ŘASOVÉ TESTY TROFIE A TOXICITY
1
Blahoslav Maršálek,
1
RECETOX, Kamenice 126/3, 625 00 Brno a Botanický ústav AVČR, Květná 8, 603 65 Brno,
Marsalek@brno.cas.cz
Základní použití a rozdělení:
Řasy jako zástupci primárních producentů ve vodních ekosystémech hrají v
ekotoxikologickém testování významnou roli. Řasové testy toxicity a trofie však vyžadují
určité vybavení a materiální i odborné zázemí laboratoře. Přesto jsou tyto testy používány i
v případech, kdy nemají opodstatnění a bylo by možno použít biotest s jinými producenty
(např. pro testování půdy).
Rozlišujeme řasové testy trofie a toxicity s mořskými řasami (Algal marine bioassay, ISO
10253, používající rozsivku Phaeodactylum tricornutum), nebo testy toxicity a trofie se
sladkovodními řasami (ISO 8692, OECD 201).
Další členění těchto testů je dle průtočnosti systému : klasické ISO normy jsou uvažovány
jako statické, publikovány jsou systémy průtočné a poloprůtočné. [1] RADETSKI A FERARD
1995.
Další členění je dle toho, zda používáme jednodruhové kultury, nebo tzv. multispecies test,
který pracuje se zástupci zelených řas, rozsivek a sinic o známých abundancích na začátku
testu.
Nejvíce variability lze nalést v desingu a způsobech vyhodnocování řasových testů trofie
a toxicity: klasický test probíhá v 250 ml E-baňkách, publikovány a SOP normované verze
jsou známy jako zkumavkové, kyvetové, kádinkové, ve scintilačních epruvetách,
v serologických destičkách na pevných půdách, v suspenzích atd. – přehled viz doktorské
práce [2]ROJÍČKOVÁ- PADRTOVÁ (1998) a [3]DVOŘÁKOVÁ (1999), které se věnovaly
řasovým testům a kde jsou citovány i předchůdci citovaných testů (např. test s vláknitou
řasou Cladophora dle Cyruse 1954 [4]) a jsou k dispozici na brněnském pracovišti BU.
Cílem tohoto příspěvku je komentovat vybrané body standardního testu ISO 8692,
upozorňovat na úskalí a nabídnout alternativy.
Podstata řasového testu trofie a toxicity ISO 8692
Česká republika přijala mezinárodní normu ISO 8692 (1987) jako svoji ČSN EN 28692.
Předmětem normy je metoda stanovení toxických účinků chemických sloučenin na
růst planktonních sladkovodních řas. Metoda je použitelná pro látky snadno rozpustné
ve vodě, které se výrazně nerozkládají nebo nevylučují ze zkoušeného systému.
Princip: Vzorek (zkoušená voda, roztok zkoušené látky) je po sterilizaci a naočkování
zkušebním organismem potřebnou dobu kultivován. Jednodruhové řasové kmeny se po
několik generací, minimálně však tři, kultivují v definovaném médiu, které obsahuje
koncentrační řadu zkoušené látky a inokula, a pravidelně se měří hustota buněk. Inhibice se
měří jako snížení růstu nebo růstové rychlosti v poměru ke kontrolní kultuře za stejných
podmínek.
Narostlá biomasa je nepřímo úměrné účinku toxických látek a přímo úměrné trofickému
potenciálu.
Rozlišit mezi toxicitou a nízkou trofií je možno přípravou koncentrační řady (lepší růst ve
zředěném vzorku značí toxicitu) a přídavkem např. EDTA, která váže těžký kov a tím zlepší
růst v této variantě.
Některé látky působí v nízké koncentraci neškodně či stimulačně, ale ve vysoké koncentraci
toxicky. Např. těžké kovy jsou mikroelementy, zředěny v živném roztoku, ale jedy ve vysoké
koncentraci.
Zkušební organismus
Jako zkušební organismus lze použít tyto planktonní sladkovodní řasy:1)
a) Raphidocelis subcapitata (KORŠ.) NYGAARD et al. (Selenastrum capricornutum),
kmen SKULBERG 1959/1 (doporučuje se pro srovnatelnost výsledků v mezinárodním
měřítku);
b) Chlorella kessleri FOTT et NOVÁK., kmen LARG/1;
c) Scenedesmus subspicatus CHOD., kmen LAPAILEUR/Camb. 276-20;
d) Scenedesmus quadricauda (TURP.)BRÉB., kmen GREIFSWALD/15;
e) Chlamydomonas reinhardtii. DANG., kmen UTEX 2246 137c mt+.
