Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Testy toxicity sedimentů K.Hilscherová Sedimenty - velmi různorodé složení - polotuhá matrice - pevná fáze (částice) a pórová voda • v podstatě akvatický ekvivalent půdy - heterogenní prostředí - směs jílu, písku, minerálů, huminových látek, odumřelých organismů a antropogenních polutantů - akumulace a inaktivace polutantů (např. AVS – kovy, Corg – PAHs) • primární úložiště biotického i abiotického materiálu (včetně polutantů) v akvatickém prostředí • akumulace polutantů v sedimentech může způsobit: 1. Změny ve struktuře bentických společenstev 2. Zvýšené zatížení organismů polutanty 3. Toxicitu Klasifikace sedimentů 1. Obsah organického uhlíku – ovlivňuje sorpci neutrálních organických látek  zvýšené Kow = zvýšená sorpce 2. Distribuce zrnitostních frakcí – větší částice mají tendenci sorbovat méně polutantů 3. Obsah a typ jílu 4. Kationtová výměnná kapacita (KVK) – ovlivňuje sorpci kationtů 1. pH – ovlivňuje speciaci kovů, sorpci Další fyzikálně chemické parametry – DO, salinita, amoniak Transport a resuspendace sedimentů Proudy, povodně, vítr, vlny - Způsobují pohyby sedimentů v závislosti na jejich velikosti Porová voda • Voda mezi částicemi sedimentů • Nepolární polutanty  sedimenty  porová voda  vodní sloupec • Primární zdroj expozice polutantů pro organismy žijící v sedimentu Sedimenty mohou vázat polutanty, pak být překryty další vrstvou sedimentů  redukce biodostupnosti Odběry vzorků sedimentů - tyčové vzorkovače (vertikální profil, historie sedimentace) - pasivní vzorkovače – sedimentové pasti (plaveniny) - drapákové vzorkovače (směsné vzorky) - SPMDs – odběr určitých typů polutantů (zejm. pórová voda)  Narušení fyzikálně chemických parametrů sedimentů Manipulace se vzorky • Uskladnění: změny toxicity vzorků v závislosti na teplotě (chlazení (4ºC) vs. mražení (<-20ºC)) , době uskladnění a stupni kontaminace sedimentů • Úpravy vzorků: 1.) úpravy pH (6-9) – vliv na toxicitu a biodostupnost kovů (Zn, Ni, Pb, Cu, Cd), amoniaku a sirovodíku 2.) lyofilizace vs. zmražení 3.) amoniak – odstranění amoniaku ze vzorku probubláváním nebo přidáním zeolitu 4.) homogenizace 5.) kovy – odstranění kovů přidáním EDTA nebo sulfidů 6.) výluhy (vodné/organické) vs. SPTs – změny toxicity eluátů v závislosti na volbě rozpouštědla (voda, methanol, DCM) vs. toxicita biodostupné frakce kontaminantů 7.) pórová voda vs. SPTs Testy se sedimenty • Organismy v sedimentu vystaveni látkám zachyceným v pevné i kapalné složce matrice • Pro bentické organismy - biodostupnost chemických stresorů v sedimentech. • Sediment = potenciální dlouhodobý zásobník/zdroj kontaminantů uvolněných do vody • Může být nezbytné remediovat kontaminované lokality bagrováním nebo odstraněním sedimentů • odstranění sedimentu, jeho transport a uložení mohou být velmi nákladné; studie toxicity umožní identifikovat nebezpečně kontaminované lokality – kde je třeba odstranění, kde možno ponechat bez významného rizika. • Zejména EPA a ASTM metodiky Jak hodnotit toxicitu sedimentů?  Toxicita porové vody/výluhů (několik ISO / OECD norem) : 100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepání, filtrace, test V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna (2 dny) ? Vodný výluh vs. Sediment  Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, …) a dva různé sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...)  Kontaktní toxicita (jen málo norem …) : sedimenty+organismy & hodnocení účinků – červi, hmyz, šneci … dny - týdny Skríningové testy toxicity/genotoxicity Bakteriální modely Testy s výluhy sedimentů: • Vibrio fischerii (Microtox) – 0,5 h • Escherichia coli (Toxichromotest) – 2 h Kontaktní verze testu • Flash test s Vibrio fischerii – kinetický test - stanovení inhibičního účinku vzorků na světelnou emisi Vibrio fischerii • srovnatelné se statickou zkouškou s luminiscenčními bakteriemi podle ČSN EN ISO 11348 • Flash verze - eliminace vlivu zákalu a zbarvení vzorku, umožňuje provedení testu se suspenzí vzorku bez přípravy vodného výluhu. Je mezistupněm ke kontaktním zkouškám ekotoxicity Testy genotoxicity s výluhy: • SOS chromotest • umuC test • GFP test atd. Nástroje pro hodnocení • Základní požadavky – Měření zakalených (barevných) materiálů – Schopnost rozlišení TOXICKÝ - NETOXICKÝ – Rychlost • Bakteriální bioluminiscenční testy toxicity – Klasické – Microtox®, BioToxTM, LUMISTox aj. – Alternativní – modifikace klasických testů (např. BioToxTM Flash test*) * Lappalainen, J. et al. (1999): Chemosphere, 38(5), pp. 1069-1083. Microtox • Vibrio fischerii - Mořská bakterie schopná bioluminiscenece Design: - Akutní - mikrodestička - Endpoint: inhibice bioluminiscence - Luminometr – t = 0, 15, 30 minut - Testování vodného výluhu Flash test • Vibrio fischerii - testování zakalených a barevných vzorků, bez potřeby referenčního materiálu design: - akutní - inhibice bioluminscence - mikrodestička - luminometr s dispensorem - nutné vzorek protřepat (během měření) - krátká doba měření – Hodnota píku Smax (0-2s) v porovnání s píkem S30s (po 30s měření) Akutní testy toxicity I. • Porová voda • Eluát ze sedimentu • 48-96 h expozice • Příprava eluátu: 24h třepání, 100 g sedimentu/1L vody • Druhy: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace Akutní testy toxicity II. • Kontaktní testy - Celý sediment • 96h – 10 dní expozice • Druhy: různonožec (Hyalella azteca), jepice (Hexagenia limbata), pakomár (C.tentants/riparius) • 10-denní test s Hyalella azteca a Chironomus tentans • Sledované parametry: přežívání Chronické testy toxicity I. • Porová voda • Eluát ze sedimentu • 7-35 dní expozice • Druhy: Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst, reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu, přežívání mladých Chronické testy toxicity II. • Kontaktní testy - Celý sediment • Zpravidla 28 dní expozice • Druhy: různonožec (Hyalella azteca), pakomár (C.tentants/riparius) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst, reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu, přežívání mladých • 28- a 42-denní testy s H. azteca • Sub-chronické a celoživotní testy s Chironomus tentans • 10-denní krátkodobý chronický test s larvami obojživelníků ASTM E 1706 (2005) Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates • korýš Hyalella azteca ( H. azteca) • pakomár Chironomus tentans • 10 denní test, 300-mL kádinky, 100 mL sedimentu, 175 mL vody, organismy krmeny • Parametry: přežívání, růst Další testy sedimentů: Chironomus riparius, Daphnia magna a Ceriodaphnia dubia, Hexagenia spp., Chronický test s Tubifex tubifex (28 dní) – přežívání, růst, reprodukce Chronický test s H. azteca Chironomus dilutus - přežívání, růst, vylétávání, reprodukce Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA u s www.epa.gov Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA www.epa.gov Testy toxicity sedimentů ASTM Tubifex tubifex - Nitěnka obecná • Součást makrozoobentosu • Relevantní organismus pro sediment • Inhibice pohybu a letální koncentrace kmen: KROUŽKOVCI třída: opaskovci podtřída: máloštětinatci Spíše chroničtější expozice – viz. Chronické testy – pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus Testy toxicity sedimentů Akutní test Účel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří mezi nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy. Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných koncentracích látky ve srovnání s kontrolou v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prolongovaný 10-14 denní test Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace Testy s larvami pakomárů rodu Chironomus • OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment • OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water • OECD 235 Chironomus sp., Acute Immobilisation Test (pouze voda – 48 h expozice) • OECD 233 Sediment-Water Chironomid Life-Cycle Toxicity Test Using Spiked Water or Spiked Sediment (v OECD normách preferován Chironomus riparius) • USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans Chironomus riparius Meig. (pakomár) Charakteristika modelového druhu • rod Chironomus - řád dvoukřídí (Diptera) = hmyz s proměnou dokonalou • vajíčko-larva(4 instary)-kukla-imago • dominantní konzumenti 1. řádu v rámci sladkovodních akvatických ekosystémů • značná abundance • kosmopolitní rozšíření • larvy - všežravci - živí se řasami, rozsivkami, detritem 10-denní test s larvami pakomárů rodu Chironomus Nasazovány larvy ve stadiu 2-3 instaru (cca 10 d staré) 10 jedinců/kádinku 100 ml sedimentu/175 ml vody Teplota 20 ± 2°C Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost Po 10 dnech hodnoceno přežívání a růst Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus Nasazovány larvy mladší jak 24 h 12 jedinců/kádinku 100 ml sedimentu/175 ml vody Teplota 20 ± 2°C Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost Doba expozice Ch.riparius 27-28 dní Ch.tentans: 50-60 d (ukončeno 7 dní po posledním vylétnutí) Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a váha (růst), vylétávání samiček a samečků – poměr pohlaví, doba vylétávání, počet nakladených vajíček, přežívání dospělců Podobné uspořádání jako v 10-denním testu Celoživotní test - dle OECD • provádí se v 600ml kádinkách • sediment artificiální nebo přírodní • voda - studniční, povrchová, provozní, uměle připravená • sediment : voda 1:4 • 20 ±2°C, 500 – 1000 lux, 16L : 8D A. nylonová síťka B. plastový kryt C. kádinka bez zobáčku D. otvory na výměnu vody E. sediment kontaminace: sedimentu vody nad sedimentem koncentrační řada: aspoň 5 koncentrací, f ≤ 2 kvalita vody - pH 6-9, rozpuštěný kyslík – aspoň 60% ASV, změřit tvrdost a amoniak vzdušnění – Pasteurovou pipetou (jemně) • 1-4 dny staré larvy vysazujeme do sedimentu • 20 jedinců/kádinka • počet opakování: 3 - ECx; 4 - NOEC, LOEC • krmení– tetrafinR, 0,25-0,5 mg/larva/den • délka trvání – 28d (C.riparius) Celoživotní test - dle OECD #218/219 Cílové parametry: • procento líhnutí dospělců: ER: procento líhnutí dospělců (emergence ratio) na: počet jedinců vysazených do kádinky ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7 • střední čas vývoje: čas od vysazení do líhnutí a e n n ER = • střední rychlost vývoje: x: střední rychlost vývoje v kádince i: index intervalu mezi pozorováními m: počet všech intervalů mezi pozorováními fi: počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) xi: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i deni: den pozorování (od začátku) li: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den) e ii m i n xf x ∑= = 0 2/ 1 ii i lden x − = ECx Regresní analýza NOEC, LOEC ANOVA Závislost citlivosti na pohlaví Chi-square Procento vylíhnutých jedinců Cochran-Armitage test, Fisher’s exact test, Mantel-Haentzal test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin transformace) Projevy u bezobratlých: Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita) Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace) Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex další procesy řízené hormony: pigmentace, regenerace končetin, diapauza Sagi et al. (2003) – Cherax quadricarinatus Rudolphi (1999) – Samastacus spiniformis Suzuki (1999) – Armadillidium vulgare ?AG Barki et al. (2003) Jungmann et al. (2004) - Gammarus fossarum Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce SUBLETÁLNÍ TOXICITA U VODNÍCH MĚKKÝŠŮ - vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro vyhodnocení účinků endokrinních disruptorů ve vodním prostředí Test sedimentů s písečníkem novozélandským Potamopyrgus antipodarum - vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních sedimentů a čistých látek - finančně atraktivní varianta oproti chemickým analýzám sedimentů trvání 4 týdny (popř. 8 týdnů) nádoba objem 1 l médium 800 ml vody expozice statická, 50 g sedimentu odběry 20 jedinců po 4 (8) týdnech parametry mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů; počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou + nízké nároky na kultivace - nedostatečná velikost pro biochemické analýzy Parametry „Potamopyrgus sediment testu“ Příprava Typy sedimentů o přírodní o artificiální listová hrabanka + křemitý písek o spajkovaný artificiální sediment vyhodnocení efektů čistých látek (1) spajkování artificiálního sedimentu. (2) po odpaření solventu je přidáno medium (3) ustavení rovnováhy mezi sedimentem a vodou, po 4 dnech přidáni šneci . 1 2 3 2(3) dny ve tmě 4 dny Médium - voda s přídavkem NaHCO3, CaCO3 - 16°C, 700±100μS/cm L:D 16:8 Komerční řasové pelety Expozice, vyhodnocení Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých a nezralých embryí (Xeno)estrogenní účinek - ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol Xenoandrogenní účinek - tributylcín, trifenylcín Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra) Kontaktní Testy Toxicity – ovlivňující faktory Faktory mimo kontaminace • zrnitost sedimentů • obsah a typ jílu • obsah a charakter organického uhlíku • struktura a vlastnosti huminových látek/organického materiálu • pH • obsah kyslíku • toxicita amoniaku /sulfidů • aktuální stav testovací populace • výživa Změny toxicity sedimentů díky vzorkování a experimentálnímu postupu – promíchání více kontaminovaných sedimentů s tenkou vrstvou na rozhraní vody-sedimentů – oxidace a precipitace redukovaných kovů díky provzdušňování požadovanému v testu toxicity Testy bioakumulace • Kontaktní testy – celý sediment • 28-56 dní expozice • In-situ a/nebo Ex-situ testy pro zhodnocení příjmu kontaminantů organismy • Používány zejména na lokalitách kontaminovaných bioakumulativními látkami (PAHs, PCBs, rtuť, PCDDs/PCDFs, ...) • Výsledky porovnávány s referenčními lokalitami a/nebo povolenými limity • Druhy: různonožec (Hyalella azteca), máloštětinatci (Lumbriculus variegatus, nitěnka obecná) In situ testy • Klecování – měkkýši, ryby, další bezobratlí, • Mortalita, zdravotní stav, příp. reprodukce a specifické biomarkery v exponovaných organismech • Subletální biomarkery, histologie Test subject: water Test subject: sediment Determination of macrozoobenthos saprobic index functional feeding groups life form index evenness & diversity Bioassays toxicity, cytotoxicity endocrine disrupting potential genotoxicity, mutagenicity Chemical analyses organical analyses limnochemical parameters heavy metals Ecosystem native & concentrated surface water whole sediment, sediment pore water, elutriate and organic - extracts ... in vitro and in vivo bioassays Integrated assessment of aquatic ecosystems THE SEDIMENT QUALITY “QUADRAD” Bioaccumulation Tests/Fish Tissue Analysis Sediment Toxicity Benthic Community Survey Sediment Chemistry Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky