Bi6270c Cvičení z cytogenetiky
2018
Oddělení genetiky a molekulární biologie
Ústav experimentální biologie
PřF MU
Bakalářský studijní program Experimentální biologie:
Mateřské studijní obory:
Lékařská genetika a molekulární diagnostika
Molekulární biologie a genetika
Cytogenetika 2/0
Cytogenetika - cvičení 0/2 na PřF MU
Organizační záležitosti
Mgr. Markéta Wayhelová
• e-mail: marketa.wayhelova@mail.muni.cz
Mgr. Marta Hanáková, Mgr. Jan Smetana, PhD.
• Integrované laboratoře molekulární cytogenetiky
• Odd. genetiky a molekulární biologie
Ústav experimentální biologie PřF MU
• Oddělení lékařské genetiky FN Brno
http://www.sci.muni.cz/cytogenlab/
Organizační záležitosti
• jarní semestr 2018 – cvičení 12 vyučovacích týdnů
• 3 skupiny – A, B, C; cvičení každý třetí týden – 4 hod.
Místo cvičení:
• Univerzitní kampus, A13, Bohunice – Kamenice
• pavilon A36/209
• pavilon A3, 3. poschodí, Laboratoře molekulární cytogenetiky
Organizační záležitosti
• Podmínky pro udělení zápočtu:
• přítomnost na každém cvičení
• soustředěné pracování a základní znalosti na
každém cvičení
• Literatura
• Kuglík, P.: Základy molekulární cytogenetiky člověka,
Masarykova univerzita, Brno - pdf
• Michalová, K.: Úvod do lidské cytogenetiky, Institut pro další
vzdělávaní, Brno
• Nussbaum R. L., McInnes R. R., Willard H. F.: Thompson &
Thompson – Klinická genetika. Triton, Praha, 2004
Poučení o bezpečnosti při práci
1) Do laboratoře vstupujeme jen se souhlasem vyučujícího a v pracovním oděvu.
2) Před začátkem vlastní práce se seznámíme s pracovním návodem a během práce jej
dodržujeme. Smíme provádět pouze práce, které jsou nařízeny a povoleny vyučujícím a
pod jeho dohledem.
3) Před začátkem vlastní práce zkontrolujeme stav pracoviště, pracovních pomůcek a
přístrojů. Veškeré závady a nedostatky (a to i během vyučování) jsme povinni nahlásit
vyučujícímu.
4) Se zařízením učebny, pomůckami a přístroji zacházíme opatrně a šetrně dle pokynů
vyučujícího.
5) V učebně je zakázáno jíst a pít, zachováváme zde klid a pořádek.
6) Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu, chováme se ukázněně, pracujeme
soustředěně podle návodu a pokynů vyučujícího a používáme potřebné osobní ochranné
pracovní prostředky na ochranu života a zdraví.
9) Každou mimořádnou událost (vysypání či vylití látky, zasažení očí a kůže, požití,
nadýchání, úraz aj.) okamžitě hlásíme vyučujícímu, který zajistí potřebná opatření.
11) Po skončení práce pomůcky omyjeme a uklidíme na stanovené místo, uklidíme
pracoviště, vypneme elektrické přístroje, nepoužité chemikálie vrátíme vyučujícímu k
uložení.
• 1. Základy mikroskopické techniky - světelná mikroskopie.
Seřízení mikroskopu dle Kohlerova principu, práce se suchým a
imerzním objektivem. Pozorování chromozomů Vicia faba, pozorování
živočišních a lidských chromozomů.
• 2. Klasická cytogenetika člověka.
Příprava cytogenetických preparátů z periferní krve, kostní dřeně.
Barvení chromozomů – G pruhování. Identifikace chromozomů.
Karyotyp člověka, snímání a počítačové vytváření karyotypu.
Nomenklatura ISCN 2016.
• 3. Molekulární cytogenetika.
Principy fluorescenční hybridizace in situ (FISH) a její využití
v prenatální, postnatální a nádorové cytogenetice. Základy využití
počítačové analýzy obrazu v molekulární cytogenetice.
• 4. Pokročilé metody molekulární cytogenetiky.
Technika array-CGH.
Cvičení z cytogenetiky - osnova
Cvičení 1
Základy mikroskopické techniky světelná
mikroskopie.