Srovnání organismů viz [5]DVOŘÁKOVÁ A KOL. 1999, [6]ROJÍČKOVÁ A MARŠÁLEK, 1999.
Příprava inokula
Řasové inokulum pro zkoušku se odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury.
Inokulační kultura se nasadí k předkultivací 2 dny před začátkem zkoušky takto:
Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml se odměří živný roztok a přidá se inokulum tak, aby
hustota buněk ve finální kultuře dosahovala předepsaných 10 000 v 1 ml.
Inokulační kultura se 2 dny provzdušňuje a udržuje při světelné intenzitě 30 W/m2(6000 lx) a
teplotě (30 ± 2) °C. . Koncentrace inokula na počátku testu by měla být co nejnižší, aby se
do testu zaneslo co nejméně živin a co nejvíce buněk se rozmnožilo pod vlivem zkoušené
látky, ale v praxi se řídí také detekčním limitem přístrojů používaných pro vyhodnocování
testu.
Živiny a jejich roztoky
Je předepsáno standardní testovací medium. Podstatná je koncentrace dusíku a fosforu,
mikroprvků, EDTA a forma dodání uhlíku. Zdrojem C je v ISO 8692 přídavek NaHCO3.
Tento způsob zásobení C je však evidentně slabým místem této normy a přivedl ji do "pH
pasti".
V samotném znění normy jsou rozpory: Na str.12 se požaduje přídavek hydrouhličitanu
a úprava pH zásobního roztoku živin na 8,3. Tato úprava pH je zbytečná, zásobní roztok
se 8x ředí, obohacuje různými koncentracemi testované látky či výluhu a nakonec inokulemů;
pH by se tedy mělo měřit a event. nastavovat až na začátku testu, v kultuře. Na str.14 však:
"Obvykle se zkouška provádí bez stanovení pH...Ke zjištění toxického působení, které není
způsobeno pH, se upraví pH prvního zásobního roztoku na pH 7,0..".
Zvýšení hodnoty pH na 8,3 však je i podmínkou využití C z hydrouhličitanu v kultuře
a dále vlastně důkazem příjmu C a zdravého průběhu fotosytézy. Pokud se hydrouhličitan
přidá do kultury a pH se upraví na 8,3 pak je provzdušňování zbytečné, naopak se jím sníží
pH a hydrouhličitan nemůže být využit.
Řasy jsou většinou schopny využívat jako zdroj C nejen CO2, ale i hydrouhličitan,
výsledkem i podmínkou je ale alkalinizace média [7]HIRAIWA, GOYAL ET TOLBERT
1993. Zvýšení pH o více nežli 1,5 však norma ISO 8692 považuje za důvod neplatnosti testu
(str.16). Přitom limitace CO2 nastupuje v kulturách již kolem výtěžku sušiny kolem 200
mg.l-1
, světlem až kolem 2 000 mg.l-1
.
Důvody pro eliminaci změn pH jsou správné, neboť pH může měnit toxicitu těžkých
kovů a to snižovat i zvyšovat.
Snaha o zásobení řas C z hydrouhličitanu tedy zavádí ISO 8692 do slepé uličky.
Hydrouhličitan vyžaduje zvýšení pH nad 8,3 aby mohl být využit, další zvýšení je nezbytným
následkem fotosyntézy, zároveň však je zvýšení o více nežli o 1,5 důvodem pro zrušení
výsledku. Protismyslně u vzorků, kde fotosyntéza probíhá a vzorek tedy neobsahuje toxickou
látku je výsledek zrušen!
Kultivační nádoby
Standardní test doporučuje E-lahve o objemu 250 ml. Tato technika kultivace u ISO 8692
je pro rozsáhlejší soubory těžkopádná a náročná na práci. Tato i další klasické procedury
doporučují kultury o objemu 100-500 ml, což klade velké nároky na prostor a investice
(klimatizace, temperace lázní I místnosti. Takto velké objemy jsou ale vlastně zbytečné,
pro stanovení počtu buněk či optické hustoty i sušiny jsou třeba řádově jen ml suspenze.
