25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
1
Metody výzkumu
patofyziologie volných radikálů
Milan Číž
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
2
Oxidativní stres
• redoxní rovnováha
• poškození biologických makromolekul
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
3
Oxidativní stres
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
4
Oxidativní stres
Kůže
stárnutí;
psoriáza;
melanom
Ledviny
nefritida
Srdce
hypertenze;
ischemická ch.
Oči
makulární
degenerace;
katarakt
Multiorgánové
diabetes;
stárnutí;
únavový syndrom
Imunitní s.
autoimunitní ch.;
rakovina
CNS
Alzheimer;
Parkinson;
autismus
Plíce
astma;
alergie;
rakovina
Klouby
artritída
oxidativní
stres
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
5
Metody stanovení
• volných radikálů
• aktivity zdrojů volných radikálů
• antioxidační aktivity biologických vzorků
• jednotlivých antioxidantů
• poškození biologických makromolekul
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
6
Metody detekce
• Chemiluminiscence
• Spektrofotometrie
NBT-test
redukce cytochromu C
• Elektronová spinová resonance
• Elektrochemie
stanovení spotřeby kyslíku
detekce NO
• Fluorimetrie (průtoková cytometrie)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
7
Chemiluminescence
Chemiluminiscence (1)
Luminofory jsou oxidovány RMKD. Při návratu do
základního energetického stavu emitují fotony. Jejich
detekce je možná pomocí luminometrů nebo
scintilačních spektrofotometrů.
Nejčastěji používané luminofory:
- Luminol
- Lucigenin
- Izoluminol
- Pholasin
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
8
Chemiluminescence
luminol
isoluminol
aminoftalát
RMK
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
9
CL fagocytů
fagosom
granule
plazmatická
membrána
NADPH oxidasa
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
10
CL fagocytů
NADPH
oxidasa
NADP+
(O2
-, H2O2, OH)
O2
-•
O2
NADPH + H+
luminol + oxidant -aminoftalát + N2 + světlo (425 nm)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
11
CL fagocytů
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
12
CL fagocytů
Rozlišení intra- a extracelulární CL
• SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný
• luminol vs. isoluminol
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
13
CL fagocytů
plazmatická
membrána cytosol
luminol
isoluminol
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
14
CL fagocytů
Aktivátory fagocytů Místo působení
opsonizované částice (OZP) povrchové receptory
fMLP povrchové receptory
PMA proteinkinasa C
vápníkový ionofor A23187 Ca2+ PKC
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
15
CL fagocytů
Rozlišení mezi RMK a RMD
• antioxidanty
• NO donory (sodium nitropruside, SIN-1)
• analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-NNA)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
16
Systémy generující RMKD
• xanthin/xanthin oxidáza O2
-•
• peroxid vodíku + ionty přech. kovů •OH
• peroxid vodíku H2O2
• ABAP ROO•
• SIN-1 ONOO•
buněčné systémy (fagocyty)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
17
Metoda TRAP
• Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative
Parameter
• stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě
rozpustných antioxidantů
• referenční vzorek: trolox
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
18
Metoda TRAP
• 2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride
• 2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
19
Metoda TRAP v lipidové fázi
• 2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
20
Metoda TRAP
RN = NR N2 + 2R* R2, další reakce
2RO2
*
peroxylový radikál
2O2
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
21
Metoda TRAP
50% peak
CL
Čas
Přidání vzorku
1/2 peak-time
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
22
Metoda TRAP
•
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50
Čas [min]
CL[mV]
backgr
abap
trolox
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
23
Chemiluminescence
Chemiluminiscence (2)
• aktivita MPO:
bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti
vzorku a peroxidu vodíku
• buněčná proliferace a cytotoxicita:
luciferin-luciferáza
závislé na ATP
• regulace exprese genů
reporter gene assay
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
24
Průtoková cytometrie
• tvorba RMK neutrofily a makrofágy:
Dichlorodihydrofluorescein diacetate – peroxid
vodíku, peroxynitrit
Dihydrorhodamine 123 - peroxid vodíku, peroxynitrit
Dihydroethidium bromide – superoxidový anion.