1. Seřízení mikroskopu dle
Köhlerova principu
2. Pozorování chromozomů Vicia
faba, práce se suchým a imerzním
objektivem
3. Pozorování živočišných
chromozomů
4. Pozorování a počítání lidských
chromozomů v procházejícím světle
Úkol 1: Mikroskop CX31- Olympus
Seřízení mikroskopu dle Köhlerova
principu
okulár
objektiv
stolek
kondenzor
stativ
makrometrický
šroub
mikrometrický
šroub
Popis světelného mikroskopu
tubus
světelný zdroj
Transport mikroskopu
Při jakémkoli přemisťování je nutné mikroskop držet oběma rukama na dvou
určených místech (1, 2). Jakýkoli jiný způsob přemisťování či posunování po
pracovní desce stolu může vést k vážnému poškození mikroskopu!
http://www.sci.muni.cz/~anatomy/mikroskop/olympus_cx31.htm
Uvedení mikroskopu do provozu
Před zapnutím mikroskopu kolébkovým spínačem (1)
se přesvědčte, že napětí přiváděné ke světelnému
zdroji je staženo na minimum, tedy že otočný
potenciometr (2) je nastaven na hodnotu 1.
Teprve po zapnutí spínače je možné zvyšovat napětí
(otáčení potenciometru ve směru šipky) a tedy intenzitu
emitovaného světla. Otočný potenciometr používejte i v
průběhu mikroskopování k úpravě světelné intenzity,
např. vždy při změně objektivu.
Mikroskopické preparáty
 Trvalé – s krycím sklíčkem (Vicia faba)
čištění vatou s xylenem
 Trvalé – bez krycího sklíčka (lidské
chromozomy)
čištění v kyvetě s xylenem !
Seřízení mikroskopu
Kohlerův
princip
• pro optimalizaci osvětlení v mikroskopu
• optimální využití optického potenciálu
mikroskopu, numerické apertury objektivu a
tím i jeho rozlišení
• výsledkem Köhlerova nastavení by mělo být
rovnoměrné a maximální osvětlení
průhledného preparátu, ležícího v
předmětové rovině. Současně by měla být
dosažena nejlepší kombinace mezi
rozlišovací schopností a kontrastem.
Seřízení osvětlení mikroskopu podle
Köhlerova principu
August Köhler (1866 -1948)
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
 Musíme mít preparát – trvalé preparáty Vicia faba
(dobře kontrastní – barveno Feulgenem)
Na pracovní stolek mikroskopu
vložte připravený preparát tak,
že pomocí páčky (1) odkloníte
držák preparátu (3). Zaostřete
na preparát pomocí ostřícího
šroubu (2).
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova
principu
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova principu
(polní clona, výška kondenzoru, aperturní clona)
Polní clona
 Nastavte objektiv 10x (případně očistěte objektiv od
imerze) a zaostřete buňky preparátu.
 Zavřete polní clonku tak, až uvidíte její obrys v
zorném poli. Obraz polní clonky (světlý kotouček) v této
fázi nemusí být ve středu zorného pole a nemusí mít
zaostřené okraje.
 Zaostřete obraz polní clonky tím, že snižujete nebo
zvyšujete polohu kondenzoru – ostré okraje clony !
 Vycentrujte obraz polní clonky tak, aby byl přesně
ve středu zorného pole použitím centrovacích šroubů
na obvodu kondenzoru.
 Otevřete clonu; při správném vycentrování se
okraje budou krýt s okrajem zorného pole.
- zaostřený preparát s
přivřenou polní clonou...
- polní clona po
zaostření... - .. a vycentrování
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Správně – v této poloze
nechat kondenzor !
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova
principu
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Aperturní clonka - umístěná na kondenzoru.
Její otevřenost nastavte pomocí páčky maximálně
na hodnotu NA objektivu, který právě používáte.
Nejlepších výsledků bývá dosaženo při nastavení
aperturní clony na 70 až 80 % NA objektivu.
S postupným uzavíráním aperturní clony se zvyšuje
hloubka ostrosti a zvyšuje kontrast, postupně však
vystupují i různé nečistoty nebo nežádoucí vrstvy
buněk.
A co když na kondenzoru není stupnice?
Vyjměte okulár a přivřete aperturní clonu, až ji uvidíte na zadní
straně čočky objektivu. Otevřete aperturní clonu tak, aby
odpovídala 70 – 80% plochy maximálního zorného pole.