Především se nabízí myšlenka kultury miniaturizovat a dosáhnout tak zvětšení počtu
variant a opakování i úspory provozní. Dále pak vynechat přídavek hydrouhličitanu a sytit
kultury plynným oxidem uhličitým. Odpadne tím nutnost úpravy pH vzorků i následná
alkalinizace. Pro laboratorní účely cena CO2 není podstatná.
Miniaturizace šla cestou od E-lahví, přes 2- 10-15 ml zkumavky, 5-10cm kyvety, 5-10 ml
scintilační epruvety, 1ml jamky 12-24 jamkové destičky na tkáňové kultury až po serologické
destičky s objemem 0,2 ml.
Inkubace
Destičky se inkubují v kultivačním zařízení při optimální teplotě pro testovací organismus
(Raphidocelis 28 °C při světelné intenzitě 30 W/m
2
(6-9.000 lux). Nižší teplota uváděná na
úrovni 24°C je od optima poněkud vzdálena a je neopodstatněná. Také formulace min. 4000
lux. je nepřijatelná, protože při světelných intenzitách nad 10.000 lux. dochází k fotoinhibici,
především v prvním dni kultivace. Dále se různá provedení řasových testů toxicity a trofie
liší v způsobu míchání kultur: rozlišujeme testy stacionární, probublávané sterilovaným
vzduchem s přídavkem CO2, nebo bez), třepané na třepačkách, nebo magneticky míchané.
Cílem je udržet buňky řas v maximálním kontaktu s toxikantem a zdrojem živin, nevýhodou
může být možnost kontaminace např. při probublávání nesterilním vzduchem.
Vyhodnocování testu - Měření růstu
Výsledky lze vyjadřovat pomocí metod přímých a nepřímých:
Mezi přímé metody patří kvantifikace počtu buněk (mikroskopicky, flow cytometricky),
gravimetricky, objemovou biomasou (centrifugací v kalibrovaných zkumavkách).
Mezi nepřímé metody kvantifikace biomasy, která narostla v přeběhu řasového testu patří:
stanovení spalného tepla na mikrokalorimetru, CHN analýza, kvantifikace chlorofylu a
spektrofotometricky, nebo pomocí fluorescence chlorofylu, kvantifikace enzymatické aktivity
( esterázy, galaktosidázy, hydrogenázy, RUBISCO), stanovení rychlosti příjmu klíčových
živin (úbytek dusičnanových iontů z roztoku selektivní elektrodou), hodnocení
fotosyntetické asimilace – produkce O2, spotřeba CO2 (plynovou chromatografii, nebo jako
14
C, nepřímo, leč poměrně citlivě lze využít změnu pH roztoku pH indikátory, nebo pH
metrem viz [9] LUKAVSKÝ, A MARŠÁLEK (1997).), analýza dynamiky fluorescence Kautského
kinetikou atd. V současné době existují desítky způsobů vyhodnocování řasových testů
toxicity a trofie, které popisují stovky publikací. Přehled těchto metod není předmětem tohoto
sdělení, podrobnosti autoři rádi sdělí.
Je jisté, že každá metoda má své výhody i nevýhody a má různé uplatnění pro různé typy
vzorků. Např. u přírodních vzorků je důležité zohlednit především zákal a zabarvení, proto je
vhodné při používání běžně rozšířené metody vyhodnocení pomocí optické hustoty
promyslet alternaci například s druhou nejrozšířenější metodou – počítání buněk pod
mikroskopem v potřebných intervalech (1 den až 5 dní, 14-21 dní v případě spec.testů trofie)
se měří přírůstky biomasy řas. Nejčastěji se počítají buňky pod mikroskopem, nebo se měří
absorbance v jamkách při 750 (680) nm do dosažení konstantní hodnoty (stacionární fáze
růstové křivky). Tato hodnota se přepočte na výtěžek sušiny (podle konverzních křivek).
Obsah jamek je také možné pipetou přenést do kyvety běžného spektrofotometru a proměřit
Výpočet EC50
Výpočet integrálu biomasy A:
).(
2
2
.....).(
2
2
.
2
1
01
12
021
1
01
−
−
−
−+
++−
−+
+
−
= nn
nn
tt
NNN
tt
NNN
t
NN
A
t1, t2, tn-1, tn = časy měření
N0, N1, N2, Nn-1, Nn = počty buněk v jednotlivých časech
Inhibice Iai pro každou sledovanou koncentraci:
c = integrál biomasy kontrolního vzorku
e
odnocení EC50 pomocí růstových rychlostí μ:
n = počet buněk v 1 ml v závěru testu
u
hibice Ii pro každou sledovanou koncentraci:
c
ic
ai
A
AA
I
−
=
A
Ai = integrál biomasy sledované koncentrac
H
Růstová rychlost se počítá podle vzorce:
N
N0 = počet buněk v 1 ml na počátku test
t = délka testu
In
nt
n 0
=μ
NN lnln −
c
ci
iI
μ
μμ −
=
μc = růstová rychlost kontrolního vzorku
μi = růstová rychlost sledované koncentrace
Hodnoty EC50 se počítají pomocí probitové analýzy podle následujícího postupu:
1. K získání přesné hodnoty je potřeba nejméně 5 pozorování v rozmezí 5 – 95%
inhibice.
2. Koncentrace látky se logaritmuje (log c nebo ln c).
3. Inhibice se vyjádří v procentech, tyto hodnoty se převedou na probity.
4. Získané hodnoty se vynesou do grafu, kde na ose x leží jednotlivé logaritmy
koncentrace a na ose y odpovídající probity.
5. Vynesenými body se proloží přímka. Odečte se hodnota logaritmu koncentrace, při
které je probit rovný 5 (tj. při 50% inhibici).
6. Odlogaritmováním se získá hledaná koncentrace EC50
Celý postup je možné atomatizovat pomocí počítačového programu
Stanovení trofického potenciálu
Trofický potenciál se určí odečtením sušiny biomasy v kontrolním vzorku od sušiny biomasy
ve vzorku vody. [8]LUKAVSKÝ a kol. 1995
Podle tabulky 1 se určí stupeň trofie.
Tabulka 1 - Klasifikační tabulka pro hodnocení trofie
Hodnoty sušiny v mg/l.- přepočty dle konverzní křivky z OD 750
Stupeň
trofie
Autor
stupnice
Katarobní Ultraoligo Oligo Oligomezo Mezo Mezoeutro Eutro Poly Hypertrofní
Sládeček
1979
<5 <25 <50 <100 <500 <3 000
<5 5-50 50-200 200-
500
500-
1 000
>1 000
Žáková
1980
Žáková
1986
<5 <50 <100 <200 <350 <500 <1000 <1 000
Zkouška na limitující živiny
Stanovení trofického potenciálu je možno doplnit o zkoušku na limitující živiny.
Vzorek vody se selektivně obohatí o P, N, P+N, popř. o další prvky, např. podle schématu:
vzorek (bez obohacení)
2 ml vzorku + 50 μl roztoku (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l)
2 ml vzorku + 50 μl roztoku (konečná koncentrace dusíku 1 mg/l)
2 ml vzorku + 50 μl roztoku + 50 μl roztoku (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l a
dusíku 1 mg/l)
vzorek + další prvky (koncentrace se vypočítají z živného roztoku).
Roztoky se sterilizují v množství 2 ml v otevřených Petriho miskách 2 hodiny ve sterilizačním
zařízení (viz příloha B). Sterilní roztoky se přelijí do sterilních lékovek.
Stanovení podílu vázaných živin
Podíl živin vázaných v sestonu je možno stanovit porovnáním trofického potenciálu
nefiltrovaného vzorku se vzorkem, z něhož byl seston odstraněn filtrací nebo odstředěním.
Protokol o zkoušce
V protokolu o zkoušce se uvede:
a) odkaz na použitou metodu;
b) identifikace vzorku nebo zkoušené látky;
c) zkušební organismus: druh, původ, kmenové referenční číslo, způsob kultivace;
d) podrobné údaje o zkoušce:
1) datum zahájení a doba trvání;
2) koncentrace zkoušené látky a ředění vzorku;
3) složení živného roztoku;
4) kultivační zařízení a inkubační postup;
5) intenzita osvětlení;
6) teplota;
7) metoda měření hustoty buněk, použitá konverzní rovnice;
e) výsledky:
1) absorbance v jamkách sérologické destičky v každé fázi měření;
2) sušina biomasy v jamkách sérologické destičky ve stacionární fázi růstové křivky;
3) hodnoty EC50;
4) hodnoty trofického potenciálu;
f) další skutečnosti významné z hlediska užitého postupu.
