Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Moderní přístupy studia biochemických
a buněčných mechanismů toxicity v
ekotoxikologických biotestech
Klára Hilscherová
Soustava orgánů
Orgán
Tkáň
Buňka
Organela
Biomolekula
Jedinec
Populace
Společenstvo
Ekosystém
Biosféra
Flexibilita
Schopnost určit
příčinu
Specifita
Citlivost
Ekologická
relevance
Trvání odpovědi
Dlouhodobější
následky
VYSOKÁ
VYSOKÁ
NÍZKÁ
NÍZKÁ
BIOMARKERY
• Časné varovné signály potenciálního poškození organismu i celé
populace, časný marker toxicity (i bez morfologických změn)
• Vybrané parametry, jejichž měřitelné změny jsou prvními, časnými
odpověďmi na expozici cizorodými látkami („early warning of
biological impact“).
• Cizorodými látkami způsobené změny buněčných nebo
biochemických složek, struktur, nebo funkcí, které jsou měřitelné v
biologickém vzorku
• Citlivé, rychlé odpovědi, mohou ukazovat mechanismus účinku,
předcházejí viditelným symptomům toxicity
• Nejlépe prostudovány u vyšších živočichů (savců, ryb)
• Možno sledovat i u druhů ze standardních akvatických biotestů
(řasy, makrofyta, bezobratlí)
- screeningové metody s vysokou predikční schopností,
alternativa/doplnění ke stávajícím metodám.
- používány v základním toxikologickém, ekotoxikologickém
a farmakologickém výzkumu, v medicínské
diagnostice.
- některé obecně akceptovány.
- řada parametrů testována jako potenciální biochemické
markery.
- potenciál využití jako alternativní metody pro toxikologické
hodnocení nových xenobiotik.
Výhoda biologických a biochemických indikátorů
kontaminace: schopnost vypovídat o vlivu znečištění v celém
jeho komplexu, se všemi synergistickými a antagonistickými
vlivy mezi jednotlivými znečišťujícími komponenty.
Biochemické markery
Biochemické markery
Princip: toxické látky v subletálních koncentracích způsobují
změny hodnot hematologických, biochemických
ukazatelů, nespecifické imunity, vyvolávají
histopatologické změny v tkáních.
Po vstupu cizorodých látek do organismu či buňky dochází:
• k jejich vazbě na buněčné receptory kontrolující klíčové
buněčné pochody,
• ke vzniku reaktivních intermediátů,
• k inhibici určitých enzymových aktivit a dalším procesům,
které předcházejí toxickým a dalším negativním efektům
na úrovni buňky, orgánů, organismů a populací.
Xenobiotika Cílové
molekuly
• DNA
• proteiny
• lipidy
• environmentální
polutanty
• léky
• agrochemikálie
Poškození
• adukty
• oxidace
Teratogenita
Malformace
Mortalita
....
Eliminace
• UDPGTs
Bioaktivace
• PHS
• LPO
• P450
Detoxifikace
• GSH
• GST
• epoxid hydroláza
Reaktivní
intermediáty
 elektrofily
 volné radikály
Reaktivní
kyslíkové
radikály
Buněčná
ochrana
• GSH
• GPx
• GST
• GR
• SOD
• Cat
• G6PD
Biochemické markery toxicity
- indikují mechanismus toxicity, nikoliv určitou cizorodou
látku.
- některé biochemické parametry specificky odrážejí expozici
některou třídou nebo skupinou kontaminantů.
- biologickými modely jsou nejčastěji jaterní tkáň, i další tkáně
dle typu biomarkeru a cíle studie, primární hepatocyty nebo
permanentní linie odvozené od hepatocytů, případně
odebraná krev či jiné tělní tekutiny
• Vhodně zvolené biomarkery jsou významnými indikátory
zdravotního stavu organismů v monitorovaném ekosystému.
• Předností je schopnost detekovat toxické účinky látek před
manifestací jejich účinku, tzn. před narušením fyziologických
funkcí jako např. růstu, vývoje, reprodukce.
Biomarkery = biochemické či fyziologické indikátory
expozice nebo vlivů xenobiotik na suborganismální nebo
organismální úrovni
Výhoda: odpovídají na expozici = reagují pouze na
polutanty dostupné pro organismus.
