• molekuly tRNA
• aminoacyl-tRNA-syntetázy
• ribozomy
• translační faktory: IF, EF, RF
• ATP, GTP
Struktura molekuly tRNA
attached amino acid íPhe)
3' end
T loop
G A C A C/ iji ii b ii-ir
v .c-s T \\t ^/
anticodor loop
anticodon
a clover leaf
(A)
(Bi
{C í
5' GCGGAUUUAGCUCij P)
5AGCGCCAGA
:UGGAGGUCCUGUGTWCGAUCCACAGAAUUCGCA
3'
anticodon
Sekundární struktura tRNA
3- aa
(9 akceptorové rameno
PARAKODON
pseudouridinové rameno
dihydrouridinové rameno
DHU-smyčka\
f5
(An
>m
	variabilní 5) smyčka
	
antikodonové rameno
Vazby, kterými vzniká terciární struktura tRNA.
černo kroužky = standardní nukleotidy šedé kroužky = neobvyklé nukleotidy
Srovnani struktury prokaryotickeho a eukaryotickeho ribozomu
70S
Prokaryoticky ribozom
MW 2,500,000
30S
MW 1,600,000
/ \
5S rRNA 23S rRNA
MW 900,000
/
120 nucleotides
2900 nucleotides
16S rRNA
1540 nucleotides
34 Droteins
L
21 proteins
s
SOS
Eukaryoticky ribozom
5S rRNA
120
nucleotides
28S rRNA       5.8S rRNA
4700 nucleotides
160
nucleotides
MW 1,400,000 1
18S rRNA
1900
nucleotides
-49 proteins
L
-33 proteins 4
s
Sekundární struktura 16S rRNA E. coli
5
Struktura molekul rRNA (5S a 23S) ve velké ribozomové podjednotce bakterií stanovená rentgenovou krystalografií
Trojrozměrná struktura rRNA a L1 proteinu v poměrné velikosti
Schema sekundární struktury 23S rRNA
Peptidyltransferázová aktivita 23S rRNA - ribozymu
0 1-™-
None    I      II      III     IV     V VI
Domain left out of the reaction mixture
Purifikovaná 23S rRNA z E. coli katalyzuje vytvoření peptidové vazby mezi aminokysleinami vázanými na
tRNA za tvorby dipeptidu
Schopnost šesti domén 23S rRNA tvořit peptidovou vazbu.
Odstranění domény V vedlo k neschopnosti vytvořit peptidovou vazbu, tj. tato doména má při vytváření peptidové vazby klíčovou funkci
Struktura velké podjednotky bakteriálního ribozomu
Šedě = 5S a 23S rRNA; žlutě: L proteiny
rRNA zodpovídá za:
1. Strukturu ribozomu
2. Interakci tRNA s mRNA při translaci
3. Katalýzu peptidové vazby
8
Struktura ribozomu E. coli s vyznačením funkčních míst
schéma ribozomu 70S
£ neboli místo   P neboli peptidylové   A neboli aminoacylové exitu tRNA        vazebné místo vazebné místo
Standardní genetický kód
Kodony					
První nukleotid	Druhý nukleotid				Třetí nukleotid
	U	C	A	G	
U	Phe	Ser	Tyr	Cys	U
	Phe	Ser	Tyr	Cys	C
	Leu	Ser	N	N nebo Secys	A
	Leu	Ser	N (pyrrolyzin)	Trp	G
C	Leu	Pro	His	Arg	U
	Leu	Pro	His	Arg	C
	Leu	Pro	Gin	Arg	A
	Leu	Pro	Gin	Arg	G
A	lle	Thr	Asn	Ser	U
	lle	Thr	Asn	Ser	C
	lle	Thr	Lys	Arg	A