Tab.2. Srovnání pořadí toxicity těžkých kovů pro některé řasy.
Řasa Pořadí toxicity
Scenedesmus quadricauda (TURP.) BREB. Cd >Pb>Cu>Ni/Zn
Sc. quadricauda (TURP.) BREB Cu>Ni>Cd>Pb>Zn>Co>Cr
Sc. quadricauda GREIFSW./15 Cd>Cr>Al>Co>Ni>Cu>Pb>Zn>Fe
Sc.subspicatus LEPAIL./Cambr.276-20 Cd>Cr>Al>Co>Ni>Cu>Zn/Pb>Fe
Scenedesmus sp. Cd>Ni>Se>Cu>Pb
Raphidocelis subcapitata SKULB./1959/1 Cu>Ni>Co>Cr>Cd>Zn
R.capitata SKULBERG/1959/1 Cd>Cu>Co>Cr/Al>Ni>Pb>Fe>Zn
Chlorella vulgaris Cd>Cu>Hg>Zn>Pb
Chl. kessleri LARG/1 Cu>Cr/Al>Cd>Zn>Co>Ni>Pb>Fe
Chl. protothecoides KRUGER [ pH 6.5] Hg>Th>Cu>Cr>Se>Cd>Ni>Co
Chl. saccharophila KRUG.)MIGULA. [pH 6.5] Se>Cu>Hg>Th>Cr>Cd>Ni>Co.
Chl. saccharophila KRUG.)MIGULA Cu>Zn>Cd>Pb
Chlorella sp. Cd>Cu>Ni>Co>Pb
Stichococcus bacillaris NAEG. [pH 6.5] Hg>Cu>Se>Th>Cr>Ni>Co>Cd
Dunaliella tertiolecta Cu>Hg>Pb>Cd
Cladophora glomerata L(KUTZ.)[pH 5.5] Cr>Pb>Cu>Cd>Ni>Co>Zn
Cl. glomerata L(KUTZ [pH 8.5] Cr>Pb>Zn>Cu>Cd>Ni>Co
Phaeodactylum tricornutum BOHL. Hg>Cu>Pb>Cd
Další metodiky a alternativy řasových testů toxicity
Standardní test toxicity prováděný v 250 ml Erlenmayerových baňkách je značně
neekonomický, a proto byly vypracovány miniaturizované metody, které dnes již nejsou
považovány za druhořadou alternativu, ale za určitých podmínek dávají zcela srovnatelné
výsledky. Standardizovaná metoda řasového mikrobiotestu je součástí také českých
oborových norem vodního hospodářství TNV 75 7741 [8] LUKAVSKÝ a kol. 1995.
Alternativní testy pak mohou probíhat na sérologických destičkách, v kyvetách, zkumavkách
atd. viz práce [2] ROJÍČKOVÁ- PADRTOVÁ (1998) a [3] DVOŘÁKOVÁ (1999),
Metodika řasového mikrobiotestu
Celý test probíhá za sterilních podmínek. Jako testovací organismus se využívají řasy
Raphidocelis subcapitata, Chlorella kessleri, Scenedesmus subcapitata, Scenedesmus
quadricauda a Chlamydomonas reinhardii. Řasa je předkultivována (3 dny) a je připraveno
inokulum o koncentraci 4*105
buněk/ml. Do jamek s testovaným roztokem se přidá řasové
inokulum tak, aby jeho výsledná hustota byla 104
buněk/ml. Na jedné destičce lze testovat
devět koncentrací v šesti opakováních, jeden sloupec je vždy kontrola. Destičky se inkubují
při 28-32 o
C, při světelné intenzitě 30 W/m2
a při 2% objemových CO2. Test se vyhodnocuje
spektrofotometricky při 750 nm nebo 680 nm, určí se procento inhibice a pro zkoušenou látku
se vypočte EC50 (TNV 75 7741, 1995). Hodnotit lze také počet buněk počítačem částic [9]
BLAISE ET AL. 1986.