Vhodné biomarkery by měly splňovat následující vlastnosti:
(i) senzitivní ve srovnání s ostatními biomarkery;
(ii) specifičnost ke konkrétním druhů chemických xenobiotik;
(iii) permanentní odpověď;
(iv) jasnost v interpretaci a propojení na vlivy vyšší úrovně;
(v) spolehlivost, reprodukovatelnost;
(vi) preciznost, jednoduchost a nízké náklady;
(vii) aplikovatelnost v terénních podmínkách a validace v terénu
• identifikují látku v systému a interaktivní produkt mezi
xenobiotikem a endogenní složkou nebo jiné skutečnosti
v biologickém systému způsobené expozicí.
• charakterizují množství toxikantu, které proniklo do organismu
• neposkytují příliš informací o následcích expozice, různě
specifické
BIOMARKERY EXPOZICE
BIOMARKERY ÚČINKU-VLIVU
• biochemické změny, které se projevily jako výsledek
negativní interakce toxikantu a biologického systému a
mohou vyústit až v patologické poškození organismu
Biomarkery expozice
I. Stresové proteiny (proteiny teplotního šoku)
– nespecifické, indukovatelné u rostlin i živočichů
II. Inhibice esterázové aktivity (acetylcholinesterázy)
– enzym nervového systému živočichů, specifická odpověď
- po expozici organofosfátových pesticidů a karbamátů
- primární toxický vliv těchto látek, stupeň inhibice enzymů je v úzkém vztahu
k expozici tkání
Acetylcholinesteráza (AchE): zejména v mozku, červených krvinkách a plasmě
některých obratlovců, zodpovědná za hydrolýzu acetylcholinu, hlavního
přenašeče nervových vzruchů mezi nervovými buňkami. Její inhibice silně
ovlivňuje přenos nervových signálů.
III. Metalothioneiny
- cytoplasmické kovy-vážící proteiny, vyskytují se u řady eukaryot, indukce po
expozici kovy, biomarkery vlivu toxických kovů.
- skupina proteinů s nízkou molekulovou hmotností, vysokým obsahem
aminokyselin obsahujících sulfhydrylové skupiny (zejména cystein) a
schopností vázat těžké kovy. K jejich zvýšené syntéze dochází při zvýšené
koncentraci iontů kovů, jak esenciálních, tak toxických
IV. Indukce detoxikačních enzymů u rostlin i živočichů
A. Enzymy I. fáze biotransformace – enzymy MFO (monooxygenázy
smíšené funkce) – indukce enzymů cytochromu P450 (EROD,
MROD, PROD)
cytochrom P4501A - biomarker expozice důležitých skupin organických
látek
- hladina cytochromu indukována 2,3,7,8-tetrachlodibenzo-p-dioxinem a
příbuznými látkami, PCB, PAH
- cytochromy P450 (CYP) jsou hemoproteiny schopné vázat molekulární
kyslík a vsunovat jeho jeden atom do molekuly substrátu, kterým mohou
být i cizorodé látky, které jsou jedním nebo více cytochromy přeměněny
tak, aby mohly být z organismu např. exkretovány.
B. Enzymy II. fáze biotransformace – glutathion transferázy (GST),
uridinedifosfoglukuronosyl transferázy, sulfotransferázy
BIOMARKERY EXPOZICE
Biomarkery účinku
I. Parametry oxidativního stresu - produkce kyslíkových radikálů,
aktivita antioxidačních enzymů, koncentrace neenzymatických
antioxidantů, oxidativní poškození makromolekul
II. Parametry energetické bilance organismu – obsah lipidů,
proteinů, uhlovodíků a aktivita elektronového transportu
III. Indikátory narušení metabolismu - metabolické enzymy
pyruvát kináza, laktát dehydrogenáza, isocitrát
dehydrogenáza
IV. Biomarkery zatížení endokrinního systému - vitelogenin,
hormony T3 a T4, enzymy metabolizmu steroidních hormonů.
V. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA – zlomy v DNA,
mikrojadérka)
VI. Histologicko-patologické změny některých orgánů
Parametry oxidativního stresu
 produkce kyslíkových radikálů – superoxid, peroxid vodíku, hydroxylový
radikál
 aktivita antioxidačních enzymů – glutathion peroxidáza, glutathion
reduktáza, superoxidáza, kataláza
 koncentrace neenzymatických antioxidantů
 oxidativní poškození makromolekul – lipidní peroxidace, oxidativní
adukty DNA, produkty oxidace proteinů
Jedná se biomarkery organochlorových pesticidů, PCB, pesticidů typu
paraquat apod.
Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA – zlomy v DNA,
mikrojadérka) - využívány při hodnocení zatížení ekosystémů látkami
s genotoxickým účinkem, které indukují vznik chromosomálních aberací a
mutací.
alternativa detekce - metody PCR, RT-PCR a DNA-fingerprintingu, test
mikrojader
Test mikrojader (MNT) - jednoduchá orientační metoda ke stanovení
genotoxicity. Pozitivní po působení PCB, benzpyrenu, benzidinu, apod.