	Met nebo 1	Thr	Lys	Arg	G
G	Val	Ala	Asp	Gly	U
	Val	Ala	Asp	Gly	C
	Val	Ala	Glu	Gly	A
	Val	Ala	Glu	Gly	G
Kodonové rodiny jsou vyznačeny modře; N = nesmyslný kodon; I = iniciační kodon; Secys = kodon pro selenocystein, UAG = pyrrolyzin
Čtení genetického kódu molekulami tRNA
20 standardních aminokyselin 1
20 aa-tRNA-syntetáz
1
22-45 molekulárních druhů tRNA (tj.antikodonů) 61 kodonů se smyslem
a1 a2
| / \
tRNA tRNA! tRNA2   (2 antikodony)
| / \    / \      Kolísavé párování bází
1 kodon 4 kodony
11
Kolísavé párování bazí na 5'antikodonu tRNA
\
I Antikodon
'* -»-J 5'
T*
i i i
AGG U C
5'1
■ ♦
■ ♦
U/C
tRNA (antikodonové rameno)
Kolísavá pozice
(první báze antikodonu)
3'
Kodon ^	Třetí pozice kodonu	
Jedna tRNA:         AGG (antikodon) Dva kodony:   UCU UCC		
12
Možnosti čtení třetího nukleotidu kodonu podle pravidel kolísavého párování bází
První nukleotid antikodonu	Třetí nukleotid kodonu	Možnost čtení	Organizmy
u	UCAG	Kodonové rodiny	Mitochondrie, Mycoplasma, chloroplasty
o5U	UAG	Kodonové rodiny (Ser UCN, Val, Thr, Ala)	Eubakterie
mem5U	AG	Dvoukodonové sady	Mitochondrie, bakterie, eukaryota
m5s2U	A(G)	Dvoukodonové sady	Eubakterie, eukaryota
G	UC	Dvoukodonové sady	Všechny
G	uc	Kodonové rodiny	Bakterie
Q	UC	Dvoukodonové sady	Eubakterie, eukaryota
Hyp	UCA	Arg CGN	Eubakterie
Hyp	UCA	Kodonové rodiny kromě Gly GGN	Eukaryota
A	U	Thr ACU, Arg	Mycoplasma, mitochondrie kvasinek
C	G	Všude	Všechny
Hyp = hypoxantin;  Q = queozin 05U = uracil-5-oxyoctová kyselina;  m5S2U = 5-metyl-2-tiouracil;
mem5U = 5-metylkarbonylmetyl-2-tiouracil;
Kolísavé párování bází mezi antikodonem CGI v tRNA třemi odlišnými (synonymními) kodony
Čtení kodonů pro serin molekulami tRNA
Kodon tRNA Antikodon
UCU
tRNASeri AGG + kolísání
UCC UCA
tRNASer2 AGU + kolísání
UCG AGU
tRNASer3 UCG + kolísání
AGC
Izoakceptorové tRNA jsou tRNA o různých antikodonech
vázající tutéž aminokyselinu
15
Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprimovaných genů u E. coli
Leu
26
33
-* 3
345
73
69 22 294
67
262
156
118
Met
140
27 130
Val
192
41
119
108
66
.'48
83 123
Pro
21
2
29
46
26 162
45 101
Thr
103
137
15 28
46
119
32 76
Ala
173
48
37
178
119 12Ô
107 149
His {
Gin
19
75
38 169
95
59 90 166
Asn,
Lys
13
159
101
98
259 106
163 44
Asp
Glu
1 16
204
333 1 06
183
, 106 210 98
Arg
223
101
99
133
27 42
Ser
Arg
10
49
3 1
56 61 28 17
Gly
226
174
124
140
14
42
66
U
c
A G
U C A G
U
C A G
Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory.
Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a B-laktamázu.
Kodony, které jsou čteny jen jedinou tŔNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. 1(
Klasifikace aminoacyl-tRNA-syntetáz
První třída (acylace na C2')		Druhá třída (acylace na C3')	
Specificita pro aminokyselinu	Počet podjednotek	Specificita pro aminokyselinu	Počet podjednotek
Arg	monomerní	Ala	tetramerní
Cys	monomerní	Asn	dimerní
Gin	monomerní	Asp	dimerní
Glu	monomerní	Gly	tetramerní(a2p2)
Ne	monomerní	His	dimerní
Leu	monomerní	Lys	dimerní
Met	dimerní	Phe	tetramerní(a2p2)
Trp	dimerní	Pro	dimerní
Tyr	dimerní	Ser	dimerní
Val	monomerní	Thr	dimerní
Např: tryptofanyl-tRNA-syntetáza
Bez ohledu na společnou funkci jsou syntetázy strukturně odlišné
Translace probíhá ve dvou etapách:
1. mimoribozomové (připojení aminokyseliny k její tRNA pomocí aminoacyl-tRNA-syntetázy)
2. ribozomové (na ribozomech jsou přiřazovány aminokyseliny podle sledu kodonů)
Ribozomová etapa má tři fáze:
1. Iniciace translace
2. Elongace polypeptidového řetězce
3. Terminace translace
1. Mimoribozómová etapa: Nabíjení tRNA aminokyselinou
1. Vytvoření aminoacyladenylátu        2. Přenos aminokyseliny na tRNA
aa + ATP-► aminoacyl-AMP + PPi aminoacyl-AMP + tRNA-►aminoacyl-tRNA + AMP
19
Aktivace aminokyseliny aminoacyl-tRNA-syntetázou
AMP
Vznik aminoacyl-tRNA působením aminoacyl-tRNA-syntetázy
Eniymc
/ Ani mo
acid site
ATP site
n ■
7 H-C-NH2
O"
o-p=o o
□
Adenosine
R
H CNHj
0 ' ^P=0 H o
ft
3 vazebná místa na aa-tRNA-syntetáze
1.    aa + ATP --- aa-AMP + PP Vznik
aminoacy laděny látu
2.    aa-AMP + tRNA vznik aa~tRNA
tRNA s nabitou aminokyselinou
Vazba správné tRNA je stabilizována konformační změnou enzymu, která umožní rychlou aminoacylaci. Pokud je navázána chybná tRNA, ke konformační změně nedojde. Výsledkem je pomalejší reakce
a disociace tRNA.
Přenos na ribozom
21
Ribozomová etapa translace - 3 fáze
1. Iniciace translace - vazba mRNA a první aa-tRNA na ribozom
2. Elongace polypeptidového řetězce - průběžné přiřazování aminokyselin do rostoucího polypeptidového řetězce podle kodonů na mRNA
3. Terminace translace - zakončení syntézy polypeptidového řetězce, odpoutání mRNA z ribozomu a jeho rozpad na podjednotky
22
Zařazování metioninu do polypeptidu během iniciace translace a během její elongace u prokaryot - odlišné vlastnosti tRNA vázajících Met
Podobá se spíše peptidyl-tRNA
formyl
fMet-tRNAfMet
IF2
30S
Vazba na iniciační kodon AUG v P místě r bozomu
Kompletní ribozom, vazba v A-místě
Vazba na kodon AUG pro Met uvnitř genu
fMet—protein
Deformylace (deformyláza)
fMet (aminopeptidáza)
23
Metionin je po vazbě na fmet-tRNAi formylován na formylmetionin, který je po začlenění do polypeptidu deformylován na metionin, který může být následně z N-konce polypeptidu odstraněn
h
h n- c 2
blokuje NH2-skupinu
cooh
ch
h n
h c
formyl
cooh
h
i
ch transformyláza
ch
ch
ch
metionin
s
ch
N-formylmetionin
deformyláza
aminopeptidáza
K formylaci metioninu dochází také u mitochondrií a chloroplastů
24
A)
Struktura iniciátorové tRNA
Formylated amino acid
Met I
A C C A
G-C
formylace
C G G
CG G-C
G-C u A
G-C C G G C C
o 1(111
s       GU U G G_, G        C T¥ C
A A
CG AG C • i • i
GCUC
Ur   nA        G A 0 aD U-A
U G G
G-C G-C <■
G-C
C A
U A
C . U A
B)
Formylace metioninu na iniciátorové tRNA
H
11
CH3SCH2CH2-C-NH2 I
c=o
I
.o
CH3SCH2CH2 - C - NH - C - H 1 "
c=o o
I
Met-tRNA,
f
10-formyl tetrahydrofolate
Sekvence
umožňující vstup do P místa
-x
N-formyl-Met-tRNAf tetrahydrofolate
25
Tři fáze translace u prokaryot
Elongation factor G and GTP
Iniciace translace u prokaryot (E. coli)
Vazba mRNA na 16S-rRNA (u bakterií)
3'
RNA
5'
AUUCCUCCACUAG
i   i   i   i   i   i   i   i   i   i i
G G U G A U C
16S-rRNA
A G G A
A U G
Shineova-Dalgarnova sekvence I RBS
Iniciační kodon lokalizován v P místě
Shineova-Dalgarnova translační sekvence iniciační kodon
mRNA        i-A-1 r^S
5' "AACAC AUUAUCC       UCGACUCGTAU 3'
3-' oblast ^UUGGCGUCCAAGGGGGAUGCCAA 5'
16S párování bází konec
rRNA
Vazba m RNA na 16S-rRNA
AUUCCUCCACUAG
I      I      I      I      I      I      I      I      I      I I
G G U G A U C
16S-rRNA
A G G A
A U G
Shineova-Dalgarnova sekvence
RBS
Iniciační kodon lokalizován v P místě
mRNA
Shineova-Dalgarnova translační sekvence iniciační kodon
5' "AACAC AUUAUCC       UCGACUCGTAU 3'
0^ *CĹ
3'
16S rRNA
V
oblast párování bází
GGGGAUGCCAA 5'
konec
Elongace polypeptidového řetězce (1)
30
Elongace (2)
pokr. předchozího obrázku
	E P				
	GjC ť U C C SE				
Opakování kroků 1-3
Translokace ribozomu o jeden kodon
31
Elongační fáze translace
1. aa-tRNA (druhá a všechny další) vstupuje do místa A a váže se svým antikodonem na kodon mRNA v A místě
2. Vytváří se peptidová vazba mezi poslední aminokyselinou rostoucího polypeptidu
a aminokyselinou vázanou na tRNA, která se posunuje do místa P. Začíná translokace ribozomu.
3. Ribozom se posunuje na mRNA o jeden kodon, prázdná tRNA ze uvolní z místa E
4.  Do místa A vstupuje další aa-tRNA
Účast translačních faktorů při zajištění přesnosti translace
1. aa~tRNA pevně vázaná na EF-Tu se přechodně váže s kodonem v A-místě 30S.
2. aa~tRNA se nachází v hybridním místě, párování kodon-antikodon vede k hydrolýze GTP navozené EF-Tu. Chybné zařazení tRNA zpomaluje hydrolýzu a aa~tRNA tak může opustit ribozom ještě před vytvořením peptidové vazby. Časový prostoj mezi vazbou aa~tRNA na kodon a její dostupností pro elongaci zvyšuje přesnost translace
3. V případě zařazení správné aa~tRNA dochází k disociaci EF-Tu a aa~tRNA se tak dostává do místa A a může se účastnit elongace peptidového řetězce.
4. Na ribozom do (nebo poblíž) místa A na 50S se váže EF-G +(GTP) a urychluje pohyb tRNA do hybridních míst A/P a P/E.
5. Kontakt EF-G s ribozomem stimuluje GTP-ázovou aktivitu EF-G - dochází ke konformační změně EF-G, pomocí níž je tRNA přesunuta z hybridního místa A/P do místa P a proces translace tak posune o jeden kodon = translokace ribozomu.
Rychlost syntézy: 2-20 aminokyselin/sec
Terminace syntézy polypeptidového řetězce
Termínace translace
1. Do místa A se dostává terminační kodon na mRNA
2. V místě A se na terminační kodon váže terminační (uvolňovací) faktor (RF1,RF2 n. RF3
3. Změna aktivity peptidyltransferázy vede k uvolnění karboxylového konce peptidového řetězce z P místa, volná tRNA se přesouvá do E místa a opouští ribozom
4. Ribozom disociuje na podjednotky, které se mohou účastnit dalšího cyklu translace
Struktura lidského terminačního faktoru eRFI a jeho podobnost s molekulou tRNA
terminační faktory = molekulární mimikry
36
Zakončení translace molekulou tmRNA
tmRNA (transfer/messenger RNA)
mRNA s neúplnou délkou - chybí STOP kodon „krátká zpráva
Pozastavený ribozom na mRNA
Short message (~10aa)
rava >
age X
Stop codon
tmRNA nesoucí alanin (~ alanyl-tRNA)
navázaná v A místě
ribosome stalled on broken mRNA
H2N
broken RNA rejected     » -«---
***** 1
elongation resumes using codons of tmRNA
XXX
incomplete protein 11-amino acid tag
Degradace peptidu specifickou tag-proteázou
Inkorporace selenocysteinu do polypeptidového řetězce - čtení bifunkčního kodonu UGA
serine
A C U
seryl-tRNA synthetase
selenocysteine tRNA
SELB
se lenocystei ne-specif ic translation factor
UUl) A C U
serine enzymatically converted to selenocysteine
A C U
Speciální tRNASec
selenocysteine added to growing peptide chain
Potenciální stop kodon UGA
Speciální sekvence pro SELB (Element SECIS)
Vnášení tRNA-sec na vnitřní stop kodon UGA
a) U bakterií
b) U savců
^_ Single prótěiil
binds tRNA-Sec and šlem - loop
mRNA
Vlásenka je součástí kódující sekvence mRNA
I!