• Srovnání se standardním testem, reprodukovatelnost
BLAISE ET AL. (1986) ověřili shodu řasového mikrobiotestu na destičkách se standardním
testem toxicity v baňkách při testování 25 odpadních vod a 6 kovů (s řasou Raphidocelis
subcapitata). Výsledky testování devíti herbicidů na destičkách a v baňkách se také poměrně
dobře shodovaly [10] BLAISE 1993. Dobrá korelace mezi výsledky obou řasových testů byla
demonstrována pro fenol, některé kovy a herbicidy [11] St. LAURENT ET AL. 1992. Řasový
mikrobiotest má dobrou reprodukovatelnost - intralaboratorní koeficient variance je mezi 11-
41% [9] BLAISE ET AL. 1986, [12] THELLEN ET AL. 1989. Dle našich zkušeností klasická a
miniaturizovaná metoda nejsou přímo srovnatelné, vedle různého průniku světla a CO2 do
kultur, hlavně proto, že růstové křivky nejsou časově synchronizovány. Např. exponenciální
fází prochází kultura v E-baňce v čase kolem 60-90 hodin v mikrodestičce kolem 80-110
hodin. Konečný výsledek tj. letální koncentrace dané látky vyjdou však shodně.
• Využití a výpovědní hodnota
Mikrobiotest je využíván především pro testování kovů, herbicidů, případně organických
látek. Vhodné je i jeho využití při testování odpadních vod, povrchových nebo podzemních
vod. Dle zkušeností není příliš vhodný pro testování vzorků, které mají zákal nebo zbarvení
(např. extrakty z půd a tuhých odpadů), nebo vzorků, které vykazují silnou stimulaci
řasového růstu (možnost překrytí toxicity). V takovémto případě lze spektrofotometrická
měření alternovat jinou metodikou vyhodnocení (viz níže).
Další alternativy řasových testů toxicity
Při testování zakaleného nebo zabarveného vzorku lze testy vyhodnotit počítáním buněk pod
mikroskopem nebo použitím počítače částic [13] REHNBERG ET AL. 1982, [14] BUTTERWICK
ET AL. 1982) nebo lze využít hodnocení metabolické aktivity řas. Nejčastěji jsou využívány
markry procesů spojených s fotosyntetickou asimilací, procesy přenosu přes membrány a
aktivita klíčových enzymů. V souvislosti s fotosyntetickou asimilací jsou měřeny parametry
příjmu oxidu uhličitého, výdeje kyslíku titrací nebo chromatograficky [15] Poskuta 1991,
změny v obsahu intracelulárního ATP [16] HICKEY ET AL. 1991. Další jednoduchá a vhodná
cesta využívá fakt, že řasy svou metabolickou aktivitou zvyšují pH svého okolí. To lze velmi
jednoduše měřit pH metrem v biosenzoru s imobilizovanámi řasami [17] LUKAVSKÝ A
MARŠÁLEK, 1996.
Další metodický přístup využívá přirozené fluorescence chlorofylu, která je přímo úměrná
hladině stresových faktorů a toxikantů [18] SAMSON A POPOVIC 1988. Dříve hojně využívaný
14
C-asimilační test [19] NYHOLM A DAMGAARD 1990 je postupně nahrazován
fluorescenčními markry jako například fluoresceindiacetátem (FDA), který vykazuje
vysokou korelaci s fotosyntézou [20] GALA A GIESY 1994. FDA je lipofilní nepolární a
nefluorescentní molekula, která rychle proniká buněčnou plasmatickou membránou. Uvnitř
buňky je FDA hydrolyzován nespecifickými esterázami, což vyúsťuje ve vznik
fluorescentního aniontu fluoresceinu. Fluorescein je hydrofilní a zůstává při neporušené
buněčné membráně. Proměnnou pro kvantifikaci životnosti po obarvení FDA je buďto
celková zelená fluorescence emitovaná buněčnou suspenzí a měřená spektrofluorometrem
nebo množství zeleně fluoreskujících buněk v této suspenzi stanovovaných epifluorescenční
mikroskopií nebo flow cytometrem [21] ST-LAURENT A BLAISE 1995.
