Výuka IBA
Analýza genomických
a proteomických dat
Mgr. Eva Budinská, Ph.D.
RNDr. Ivana Ihnatová, Ph.D.
Jaro 2018
Osnova přednášek
I. Současné výzvy a technologie genomiky a proteomiky (přednáška 01)
II. Princip a analýza obrazu DNA mikročipů (přednáška 02)
III. Úprava a normalizace dat cDNA mikročipů (přednáška 03)
IV. Úprava a normalizace dat oligonukleotidových mikročipů (přednáška 04)
V. Společné principy analýzy genomických a proteomických dat (přednáška 05)
VI. Porovnávání tříd (přednáška 06)
VII. Predikce tříd (přednáška 07)
VIII. Objevování tříd (přednáška 08)
IX. Analýza přežití a další regrese (přednáška 09)
X. Analýza genových sad a genových sítí (přednáška 10)
XI. Analýza dat hmotnostní spektrometrie (proteomika) (přednáška 11)
XII. Analýza arrayCGH mikročipů (přednáška 12)
XIII. Meta-analýza (přednáška 13)
Požadavky
- Individuální projekt (20 bodů - 50% z celkového
hodnocení zkoušky, 83% hodnocení zápočtu)
- Písemná zkouška (16 bodů) – 40% z celkového
hodnocení zkoušky, 10% hodnocení zápočtu
- Aktivita na přednáškách včetně prezentace projektu
(4 body) – 10% z celkového hodnocení zkoušky,
- Úspěšné absolvování:
• Ukončení zkouškou: 21 bodů, z toho min 10 z
projektu a min 8 ze zkoušky
• Ukončení zápočtem: 14 bodů
Výuka IBA
Požadavky
Výuka IBA
Projekt Aktivita,
účast a
prezentace
projektu
Zkouška Min počet
bodů
Zkouška 20b
(50%)
4b
(10%)
16b
(40%)
21 b, z toho
min 10 za
projekt a
min 8 za
zkoušku
Zápočet 20b
(87%)
4b
(13%)
- 14 b
Projekt
- Zpracovává se samostatně
- Možnost zpracovávat vlastní data nebo data z veřejné
dostupných databází
- Každý provádí výběr vlastní témy, kterou musíme
nejdříve schválit
- Projekt nutno odevzdat před zkouškou, pouze po
odevzdání a obdržení 10 bodů z projektu je možné přihlásit
sa na zkušební termín
- Nejzazší termín odevzdání projektů:
• pro udělení zápočtu: 25.6.2018
• pro kontrolu počtu bodů: 7 dní před zkušebním
termínem
- 1x možnost opravy projektu
Výuka IBA
Kapitola I.
Současné výzvy genomiky a
proteomiky
Výuka IBA
Význam studia genomiky a proteomiky
 V biologii jsme se znalostmi dostali na nejmenší jednotky, které
mají komplexní biologický význam
 GENY a PROTEINY, dále jsou už jen nukleotidy a aminokyseliny
a ještě níž jsou jen menší molekuly a atomy a … subatomární
částice.
 Studujeme složení molekul a hlavně jejich funkcí v organismu
Genomika je věda zabývající se studiem souboru genů v buňce
(genom)
Proteomika je věda zabývající se studiem souboru proteinů v
buňce (proteom)
Geny
 Geny podmiňují fyzický vzhled organismu a jeho
schopnost adaptace na prostředí, ve kterém žije a
jeho pomalé i náhlé změny (stres).
Adaptace na prostředí
 Odolnost bakterií na antibiotika podmíněná
mutacemi.
 Adaptace na extrémní podmínky - život ve vesmíru,
v sopce, sirných pramenech, vařících pramenech a
mrazech do -70
Rozdíly mezi organismy jsou podmíněné rozdíly v
genomu (kompletní sada genů obsažená v každé
buňce organismu).
Geny II.
Jak je možné, že se navzájem liší i buňky v rámci
jednoho organismu, když mají stejnou sadu genů?
Tyto rozdíly jsou důsledkem odlišné aktivity genů a
jejich produktů, proteinů a funkčních RNA molekul.
Genomika a proteomika v BIOLOGII
Dekódování genomu u různých druhů

Můžeme studovat

Rozdíly v genomu/proteomu
jednotlivých druhů

studovat tak evoluční
propojení a vytvářet
fylogenetické stromy
DNADNA
mRNAmRNA
ProteinProtein

aktivitu genů a proteinů
organizmů v rozdílných
podmínkách

Můžeme pochopit správně
parazity, abychom odhalili
mechanismy jejich přizpůsobení
se hostiteli, případně studovat
bakterie a jejich mechanismy
přizpůsobení se extrémním
podmínkám …
Genomika a proteomika v MEDICÍNĚ
Studium genetické podstaty dědičných i získaných
onemocnění

Můžeme studovat
Genetické mutace, a jiné
genetické/genomické aberace
způsobující choroby
DNADNA
mRNAmRNA
ProteinProtein