Se stupnicí nebo bez stupnice
Kondenzor se stupnicí – nastavení dle
NA objektivu
Máme seřízený mikroskop!
…ale pouze pro danou kombinaci objektivu
a okuláru !
 každý objektiv má jinou hodnotu NA !
Teď už se bude měnit jenom aperturní clonka
kondenzoru – při každé výměně objektivu ji
musíme nastavit na 70 – 80% hodnoty NA
daného objektivu !
Př. zvolte objektiv 40x a znovu seřiďte clonu kondenzoru
Úkol 2:
Pozorování chromozomů Vicia faba, práce se
suchým a imerzním objektivem
Objektiv – suchý a imerzní
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
• preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu
• kondenzor snížíme dle použitého objektivu (čím je
zvětšení menší, tím je kondenzor níže), aperturní clonu
kondenzoru otevřeme (na 80 % velikosti numerické apert.
objektivu)
• makrošroubem snižujeme tubus a v okuláru
sledujeme, kdy se objeví záblesk obrazu a doostříme
mikrošroubem
Postup při práci se suchým objektivem
Pozorování chromozomů V. faba
suchým objektivem
 Sklo položte (buňkami nahoru!) na stolek
mikroskopu a prohlížejte objektivem o
malém zvětšení (4x–10x).
 Najděte a pozorujte jednotlivé fáze
mitózy v preparátech Vicia faba.
 Po zaostření na vhodnou mitózu použijte
objektiv s vyšším zvětšením (nejlépe 40x-
45x) – pozor při zaostřování (nebezpečí
poškození preparátu a znehodnocení
objektivu!)
 Spočítejte 1000 buněk a určete
mitotický index.
MI = počet buněk v
mitóze/celkový
počet buněk
Pozorování chromozomů V. faba
suchým objektivem - mitóza
• preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu
• upravíme hodnotu aperturní clony otevřeme
• na preparát kápneme imerzní olej (pokud pracujeme s dvojitou
imerzí, kápneme olej také na čočku kondenzoru – ještě než ho
zvedneme nahoru)
• makrošroubem snižujeme tubus a pozorováním ze strany
sledujeme, kdy se čočka objektivu spojí s olejovou kapkou
(záblesk na hraně podložního skla), dále objektiv nesnižujeme
díváme se do okulárů a jemným otáčením makrošroubu
zvedáme tubus, jakmile se objeví preparát, doostříme
mikrošroubem
• po skončení pozorování zvedneme tubus, preparát odsuneme a
pokud nepokračujeme v práci s imerzí, ihned řádně očistíme
objektiv (i kondenzor, pokud pracujeme s dvojitou imerzí).
Postup při práci s imerzním objektivem
Imerzní olej
Nemíchat imerzní
oleje od různých
výrobců !!!
Čištění objektivů od im. oleje – směs
alkohol - éter 7 : 3
Imerzní olej i pod kondenzor !!!
• nedostatečně osvětlené zorné pole – špatně seřízené
světlo, snížený kondenzor, zúžená clona
• přesvětlené zorné pole – zvýšený kondenzor, příliš
otevřená clona a intenzivní světlo
• objektiv není přetočen přesně do optické osy
• čočky objektivu nebo okuláru jsou znečištěny
• preparát není zcela suchý – i malé zbytky vody vytvářejí s
imerzním olejem neprůhlednou emulzi
• preparát s krycím sklem je položen obráceně
Nejčastější závady
 Po zaostření na vhodnou mitózu použijte objektiv se
zvětšením 100x – pozor při zaostřování (nebezpečí
poškození preparátu a znehodnocení objektivu!)
 Kolik chromozomů má bob?
Pozorování chromozomů V. faba
imerzním objektivem
Správná odpověď je:
12 (nebo 6 párů)
Úkol 3:
Pozorování a počítání živočišných
chromozomů
Pozorujte pod mikroskopem chromozomy býka, žirafy,
nosorožce, sitatungy, kudu velkého, hyeny, orangutana a
pokuste se přiřadit jednotlivé preparáty danému živočišnému
druhu.