• Metodika barvení FDA
Fluorescein diacetát se připravuje ředěním v acetonu nebo dimetylsulfoxidu. Řasa se inkubuje
s testovanou látkou 5 hodin. Poté se FDA smíchá s řasou, jako blank se smíchá řasa s ředící
organickou látkou a voda s FDA. Délka inkubace je různá (4-60 minut) a může probíhat na
mikrotitračních destičkách nebo ve zkumavkách. Obarvené buňky jsou excitovány světlem z
argonového laseru (488 nm) a měří se zelená (530nm) fluorescence a červená (> 620 nm)
autofluorescence. Množství živých zeleně fluroeskujících buněk ve směsi je stanovováno
epifluorescenční mikroskopií nebo flow cytometrem [22] BERGLUND A EVERSMAN 1988, [23]
GILBERT ET AL. 1992, [24] GALGANI ET AL. 1992.
• srovnání se standardním testem
Měření letality řasových buněk za pomocí flow cytometrie bylo srovnáno s růstem řasových
kolonií na agarových plotnách (CFU). Mezi oběma metodami byla doložena vysoká korelace
a nebyly zjištěny žádné významné rozdíly. Barvení buněk pomocí FDA je spolehlivá metoda
k odlišení živých a mrtvých buněk [21] ST-LAURENT A BLAISE 1995.
Byly srovnávány EC50 z vyhodnocení životnosti buněk po obarvení FDA za 48 hodin s 96
hodinovou EC50 pro růstovou rychlost. Obě metody měly podobné EC50 pro algicidní
surfaktant dodecyl sulfát sodný, ale buněčná životnost byla méně citlivá k působení herbicidu
atrazinu, který je algistatický. Na rozdíl od růstové rychlosti, byla flow cytometrie schopna
rozlišit mezi algicidními a algistatickými toxikanty [20] GALA A GIESY 1990.
Zhodnocení a použitelnost alternativ řasových testů toxicity
Testy toxicity využívající řasy mají nezastupitelné místo v ekotoxikologickém testování.
Jejich specifičnost je také v tom, že během doby expozice (3-4 dny ) je toxickému vlivu
vystaveno 4-5 generací populace, takže se v případě řas častěji hovoří o subchronickém testu
než o testu akutní toxicity.
Pro monitoring životního prostředí je vhodnější využít miniaturizované řasové testy, neboť
mají výpovědní hodnotu identickou s tzv. konvenčními testy a navíc mají podstatně vyšší
produktivitu, která je vhodná pro velkoplošný monitoring.
Řasové testy trofie a toxicity by měly být používány především pro testování látek, které se
dostanou do vody, monitoring povrchových, podzemních a odpadních vod a vodních
ekosystémů. Je však málo pochopitelné, když jsou tyto testy používány na testování vzorků
půdy, kde máme možnost využít testů toxicity s terestrickými producenty.
Literatura
[1] RADETSKI, C. M., J. F. FERARD (1995). “A Semistatic Microplate-Based Phytotoxicity Test.” Environmental
Toxicology and Chemistry Vol 14(Iss 2): pp 299-302
[2] ROJÍČKOVÁ-PADRTOVÁ R.: Algal assays. PhD. Thesis. MU Brno, 1999.
DVOŘÁKOVÁ, D: ŘASOVÉ TESTY TOXICITY. VŠVF, BRNO, 1999
[3] DVOŘÁKOVÁ D. (1999) Řasové testy toxicity. Doktorská disertační práce, VŠVF Brno, 89s.
[4]CYRUS, Z.(1954): Otázky biologického čištění odpadních vod. Péče o čistotu vod 3:161-169.
[5] DVOŘÁKOVÁ, D., R. ROJÍČKOVÁ-PADRTOVÁ, MARŠÁLEK B. (1999). “Is the Replacement of Scenedesmus
quadricauda L. by Selenastrum cornutum L. in Toxicity Tests Reasonable?” Pol. Arch. Hydrobiol. 46(3-4): 345-
352.
[6] ROJÍČKOVÁ-PADRTOVÁ, R. AND B. MARŠÁLEK (1999). “Selection and Sensitivity Comparisons of Algal
Species for Toxicity Testing.” Chemosphere Vol 38(Iss 14): pp 3329-3338.
