Transformace 1 - klonování
KLON   soubor identických buněk (organizmů) pocházejících ze společného předka
KLONOVÁNÍ proces tvorby klonů
Klonování je základem genového inženýrství, tj., vytváření pozměněných nebo nových genů a jejich zavádění do genomu organizmů.
DNA klon: molekulární klon = segment DNA vektorem přenesený do hostitelské buňky a v ní se replikuje.
Cizorodá DNA spojená s vektorem = rekombinantní
DNA
Rekombinantní DNA, která je určená ke klonování se
nazývá klonovaná DNA
Tři základní kroky klonování DNA
1. příprava rekombinantní molekuly DNA
2. přenos rekombinantní molekuly DNA do hostitelské buňky
3. selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA
Původ (příprava) DNA
• izolovaná z donorového organizmu
• komplementární (cDNA připravená zpětnou transkripcí z mRNA)
• připravená uměle chemickou syntézou
Metody přenosu DNA do prokaryotických buněk
Chemické - roztoky dvojmocných iontů solí
+ teplota
(Bio)Fyzikální - elektroporace jt puise^^y
Pomocí virů
Metody přenosu DNA do eukaryotických buněk
Chemické - lipofekce, DEAE dextran,
fosforečnan vápenatý, ...
(Bio)fyzikální - elektroporace
Viry - !!!!! Bezpečnost!!!!!!
Způsoby přenosu DNA
Transformace. Přímý přenos DNA izolované z donorové buňky přes cytoplazmatickou membránu do buňky recipientní, v jejímž fenotypu se může vnesená genetická informace projevit. Termín se používá pro prokaryotické buňky (u eukaryot je spíš nádorová transformace)
Transfekce. Přenos DNA do eukaryotických buněk (lipofekční činidla, elektroporace, viry ...)
Transdukce. Přenos DNA - sekvence prostřednictvím viru z buňky donorové do recipientní, v jejímž fenotypu se může vnesená genetická informace projevit (opět termín spíše pro prokaryota)
VLASTNOSTI  PLAZMIDOVÝCH VEKTORŮ
Autonomní replikace v bakteriální buňce (schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při replikaci)
Vhodné spektrum restrikčních míst
Notl I-1
EcoRI    Hpal    Bglll          SacII    Xbal Stul I-II-II-1      I-1 I I
AATTCGTTAACAGATCTGCGGCCGCGGTCTAGAAGGCCT GCAATTGTCTAGACGCCGGCGCCAGATCTTCCGGATTAA
Gen se selektivním znakem
- beta-laktamáza —> rezistence na ampicilin
Plazmid nesmí být konjugativní tj. nesmí mít transferové geny (kódující pilusy)
Co nejmenší velikost
Vícekopiový
Klonování DNA v plazmidu
plazmi d
zavedení do hostitelské buňky
cizí DNA která má být včleněna
gen
rezistence k antibiotiku
selekce buněk obsahujících rekombinovanovou DNA kultivací v přítomnosti antibiotika
Příprava kompetentních buněk
Na třepačce
kultura E. coli narostlá v 20 ml LB bujónu do OD600 = 0,3
ochladit na ledu 0 °C
I
centrifugace 10 minut při 3000 rpm/4 °C
supernatant odlit
sediment resuspendovat v polovině objemu ledového roztoku 0,05M CaCl2 a ponechat na ledu (v lednici) přes noc
\
centrifugace 10 minut při 3000 rpm/4 °C
=1 supernatant odlít
sediment resuspendovat v 1/10 výchozího objemu (2 ml) ledového roztoku 0,05M CaCl2
Kompetentní buňky
úchova na ledu nebo při -70°C v glycerolu
TRANSFORMACE SCHÉMA
V Epp. mikrozkumavce je 30 ul kompet. buněk
		—
///		///
Naředit 1 ug DNA vektoru v 10 ^i te Přidat 30 ul kompetentních buněk
Opatrně promíchat, nechat stát v ledu 30 min
Teplotní šok Umístit při 42 °C/40 sec nebo 37 °C/3 min
I
Na ledu nechat 2 min, přidat lml LB bujónu
I
Inkubace ve vodní třepací lázni při 37°C/45min
I
Transformace pokračování Po inkubaci
I
centrifugace při 5 000 rpm/ 5 min
odlít supernatant
ve zbývajícím medium resuspendovat sediment buněk
I
suspenzi vyočkovat na LB agar + 100 ug/ml AMP
I
Naočkované misky inkubovat dnem vzhůru při 37 °C/24 hod
Stanovení titru bakteriálních buněk
V mikrozkumavce je 30 jal kompet. buněk
- stejný postup jako předchozí
Ale:
- na začátku buňky naředit 105, 106, 107 krát
- místo DNA použijeme sterilní vodu
- na závěr buňky vyšít na misky bez ampicilinu
Hodnocení: odečet počet kolonií transformantů
stanovení titru kompetentních buněk stanovení účinnosti transformace