Gelová elektroforéza - GELY
Jako nosiče se používá agaróza (100 – 50 000 bp)
nebo polyakrylamid (10 – 1 000 bp)
nosiče vytvářejí síťovou strukturu polymerních molekul s póry
Agaróza je lineární polymer (původ z mořské řasy)
Separace biomolekul (proteinů, NK) v gelech
Polyakrylamid
Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru
Optimální velikost separovaných molekul
– agarózové gely 100 bp až 50 000 bp
– polyakrylamidové 10 až 1000 bp
Koncentrace agarózy Rozsah dělení ds DNA
0,3 % 5 – 60 kb
0,6 % 1 – 20 kb
0,7 % 0,8 – 10 kb
0,9 % 0,5 – 7 kb
1,2 % 0,4 – 4 kb
1,5 % 0,2 – 3 kb
2,0 % 0,1 – 2 kb
3,0 % 0,05 – 0,5 kb
4,0% 0,005 – 0,2 kb
PAGE gely
– rozlišení až 1 nukleotid - sekvenace
Uspořádání elektroforézy
- Horizontální (agarózové gely)
- Vertikální (PAGE)
Princip DNA ELFO
pohyb DNA s negativním nábojem v neutrálním gelu
a elektroforetickém pufru v elektrickém poli k anodě
Složky gelu
+
- jamky
DNA
ELFO pufry:
TRIS-acetátový (TAE): 0,04 M Tris-acetát, 0,002 M EDTA
TRIS-fosfátový (TPE): 0,08 M Tris-fosfát, 0,008 M EDTA
TRIS-borátový (TBE): 0,089 M Tris-borát, 0,089 M kyselina boritá, 0,002 M EDTA
AGARÓZOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA – příprava gelu
Nanášecí (barvící pufr) - 6× koncentrovaný
- barevný
- Hustý - 40% (w/v) sacharóza
- Ficol 400
- glycerol
Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu
• Konformace DNA
• Složení elektroforetických pufrů (iontová síla-TAE a TBE)
• Složení bazí a teplota (u PAGE)
• Přítomnost interkalačních barviv
• Směr elektrického pole (PFGE > 50 kb)
• Napětí (5V/cm)
• Koncentrace gelu
• Velikost DNA
Pohyb fragmentů DNA v gelu a jejich separace
Metody detekce
• Interkalační barviva (ethidium bromid)
• Indolová a imidazolová barviva (DAPI)
• Stříbro
• Kyaninová barviva (SYBR Gold, SYBR Green)
• Radioaktivní značení NK
Ethidium bromid
Mutagen a karcinogen
Interkalace do dsDNA (vazba i na helixy ssDNA a RNA)
Po interkalaci – 20-30x větší flourescence (fixní pozice v DNA)
Transiluminátor (UV ~ 302 nm), EtBr-DNA emise 590 nm
Citlivost 1-5 ng
GelRed
Postup přípravy gelu pro ELFO a nanášení vzorků
• Navážit agarózu a smíchat s 1×TAE pufrem, tak
aby vznikl 1% gel
• Rozvařit agarózu v mikrovlnce.
• Opatrně promíchat a vytemperovat na 50 °C
• Nalít do tvořítka, tak, aby nevznikly bubliny a výška
gelu odpovídala 5 mm
• Nechat gel utuhnout (20 - 30 min)
• Přelít gel 1 × konc. TAE pufrem
• Opatrně vysunout hřeben z gelu
• Nanášet vzorky do kterých byl přidán nanášecí pufr
• Provést elektroforézu
Plazmid pUC18 -2,69 kbp
OC
Lds DNA
CCC
RNA
bp
10 000
3 000
2 000
1 000
500
100