[7]. SHIRAIWA, M., GOYAL, A. et TOLBERT, N.E. (1993): Alkalization of the medium by unicellular green
algae during uptake of dissolved inorganic carbon. - Plant Cell Physiol. 34:649-657.
[8]. LUKAVSKÝ,J., MARŠÁLEK,B. & FREMROVÁ,L. (1995): Mikrometoda stanovení toxicity a trofického
potenciálu řasovým testem. - Odvětvová technická norma vodního hospodářství TNV 757741, 15pp.
[9] LUKAVSKÝ, J. AND B. MARŠÁLEK (1997). “The Evaluation of Toxicity by a Biosensor with Immobilized
Algae.” Algological Studies 85: 147-155.
[9] C. BLAISE, R. LEGAULT, N. BERMINGHAM, R. VAN COILLIE AND P. VASSEUR(1986).: A simple microplate
algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Tox. Assess. 1, 261-281
[10] C. BLAISE(1993).: Practical laboratory application with microalgae for hazard assessment of
aquatic contaminants. In: M. Richardson (Ed.) Ecotoxicology monitoring, VCH Basel, p. 384
[11] D. ST-LAURENT, C. BLAISE, P. MACQUARRIW, R. SCROGGINS AND B. TROTTIER (1992).: Comparative
assessment of herbicide phytotoxicity to Selenastrum capricornutum using microplate and flask
bioassay procedures. Environ. Toxicol. Water Qual. 7, 35-48
[12] C. THELLEN, C. BLAISE, Z. ROY AND C. HICKEY(1989).: Round robin testing with the Selenastrum
capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia 188/189, 259-268
[13] B. G. REHNBERG, D. A. SCHULTZ AND R. L. RASCHKE(1982).: Limitations of electronic particle
counting in reference to algal assays. J. WPCF 54, 181-186
[14] C. BUTTERWICK, S. I. HEANEY AND J. F. TALLING(1982).: A comparison of eight methods for
estimating the biomass and growth of planktonic algae. Br. phycol. 17, 69-79
[15] J. W. POSKUTA: (1991). Toxicity of heavy metals to growth, photosynthesis and respiration of
Chlorella pyrenoidosa cells grown either in air or 1% CO2. Photosynthetica 25, 181-188
[16] C. W. HICKEY, C. BLAISE AND G. COSTAN: (1991) Microtesting appraisal of ATP and cell recovery
toxicity end points after acute exposure of Selenastrum capricornutum to selected chemicals. Environ.
Toxicol. Wat. Qual. 6, 383-403.
[17] J. LUKAVSKÝ AND B. MARŠÁLEK: (1996) The evaluation of toxicity by biosensor with immobilized
alga Selenastrum capricornutum. Algol. Stud. 89, 234-239,
[18] G. SAMSON AND R. POPOVIC: (1988). Use of algal fluorescence dor determination of phytotoxicity
of heavy metals and pesticides as environmental pollutants. Ecotox. Environ. Saf. 16, 272-278
[19] N. NYHOLM AND B. M. DAMGAARD: (1990). A comparison of the algal growth inhibition toxicity test
method with the short term 14
C-assimilation test. Chemosphere 21, 671-679
[20] W. R. GALA AND J. P. GIESY(1994): Flow cytometric determination of the photoinduced toxicity of
anthracene to the green alga Selenastrum capricornutum. Environ. Toxicol. Chem. 13, 831-840.
[21] D. ST-LAURENT AND C. BLAISE: (1995), Validation of a microplate-based algal lethality test
developed with the help of flow cytometry. In: M. Richardson (Ed.) Environmental Toxicology
Assessment, Taylor & Francis, London, UK pp. 137-155.
[22] D. L. BERGLUND AND S. EVERSMAN (1988).: Flow cytometric measurement of pollutant stresses on
algal cells. Cytometry 9, 150-155
[23] F. GILBERT, F. GALGANI AND Y. CADIOU (1992): Rapid assessment of metabolic activity in marine
microalgae: application in ecotoxicological tests and evaluation of water quality. Mar. Biol. 112, 199-
205.
[24] F. GALGANI, Y. CADIOU AND F. GILBERT (1992).: Simultaneous and oterative weighted regression
analysis of toxicity tests using a microplate reader. Ecotox. Environ. Saf. 23, 1-7