H,N—C — COOK
' i
CH
CH,
OH
serin
n
Cysteine
h
m RNA
Vlásenka je součástí 3'netranslatované mRNA
IIcN — C — COOH
CH,
11
SEt.EXOCYSTEINE
Translace u eukaryot
1. na čepičku na mRNA se postupně navážou elF-4F, elF-4A, a elF-4B (dohromady tvořící CBP-protein)
2. Je vyhledán iniciační kodon a Met-tRNAmet je umístěna proti němu (v P místě)
3. Uvolní se iniciační faktory a připojí se podjednotka 60S
4. Začíná fáze elongace EF-1 a EF-2 (analogy EF-Tu, Ts)
. iniciační tRNA
malá ribosomální podjednotka s navázanými iniciačními taktory
vazba mílNA
mRNA
AUG
čepička RNA
Met
iniciační tRNA se pohybuje poděl mRNA, a hledá první triplet AUG
faktory disociují
naváže se velká ribosomalní podjednotka
navaze se aminoacyl-tRNA (1. krok)
tvoří se první peptidová vazba (2. krok)
elF4A a B se podílejí na rozmotání sekundární struktury mRNA
elF6 udržuje ribozom v disociovaném stavu
1. u baktérií se iniciační komplex tvoří přímo na sekvencích ohraničujících AUG
2. u eukaryot nejdříve 40S rozpozná 5' konec mRNA a pak se pohybuje k iniciačnímu místu, kde se spojuje s 60S
elF-2
Is— initiator tRNA
small rlbosomal subunit with initiator tRNA bound
AAAAAAAAI^^ IMG *
AUG
INITIATOR tRNA MOVES ALONG RNA SEARCHING FOR FIRST AUG
Iniciace translace u eukaryot
eIF-4G je vázán na polyA-konec RNA a na eIF-4E vázaný na čepičku =
překládány budou jen mRNA s úplnou délkou
Met i
•9
AUG
Pí +
elF-2 AND OTHER INITIATION FACTORS DISSOCIATE
FIRST PEPTIDE BOND FORMS (step 21
41
Standardní signální sekvence exportovaných proteinů
Pozitivní
doména     Hydrofobní doména        Oblast štěpení     zbytek proteinu
r
místo stepem
vedoucí (signální) peptidáza
42
Kotranslační export proteinů u bakterií
43
Syntéza extracelulárních a membránových proteinů
preprotein = polypeptid se signálním peptidem na N-konci
mRNA ribosom
signál
rozeznávající částice {SRP)
signální sekvence na rostoucím polypeptidu
SRP odstraněn a recyklován
„ní,     ;;,„ ;;;■„ -.-.i.-
receptor pro SRP v membráně ER
translokační kanál
CYTOSOL
LUMEN ER
44
Translokace proteinu membránou do vnitřního prostoru endoplazmatického retikula
zbytek
polypeptidového řetězce
signální sekvence
translokační kanál
signální peptidáza
NH;
CYTOSOL
			•3	1 ■   m ■ w 1	
; \:......-j				P-....-------         11 .......!!!!,. I-U.U i.iS	
LUMEN ER
COOH
COOH
45
Začlenění transmembránového proteinu do membrány ER
CYTOSOL
^COOH
Posttranslační procesy
1. Kotranslační úpravy
* deformylace
* odštěpení aminokyselin z N-konce aminopeptidázou
* chemické modifikace aminokyselin (hydroxylace, fosforylace, acetylace, aj).