• oxid dusnatý:
1,2-diaminoanthroquinone
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
25
Průtoková cytometrie
Dichlorodihydrofluorescein diacetát
Detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů
včetně oxidů dusíku
Výhody
• shodná vlnová délka s fluoresceinem
• používána nejdelší dobu (od roku 1983)
Nevýhody
• unikání z buněk  nelze fixovat
• vysoká citlivost vůči světlu
• toxicita
• nezbytná aktivita esteráz
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
26
Průtoková cytometrie
Dihydrorhodamin
Detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů
včetně oxidů dusíku
Výhody
• až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA
• stabilita - možnost fixace
Nevýhody
• nespecifická detekce oxidantů
• závislost na mitochondriálním membránovém
potenciálu?
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
27
Průtoková cytometrie
Dihydroethidium
Detekce O2
-
Výhody
• dobrá specificita pro O2
•
stabilita - možnost fixace
Nevýhody
• HE katalyzuje dismutaci O2
•
toxický
• nelze použít současně s PI
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
28
Průtoková cytometrie
• povrchové antigeny:
MAb značené různými fluorescenčními značkami
• buněčný cyklus, buněčná viabilita:
propidium iodide
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
29
EPR
Metody využívající existence spinu a jeho chování v
silném magnetickém poli. Podle toho, zda se jedná o
spin elektronu nebo jádra se dělí spektroskopické
metody na nukleární a elektronové.
• nukleární magnetická rezonance NMR
• nukleární kvadrupólová rezonance NQR
• elektronová paramagnetická rezonance EPR
• Muonová rezonance
Objevena 1945. Metoda je založena na měření
absorpce a emise elektromagnetického záření
(mikrovlny) elektronů.
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
30
EPR
Na vzájemné interakci elektronového momentu hybnosti
s vnějším magnetickým polem je založena
elektronová paramagnetická rezonance (EPR),
nazývaná také elektronová spinová rezonance
(ESR).
EPR spektroskopie často neumožňuje přímé stanovení
krátce žijících radikálů bez použití složitých
experimentálních postupů (měření při nízkých
teplotách, použití tzv. flow-techniky apod.). Aby se
umožnilo stanovení krátce žijících radikálů i bez
použití speciálních postupů, byla v šedesátých letech
vyvinuta metoda spin-trappingu.
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
31
EPR
Metoda EPR je použitelná pro systémy s nenulovým
spinem, tj. pro systémy, které obsahují alespoň 1
nepárový elektron. Jsou to např. paramagnetické ionty
některých přechodných kovů nebo vzácných zemin s
částečně zaplněnými d a f orbitaly jako Cu(II), Mn(II),
Cr(III,IV), V(IV) a org. radikály.
Působením magnetického pole dojde k rozštěpení
původního energetického stavu E0 na energetické
hladiny, odpovídající jednotlivým prostorovým
orientacím celkového momentu hybnosti.
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
32
EPR
Interakcí nepárového elektronu s magneticky aktivními
jádry okolních atomů nebo s jinými nepárovými
elektrony dochází k rozštěpení signálu na multiplety.
• počet čar v multipletu n+1 (n - počet interagujících
jader)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
33
EPR
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
34
EPR
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
35
EPR
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
36
Spektrometrie
• aktivita MPO:
o-dianisidine
• lipidová peroxidace:
koncentrace TBARS
• jednotlivé antioxidanty:
kyselina močová, kyselina askorbová, albumin,
bilirubin
• oxid dusnatý:
Griessova reakce (nitrity, nitráty), detekční limit 100
nM, 548 nm.
• viabilita, cytotoxicita, buněčná proliferace:
MTT test
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
37
Elektrochemie
• oxid dusnatý:
selektovní elektroda pro NO
• ostatní RKM
• stanovení spotřeby kyslíku
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
38
Poškození biologických
makromolekul
• Lipidová peroxidace
Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL
Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC
Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-
MS)
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
39
Poškození biologických
makromolekul
• Oxidativní poškození bílkovin
Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC,
spektrometrie)
Stanovení proteinových hydroperoxidů
25.4.2018 Metody stanovení oxidativního
stresu
40
Poškození biologických
makromolekul
• Oxidativní poškození DNA
Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG)
-HPLC, GC-MS