Ekotoxikologické biotesty: rozdělení, přehled, použití. Prof. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc., Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Botanický ústav AVČR, Lidická 25 Brno a RECETOX Definice biotestu • Biotest lze definovat jako proces, při němž je testovací systém (tkáně, organismus, populace apod.) exponován v přesně definovaných podmínkách různými koncentracemi zkoumané chemické látky nebo směsného či přírodního vzorku. Rozdělení ekotoxikologických biotestů (základní přehled těch nejčastějších) • Dle doby expozice dělíme ekotoxikologické biotesty na • akutní • semiakutní (semichronické) • chronické Dle testovacího uspořádání“ • Statické • Semi-statické • Průtočné Dle pokročilosti designu testovacího systému (Také 4 generace biotestů)  1. generace -klasické (standardní)  2. generace -mikrobiotesty  3. generace -biosenzory, biosondy a biomárkry  4. generace – on-line systémy s dálkovým přenosem dat Dle trofické úrovně testovacích organismů • producenti, • konzumenti, • destruenti Dle testované matrice • voda, • půda, • vzduch, • sediment, • odpad, • chemická látka • Nosiče aktivních látek a disperganty nanomateriálů Dle spektra testovacích organismů • Jednodruhové (Single Species), • Vícedruhové (Multi Species s přírodními populacemi i laboratorní směsi kultur) Dle typu testovaného vzorku • čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé), • směs látek (známých i neznámých), • přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné, s neznámými interakcemi - nejsložitější interpretace Dle způsobu přípravy vzorku • definované koncentrace chemických látek, • testování výluhů přírodních vzorků (extrakce org. rozpouštědly, DMSO, vodou, různé pH, teplota atd.) , • semipermeabilní membrány, • přímé testy (Direct Tests, Solid Phase Tests, Whole Effluent etc.) • TIE (C-18, AC, pH….) Dle stupně komplexnosti detekčního systému (Od nejjednodušších k nejsložitějším ) • enzymy, • biosondy, • buněčné a tkáňové kultury in vitro , • intaktní živý organismus, • populace, • micro/mezo kosmos, • terénní experimenty Dle způsobu vyhodnocování • letální efekty (mortalita, imobilizace), • subletální efekty (chování organismů – např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické aktivity (fotosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, přírůstky – délka kořene, počet buněk v populaci, nebo hmotnost organismu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod)., • reprodukční aktivita, • malformace a teratogenita atd. Specielní testy pro hodnocení rizik v životním prostředí • trofie, • mutagenita/genotoxicita nejen na bakteriích, ale také na rostlinnách, volně žijících zvířatech a rybách, • teratogenita, například na obojživelnících - Xenopus laevis, • embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojživelnících, ptácích, hraboších apod. • Detekce spec. mechanismů (endokrinní disruptory, TCDD apod.) Biotesty procesů • Biokoncentrace • biokumulace • testy pro hodnocení biodegradability Stanovení ekotoxicity - souhrn 1) Standardní biotesty 2) Alternativní biotesty 3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy) 4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace ...) 5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty – obratlovci, savci "humánní toxikologie" 6) Experimentální mikro a mezokosmy 7) Polní studie Ekotoxikologické biotesty Laboratorní ekotoxikologické biotesty In situ hodnocení efektů STANDARDNÍ (standardizované) EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY  Standardizace – maximální standardizace kroků experimentálního postupu s cílem omezit faktory "intra-laboratorní" variability  Výhody standardních biotestů – zaručení jednotnosti a opakovatelnosti výsledků – při dodržení postupu - srovnatelnost výsledků z různých laboratoří – validované výsledky (viz dále) jsou vhodné pro ROZHODOVÁNÍ (sanace, pokuty ...) – malá nutnost optimalizace ...  Nevýhody standardních biotestů – velmi specifická a omezená vypovídací hodnota ("akutní letalita pro korýše Daphnia"), zpravidla vhodné jen pro zařazení (klasifikace) toxicity látek (více – středně – méně toxické ...) – omezený počet standardizovaných postupů, zpravidla jednoduché (akutní) efekty EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Každý biotest (jednodruhové, vícedruhové, mikrokosmy ...) je pouze zjednodušením = modelem ekosystému • cílem ekotoxikologických studií je pochopení, charakterizace a ev. předpověď účinků v celých populacích, společenstvech, ekosystémech • z experimentálních výsledků je nutno provádět EXTRAPOLACE • ? jsou laboratorní druhy relevantní pro přírodní organismy • ? je laboratorní expozice (voda) relevantní pro přírodní podmínky (sediment) • ? jsou výsledky na jednom druhu relevantní pro populaci, společenstvo • ? jsou výsledky in vitro testu (stanovení dioxinové toxicity) relevantní pro efekt na celém