* tvorba disulfidových můstků - vznik terciární struktury
* připojení cukerných zbytků (oligosacharidů) - glykozylace, vznik glykoproteinů
* vznik sekundární a terciární struktury
2. Posttranslační úpravy
* vy štěpení peptidů (proinzulin > inzulín)
* tvorba kvarterní struktury (spojování protomerů do aktivních oligomerů)
* přidání prostetických skupin, koenzymů apod. (hemoglobin)
* posttranslační štěpení polyproteinů (polypeptidový prekursor > peptid, např. ACTH)
* proteinový sestřih (vyštěpení IVPS - intervening protein sequence), vytvoření nové peptidové vazby
3. Sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur
(nekovalentní interakce mezi rozpoznávacími místy polypeptidových řetězců)
* tvorba organel (membrány aj)
účast chaperonů a chaperoninů při sestavování struktur
4. Samosestavování (spontánní seskupení proteinových podjednotek)
* ribozomy
* morfogeneze virů (sestavení virových kapsidů)
47
Modifikace aminokyselin
Dekódováním m RNA při translaci je možno do bílkoviny vybrat jen asi 20 aa - z bílkovin lze však vyizolovat až 100 různých modifikovaných forem aminokyselin:
hydroxylovaný p roli n a lyzin fosforylovaný serin, treonin, tyrozin karboxylovaná kys. glutamová acetylovaný lyzin metylovaný lyzin a prolin adenylovaný tyrozin glykozylované zbytky modifikace lipidickými zbytky
* zbytky nenasycených mastných karbonových kyselin (acylace: 12C - laurylace,
14C - myristylace, 16C - palmitylace)
* zbytky polyizoprenového charakteru (iso/prenylace: 15C - farnesylace,
20C - geranylgeranylace)
Mnohé modifikační enzymy se nacházejí v ER a Golgiho Mikrozomální aparátu, někdy však dochází ke změnám až mimo buňku. frakce
48
Průběh vzniku funkčního proteinu
Nascentní polypeptidový řetězec Sbalování, vazba kofaktorů (nekovalentní interakce)
Kovalentní modifikace (glykozylace, fosforylace, acetylace aj)
t
Vazba dalších proteinových podjednotek
Kotranslační sbalování proteinu
Sbalená C-terminální
mRNA ribosome
50
Sbalování proteinů za účasti chaperonů
Nesbalený protein
Správně sbalený protein
Molekulární chaperony/chaperoníny
• speciální skupina proteinů podílejících se na sbalo-vání polypeptidů (zabraňují chybnému sbalování)
• hlavní rodiny chaperonů: proteiny hspóO a hsp70
Ohsp70: rozpoznávají krátké úseky polypeptidů tvořené hydrofobními aminokyselinami během jeho syntézy na ribozomu
O HspóO (GroE; Hsp60/Hsp10): vytvářejí soudkovité struktury, v nichž se upravují kompletně JÉ|| nasyntetizované proteiny mBĚ
Dva obecné mechanismy působení chaperoninů
Účast chaperonů na procesu sbalování proteinů
správně sbalený poiypeptid
Hsp70 se váže na hydrofobní oblasti       (GroEL, GroES) proteinu a zabraňuje jeho agregaci. Další úlohy:
• transport
• disagregace denaturovaných hsp = heat shock protein proteinů (např. Hsp60) 54
Posttranslační úprava proinzulín
B-řetězec
Proteinový sestřih
srovnání způsobů odstraňování intronů a inteinů
Dna
Exon 1   Iiitrun  Exon 2
i uwscriimio-N
rna
Exon 1   Intron   Exon 2
SPLICISIŠOF rna
mRNA Exon 1  Exon 2
Extein 1 Intein Extein 2
Inteiny byly zjištěny u kvasinek, řas, bakterií a archeí - obvykle je přítomen j en j eden intein, výjimečně dva
Translation Protein
From exon 2
TiUNÍSDvnoN
From
From exon 1 intein
From extein 1
From extein 2
Splicing©*'protein;
Intein katalyzuje své vlastní vyštěpení
Protein prior to splicing
Průběh sestřihu inteinu
probíhá autokatalyticky ve dvou krocích
1
Extein 1 je uvolněn a připojen k cysteinu exteinu 2 - vzniká větvený intermediát
Intein je vy štěpen a oba exteiny se spojí peptidovou vazbou do zralého proteinu
exteins rearrange
sh
Ó/s E*>
Final protein formed
9
Inteins are currently known in more then 200 types of proteins with diverse in functions. These proteins include metabolic enzymes, DNA and RNA polymerases, proteases, ribonucleotide reductases,
and vacuolar-type ATPases.