BIOMARKERY ÚČINKU
Stanovení produkce vitelogeninu
• Vitelogenin je bílkovina produkovaná jaterními buňkami ryb, obojživelníků,
plazů a ptáků.
• Produkce je indukována vazbou estrogenů na jaderné receptory.
• U samic je vitelogenin transportován do vaječníků, kde tvoří součást
žloutkových proteinů.
• U samců je hladina endogenních estrogenů přirozeně velmi nízká, a proto
je i produkce vitelogeninu minimální
• Po působení ED´s s xenoestrogenním účinkem (např. ethinylestradiol,
chlordan, toxafen, dieldrin, 4-nonylfenol) dochází u obou pohlaví ke
zvýšení hladin vitelogeninu – výrazné zejména u samců
• Naopak působením antiestrogenních ED´s (např. metoxychloru) se
produkce vitelogeninu minimalizuje pod měřitelnou úroveň.
• Sledován zejména u ryb a obojživelníků
Biomarkery účinku na endokrinní systém
Další parametry: vitelin, cytochromy, hladiny hormonů
Histochemická charakteristika a lokalizace
Pesticidy
PAHs
PCBs
Xenoestrogeny
P450
Neurotoxicita
Oxidativní
stres
Metaloproteiny
G
E
N
O
T
O
X
I
C
I
T
A
Stresové
proteiny
Histologické
markery
Imulogické
markery
Fyziologické
markery
Růst, Reprodukce
Enzymy II.fáze
detoxikace
Specifičtější
parametry
Nespecifické
parametry
BIOMARKERY
Kovy
Vitelogenin
Doporučené metody pro biologické monitorovací
programy ve vodním prostředí na národních úrovních
Metoda Organismus V současnosti
používán
v monitorovacích
programech
Biomarkerlátek Biologický význam
Tvorba DNA aduktů Ryby, mlži Francie, Holandsko,
Švédsko, USA
PAU, nitro látky, amino
triazinové pesticidy
Parametr
genotoxických vlivů,
citlivý indikátor minulé
a současné expozice
Inhibice
acetylcholiesterázy
Ryby, korýši, mlži Francie Organofosfáty a
karbamáty nebo podobné
molekuly, možné řasové
toxiny
Parametr expozice
Indukce
metallothioneinů
Ryby Monitoring and
Research Programme of
the Mediterranean
Action plan, Holandsko
Indukce
metallothioneinových
proteinů vlivem určitých
kovů (Zn, Cu, Cd, Hg)
Parametr expozice a
disturbance
metabolismumědi a
zinku
Indukce
ethoxyresorufin-Odeetylázy
(EROD) nebo
cytochromuP450 1A
Ryby Německo, Francie,
Holandsko, UK, Belgie,
Monitoring and
Research Programme of
the Mediterranean
Action plan, Norsko
Indukce enzymů
detoxikujících planární
organické kontaminaty
(PAU, planární PCB,
dioxiny)
Možný prediktor
patologie vlivem
mechanistických
propojení, senzitivní
indikátor současné
expozice
Inhibice Δ-amino
levulinové kyselina
(ALA-D), indukce
vitellogeninu
Samci a juvenilní
jedinci ryb
Holandsko, UK Estrogenní látky Parametr feminizace
samčích ryba
reprodukční poškození
Aplikace biomarkerů v akvatických testech
 Při přípravě testu nezbytné používat dobře
charakterizovaný materiál – homogenní populaci
 faktory ovlivňující biomarkery - druh organismu, pohlaví,
věk, vývojové stadium a výživa, environmentální faktory
(teplota etc.)
 otestovat a nakalibrovat potřebné množství vzorku podle
množství sledovaných parametrů, jejich limitu detekce a
spotřeby biologického materiálu pro jednotlivé metodiky - u
malých druhů směsné vzorky z více jedinců
Biomarkery - závěry
• Biomarkery = citlivé indikátory zatížení organismů
environmentálními stresory a subletálních účinků
• Umožňují náhled do subletálních fyziologických procesů –
charakterizují mechanismus účinku
• Specifické markery – informují o přítomnosti specifického
stresoru
• Použitelnost určitého biomarkeru pro každý nový druh musí
být validována a optimalizována, musí být posouzena jeho
relevance a míra odpovědi pro nový druh
• Nezbytný multiparametrický přístup
• Studium spojení časných subletálních biochemických a
buněčných změn s dlouhodobějšími negativními účinky na
úrovni populace a společenstva