Tur domácí
(Bos taurus)
2n = 60
(akrocentrické
chromozomy)
Žirafa síťovaná
(Giraffa camelopardalis
reticulata)
2n = 30
Sitatunga
(Lesoň bahenní)
(Tragelaphus spekeii)
2n = 30
Kudu velký
(Tragelaphus
strepsiceros)
2n = 32 ♀, 31♂ (t(13;Y))
Hyena skvrnitá
(Crocuta crocuta)
2n = 40
Nosorožec bílý
(tuponosý)
(Ceratotherium simum)
2n = 82
Nosorožec černý
(Diceros bicornis)
2n = 84
Orangutan
(Pongo pygmaeus)
2n = 48
Pes domácí
(Canis lupus f. familiaris)
2n=78
Antilopa skákavá
(Antidorcas marsupialis)
2n=56
Voduška abok
(Kobus megaceros)
2n=52
Pakůň běloocasý
(Connochaetes gnou)
2n=58
Postup
 A) vyhledání dobře rozložených mitóz
(objektiv 10x) - suchý
 B) pozorování a počítání chromozomů
(objektiv 100x) - imerzní
 objektiv vyhledávací a hodnotící
Tur domácí
(Bos taurus)
2n = 60 (akrocentrické chromozomy)
VÚVL, Brno
Sitatunga (Lesoň bahenní)
(Tragelaphus spekeii)
2n = 30
VÚVL, Brno
Hyena skvrnitá
(Crocuta crocuta)
2n = 40
Karyotypes of spotted hyenas from Hsu & Benirschke, 1968.http://placentation.ucsd.edu/spottedhyenafs.htm
Žirafa síťovaná
(Giraffa camelopardalis reticulata)
2n = 30
VÚVL, Brno
Kudu velký
(Tragelaphus strepsiceros)
2n = 32 ♀, 31♂ (t(13;Y))
VÚVL, Brno
Orangutan
(Pongo pygmaeus)
Orangutan bornejský (P.p.pygmaeus)
Orangutan sumaterský (P.p.abelii)
2n = 48
http://www.carolguze.com/text/442-4-chromosome_analysis.shtml
Nosorožec černý
(Diceros bicornis)
2n = 84
Nosorožec bílý (tuponosý)
(Ceratotherium simum)
2n = 82
http://www.jstor.org/pss/2458963
White Rhinoceros original range [orange: Northern (C. s.
cottoni), green: Southern (C. s. simum)].
http://en.wikipedia.org/wiki/White_Rhinoceros
Black Rhinoceros range
Cytogenetika živočichů
• Prase 2n = 40 (38)
• Pes 2n = 78
• Žirafa 2n = 30
• Zebu bílý 2n = 60
• Nosorožec bílý 2n = 82
• Nosorožec černý 2n = 84
• Sitatunga 2n = 30
• Jelen 2n = 68
• Pakůň 2n = 58
• Býk 2n = 60
• Hyena 2n = 40
• Kudu 2n = 32
• Ovce tlustorohá 2n = 54
• Orangutan 2n = 48
• Antilopa skákavá 2n = 56
• Velbloud 2n = 70
• Voduška 2n = 52
Úkol 4:
Pozorování lidských chromozomů
v procházejícím světle
Typy barvení lidských chromozomů
 Klasické barvení
 G-pruhování
 R-pruhování
 C-pruhování
 Preparáty byly získány z dělících se lymfocytů
lidské periferní krve.
 Krev jsme po odběru kultivovali v médiu, kde byly
buňky přinuceny k mitotickému dělení.
 Vzniklou suspenzi jsme fixovali, nakapali na skla a
napruhovali pomocí G-pruhů (bližší postup v dalším
cvičení)
Pozorování a počítání lidských
chromozomů pod mikroskopem
Preparáty jsou bez krycího sklíčka – nestírat
imerzi !!!
 Sklo položte (buňkami nahoru!) na stolek
mikroskopu a prohlížejte objektivem o malém
zvětšení (10x).
 Po vyhledání vhodné mitózy použijte objektiv
s vyšším zvětšením (nejlépe 100x) a pozorujte
chromozomy barvené G-pruhováním.
 Vhodnou mitózu zakreslete a zkuste spočítat
chromozomy.
Pozorování lidských chromozomů pod
mikroskopem
Karyotyp člověka
9
9
8
20
velké metacentry
malé metacentry
velké akrocentry
malé akrocentry
zbytek -
submetacentry
Patologické nálezy
 47,XXY 46,XY,t(6;7)
 ring 21 47,+mar
 45,X 47,XXX
 46,XX
 45,X[9]/47,XXX[1]
 45,XY,der(13;14)
 47,+21
 46,XX,t(4;5)