Rozdílnou aktivitu genů a
proteinů u konkrétních chorob
v porovnání se zdravým
organismem
Jsme schopní
korelovat funkci produktů
jednotlivých genů s
onemocněním
NEMOC  GEN (Y)

Pochopit podstatu onemocnění

Najít nejvhodnější způsob léčby
(cílená léčba),
prevence a diagnostiky
Geny a onemocnění I. - příčiny
 Downův syndrom, hemofilie, cystická fibróza, svalová
dystrofie, rakovina...
 Dědičné i získané, u některých stačí jediná mutace v
patřičném genu a vzniká choroba, u jiných je zapotřebí více
genetických změn
1. Změny ve struktuře DNA:
 Mutace ve struktuře jednoho genu (jednonukleotidové
polymorfizmy, delece, inzerce, amplifikace nukleotidů)
 Aberace celého genu a nebo části chromozomu (delece,
translokace, inzerce, amplifikace)
 Aberace celých chromozomů
2. Změny v expresi a aktivitě genů a jejich produktů
3. Změny v posttranslačních úpravách proteinů
Genomika a proteomika v MEDICÍNĚ
Geny a onemocnění II. - mutace
 Buňky v organismu se stále obnovují a dělí - při každém dělení
replikují celý genom na nukleotid přesně. Tento proces není při
velikosti lidského genu (3.2 bilionu nukleotidů) jednoduché.
 Proto existuje mnoho kontrolních mechanismů:
 na opravu poškozené časti DNA
 pro správnou distribuci chromozomů v procese
mitózy/meiózy
 pro případnou apoptózu (regulovanou smrt buňky) v případě
nezvratných změn
 apod.…
 Genetické aberace vznikají selháním kontrolních mechanismů
Genomika a proteomika v MEDICÍNĚ
Geny a onemocnění III. – aktivita genů
 Nejen mutace, ale i nesprávná aktivita genů může vést ke
vzniku onemocnění.
 V lidské buňce probíhá každou chvíli obrovské množství
procesů, přepisují se stovky genů a neustále se vytvářejí
proteiny na základě vnitřních a venkovních podnětů.
 Tyto podněty jsou regulované stovkami regulačních
mechanismů, které jsou opět založené na proteinech.
 Chyba v jednom z mechanismů může také skončit vyvinutím
onemocnění.
Genomika a proteomika v MEDICÍNĚ
Geny a onemocnění IV. - shrnutí
 Co způsobuje onemocnění – proteiny a jiné funkční
molekuly, které mají změněnou svojí funkčnost, nebo expresi.
 Příčiny nesprávné funkce:
 Mutace v příslušném genu, způsobující v důsledku změnu v
sekvenci aminokyselin proteinu a tím jeho:
 nefunkčnost
 nadměrnou aktivitu
 Změny v mechanismech kontroly exprese daného proteinu,
který je následně produkovaný
 v nedostačujícím množství
 v nadměrném množství
 Změny v postranslačních úpravách a sekundární/terciární
struktuře proteinu
Genomika a proteomika v MEDICÍNĚ
Ústřední dogma molekulární biologie
DNA -> mRNA -> protein
Přepis Překlad
Přepis Překlad
BUŇKA
Co ještě víme
DNADNA
mRNAmRNA
ProteinProtein
Přepis
Překlad
Transkripční faktor
Aktivační protein Inhibujíci protein
Signály mimo buňkyMIMO
BUŇKY
MEMBRÁNA
Ale víme ještě víc
..a ještě víc...
...a ještě víc...
...ale je velmi obtížné to vše propojit a interpretovat
http://219.221.200.61/ywwy/zbsw(E)/pic/ech6-36.jpg
Co zkoumáme v genomice a proteomice
 U genů můžeme zkoumat jejich
 Strukturu a její změny – sekvence nukleotidů A, C, G, T
 Množství – zda jsou a nebo nejsou přítomné a v jakém
počtu kopií
 Aktivitu – zda se gen přepisuje do mRNA a v jakém
množství
 U proteinů zkoumáme
 Složení – z jakých aminokyselin
 Strukturu – jak jsou řetězce peptidů uspořádané do 3D
struktur
 Množství – zda jsou a nebo nejsou přítomné a v jakém
množství
 Funkci – modelování, identifikace aktivních vazebných míst
 Další fáze je modelování komplexních buněčných systémů –
proteinové interakce, buněčné dráhy, regulační a metabolické
sítě …
Metody studia genomu a proteomu
 Klasické metody molekulární biologie a cytogenetiky:
 Metody zkoumající jen jeden nebo několik genů a proteinů v
jednom experimentu:
 PCR, RT-PCR, real-time PCR
 FISH (fluorescence in-situ hybridization)
 gelová elektroforéza, ...
 Vysokopokryvné metody molekulární biologie:
 schopné zkoumat tisíce molekul v jednom experimentu....
... jak vznikly?
Od Watsona & Cricka po Leroya Hooda
 Na začátku byl dvoušroubovicový model DNA...
a na konci byly:
 automatické sekvenátory DNA a proteinů
 automatické syntetizátory DNA a proteinů