organismu • pro vyjádření nejistot plynoucích z extrapolací jsou často používány tzv. extrapolační faktory nebo faktory nejistoty - (UF – uncertainity factors, UF = 1, 5, 10 - 1000) - aplikace = násobení (dělení) získaných výsledků Interpretační potenciál ekotoxikologických biotestů • Dobře definují toxický potenciál čistých látek • Biotesty počátečního skríningu (tzv. toxicity presence/absence tests). • Propojení s chemickými analýzami, aby determinovaly a prioritizovaly vysoké hladiny, nebo biodostupnost kontaminant v přírodě. • Upozorní na interakce mezi přítomnými polutanty, které z chemických rozborů nevyplývají. • Pozor na přímé interpretace lab. testů pro přírodní podmínky!!!! EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Experimentální design • Komplexnost biologického systému • Doba expozice • Uspořádání expozice • Expoziční scénář • Biologický systém – organismus, druh • Další specifika biologického systému • Hodnocený parametr, endpoint • Další abiotické faktory v experimentu In situ & In vitro • in situ (terénní) + dlouhodobá expozice • integrace toxických vlivů • mnoho neznámých faktorů, problematická interpretace dat • in vitro (laboratorní) + faktory pod kontrolou, standardizované, srovnatelné, jsou v legislativě • - některé biotesty jsou vzdáleny přírodě - pozor při interpretaci! Současné trendy v ekotoxikologických biotestech • Miniaturizace • zkrácení doby inkubace při zachování citlivosti testu • zjednodušení a možnost alternací při vyhodnocování testu (fluorescenční metody, molekulární sondy, průtoková cytometrie atd.) • bezpodmínečná nutnost zapojení biotestů reprezentujících různé trofické úrovně v ekosystému - kombinace- viz text! • využití nových vědeckých poznatků (nové Drafty norem) • Co nejvíce se přibližovat při testování reálné situaci v terénu • Stále častěji také sada biotestů zaměřených na mutagenitu, genotoxicitu, teratogenitu a biochemické márkry, enzymatické aktivity, či buněčné kultury, zaměřené na konkrétní typ látky, nebo účinku. • Dálkový přenos dat z on-line systémů Mikrobiotesty II. generace Mezi biotesty II generace, tzv. mikrobiotesty patří ty které: • využívají klidová. stadia testovacích organismů nevyžadují udržování a kultivaci matečných kultur (MetPad, SOS chromotest, Chromotoxkit, Sediment Chromotest, Microtox Thamnotoxkit, Rotoxkit, Daphtoxkit, Ceriotoxkit, Protoxkit, Algatoxkit.. . .... ) • nahrazují používání zvířat pro testy toxicity (in vitro tkáně ryb, baterie Thamno-Roto-Chromo, ....) • šetří laboratorní a kultivační prostor, vyžadují jen malé objemy vzorků, lze najednou zpracovat Mikrobiotesty II. generace Možnosti využití mikrobiotestů • čistírny odpadních vod (odpadní vody, čistírenské kaly, ověření účinnosti čistírenského procesu) • testování reziduí pesticidů a kontaminace zemědělských půd • monitoring úniků cizorodých látek ze skládek různých typů odpadů • sledování dopadů a rozšíření ekologických havárií, monitoring procesu dekontaminace po havárii • monitoring kontaminace podzemních vod • sledování biodegradability látek v modelových a přírodních podmínkách • rychlé screeningové testování nových látek a chemikálií • nasazení všude tam, kde se používají standardní ekotoxikologické biotesty, ale je zapotřebí zpracovat Srovnáni citlivosti standardních organismů používaných pro EB (dvojchroman draselný – mg/l) Poecilia reticulata 180 (120- 240) Lemna minor 30 (10-60) Sinapis alba 25 (10-40) Microtox 3,8 (2,1-5,5) Daphnia magna 1,4 (0,8-1,8) Pseudokirchneriella subcapitata 0,5 (0,24-0,78) Thamnocephalus platyurus 0,1 (0,08-0,25) Citlivost k toxikantům je „species- dependent“ Proto jsou nutné baterie testů!!! Složené z různých organismů!!! Ekotoxikologické biotesty – ceník Používané & použitelné • Přehled uvedený v textu = 1. Generace EB • Národní legislativy mají již i normy na 2. generaci (mikrobiotesty) – ČR také!!! • Úpravy a modifikace musí být popsány a zdůvodněny • Pro speciální případové studie lze využít speciální (opakovatelné a validované) testy Agentury a ekotoxikologické biotesty • agentury, které vydávají a aktualizují normy a metodiky také v oblasti ekotoxikologických biotestů. • V USA je to U.S. EPA, a ASTM, • v Kanadě je to například Environment Canada, • ve Francii AFNOR, • v Německu DIN Situace v ČR • ČSN • ČSN-EN-ISO. • Aby to nebylo jednoduché, jsou současně platné například také tzv. oborové normy pro jednotlivé resorty, či odvětví. Příkladem mohou být Oborové normy pro vodní hospodářství, které mají označení TNV. Závěr • Schopnost sestavit takovou baterii ekotoxikologických biotestů, která bude mít co nejreálnější vypovídací hodnotu a jejíž interpretace bude přesně odpovídat na problematiku studované lokality patří k důležitým znalostem každého ekotoxikologa. K tomu je samozřejmě důležité mít přehled o možnostech nejen v normovaných testů, ale také jejich alternativ a nových publikací oboru.