Sestřih inteinu (proteinový sestřih)
Intein-containing gene
Transcription
Intein DNA jumps
Cut by the intein
Genová konverze
Intein homing
N-extein
Sestřih
Sekvenčně-specifická endonukleáza
so; Intein
Štěpení genu bez inteinu v místě, kam se má začlenit intein
Konzervativní
sekvence
aminokyselin
Inteín-minus gene
140-850 aa +/ - homing endonuclease gene (HEG)
58
Samosestavování (self-assembling)
ocásek
I 5.6.7.8.10.25.26. 1 27,28,29.4
TŘI SESTAVOVACÍ ŘADY
hlava vlákna ocásku
bazálni destička TTT
bazálni - destička spojená s proteiny dutiny
ocásku j\j
připojení obalového
prcieinu
kompletní lágový virion
kompletní
vlákna
ocásku
+ labilní faktor
Vytváření
nadmolekulárních
struktur, spojování
proteinů
nekovalentními
vazbami
Čísly jsou označeny strukturní geny, kterými jsou kódovány proteiny fága
Buněčné mechanismy monitorující kvalitu proteinů po translaci
Proteinové agregáty
Správně	Správně sbalen
sbalen bez	s pomocí
cizí pomoci	chaperonů
Neúplně sbalená forma je rozložena v proteazomu
60
Odbourávání proteinů v proteazomech (eukaryota)
Schéma cyklu ubikvitinu
E1 = enzym aktivující
ubikvitin. £2 = enzym přenášející aktivní ubikvitin sbalený protein        na sbalený protein.
Protein určený k odbourání ~
Označení ubikvitinem za účasti enzymu E2.
Aktivace ubikvitinu enzymem E1.
proteazom
- 19 S
20 S
proteáza
19 S
Odbouráni proteinu
proteázou. fragmenty " '"" proteinu
mm
y Q ď© neaktivní ubikvitin
centrální cylindr
aktivní místa proteáz
19S „cap" - váže označené proteiny
61
Označování proteinů ubiqutinem
A. Aktivace ubiquitinu prostřednictvím enzymů El, E2 a E3
ubiquitln
B. Připojení ubiquitinu na cílový protein
Ubiquitin či ubikvitin (z lat. ubique, všude) je malý globulární protein o délce 76 aminokyselin, přítomný ve všech eukaryotických buňkách, který reguluje rozklad jiných proteinů v proteazomu, lyzozomu či ve vakuole. V určitých případech však také stimuluje endocytózu, vnitrobuněčný transport a podílí se na udržování struktury chromatinu (ubikvitin se váže se na histony).
Ubiquitin se zpravidla připojí na protein, který má být rozložen (degradován), tento proces navázání ubiquitinu se označuje jako ubiquitinace. Váže se glyčinem (na svém C-terminálním konci) k lysinu na proteinu určeném k degradaci. Po připojení ubikvitinu je označený protein degradován proteasomem 26S. Tato degradace je specifická a přesně cílená, je tedy často využívaná pro specifické odstranění proteinů signálních drah. Proteiny degradované proto, aby jejich aminokyseliny, případně peptidy mohly být použity jako stavební kameny, bývají degradovány spíše nespecificky proteázami. Mechanismus připojení
Na cílový protein, určený k degradaci, se ubikvitin váže pomocí tří enzymů, aktivačního El, konjugačního E2 a ligačního E3. Ligační enzym se spojí s cílovým proteinem. Aktivační enzym nejprve ubikvitin aktivuje na účet ATP a poté ho předá konjugačnímu enzymu, který se spojí s komplexem, tvořeným ligačním enzymem spojeným s cílovým proteinem určeným k degradaci. V tomto komplexu tvořeným E2, E3, ubikvitinem a cílovým proteinem pak dojde k navázání ubikvitinu na cílový protein. E2 a E3 se recykluje.
63
64