Nové možnosti
Sekvenátory umožnily rychle dekódovat
sekvenci genů a proteinů
Znalost přesné sekvence umožnila navrhovat specifické
genové sondy a syntetizátor umožňoval jejich rychlou a
automatickou výrobu.
Otevřely se dveře pro nové, vysokopokryvné
technologie, schopné analyzovat tisíce genů/proteinů v
jednom experimentu!
Vysokopokryvné metódy I.
 Analýza genómu (od nukleotidových sekvencií po úplne
anotovaný genóm) a transkriptómu
 Analýza štruktúry
 Analýza expresie
 Porovnávacia genomika
 Regulácia genómu
 Analýza proteómu (od hmostnostních spektier – cez
komplexné štruktúry proteinových zhlukov - po analýzu
funkcie proteínov)
 Analýza štruktúry
 Analýza expresie
 Analýza funkcie
 Modelovanie komplexných systémov – proteínové interakcie,
bunkové dráhy, regulačné a metabolické siete...
Analýza genómu
 Od nukleotidových sekvencií po úplne anotovaný genóm
 Analýza štruktúry
– DNA sekvenácia, Chip-seq, WES (whole exome
sequencing), WGS
– Porovnávacia genomika – aCGH čipy, SNP polymorfizmy,
alternative splicing arrays, fingerprinting
 Analýza aktivity (expresie) – Mikročipy, SAGE, MPSS,
Expressed sequence tags (ESTs), RNA-seq, …
 Regulácia genómu
– Chip-on-chip
– Epigenetika (mikročipy, metylácia...)
Analýza proteómu
 Od hmostnostních spektier – cez komplexné štruktúry
proteinových zhlukov - po analýzu funkcie proteínov
• Analýza štruktúry: Proteínová sekvenácia
• Analýza expresie: Hmotnostná spektrometria,
Proteínové mikročipy...
• Analýza funkcie: Modelovanie makromolekulárnych
systémov – odvodzovanie vlastností z atómových
interakcií
Dáta vysokopokryvných metód I.
 Moderné vysokopokryvné technológie produkujú obrovské
tabuľky komplexných dát
Mikročipy
 Expresia 10 000 – 100 000 transkriptov u 100 – 1000 vzorie
MASS – hmotnostná spektrometria
 Tisíce spektier proteínov – GB datové súbor
Sekvenácia DNA
 Genóm s biliónmi nukleotidov
Dáta vysokopokryvných metód II.
Dátový súbor z vysokopokryvných
experimentov
– pohľad biológa
"In principle, the string of genetic bits holds long-sought secrets of human development,
physiology and medicine. In practice, our ability to transform such information into
understanding remains woefully inadequate".
The Genome International Sequencing Consortium, ”Initial sequencing and analysis of
the human genome,” Nature 409: 860-921 (2001)
Hľadanie ihiel v kopách sena?
Dátový súbor z vysokopokryvných experimentov– pohľad
matematického biológa
1. Príprava a vykonanie experimentu
v laboratóriu
2. Extrakcia a úprava dát
3. Štatistická analýza dát4. Biologická a klinická interpretácia
Dôležité!
• Veľká časť rozmanitosti života vrátane ochorení sa zrejme dá
obsiahnúť štúdiom funkcie genómu a proteómu a ich vzťahu
• Biológia a medicína sa v súčasnosti nezaobíde bez štúdia
genetiky a proteomiky
• V súčasnosti existujú špeciálne vysokopokryvné metódy, ktoré
umožňujú skúmať tisíce génov a proteínov v jednej vzorke a
jednom experimente
• Biológovia a lekári produkujú v súčasnosti obrovské množstvá
genomických a proteomických dát, ktoré vyžadujú špeciálne
metódy analýzy
• Biológovia a lekári sú špecialisti vo svojom obore ale táto práca
im zaberá všetok čas. Obvykle nemajú čas študovať štatistiku a
analyzovať svoje dáta
• Databázy sú plné genomických a proteomických dátových
súborov, ale je relatívne málo odborníkov, čo ich analyzujú
Vysokopokryvné metódy – čo si priblížime
Podrobnejšie si predstavíme technológie:
 Mikročipy:
 Expresné: cDNA, Affymetrix, Illumina
 aCGH čipy
 Hmotnostná spektrometria
 Analýza NGS dát – v samostatnom predmete Bi5444
Vysokopokryvné metódy – čo si priblížime
Podrobnejšie si predstavíme technológie:
 Micročipy:
 Expresné: cDNA a Affymetrix
 aCGH čipy
 Hmotnostná spektrometria
Shrnutí první časti
Velká část rozmanitosti života včetně onemocnění
se dá zřejmě obsáhnout studiem funkce genomu a
proteomu
V současnosti existují speciální vysokopokryvné
metody (high-density methods), které umožňují
zkoumat tisíce genů a proteinů v jednom vzorku a
jednom experimentu
Tyto metody produkují obrovské množství dat a
vyžadují specializovanou statistickou analýzu