INVAZI VITA A METASTÁZOVÁNÍ Karel Souček E-mail: ksoucek@ibp.cz, tel.: 541 517 166 Otázky na 20.3. 0 Proč je autokrinní signalizace destabilizující faktor pro normální tkáně? 0 Jaké mechanismy mohou buňky uplatňovat pro snížení citlivosti k působení růstových faktorů? o Jakou roli hrají integriny v procesu buněčné motility? o Jaké molekulární mechanismy mohou vést ke konverzi protoonkogenu na onkogen? Typické znaky nádorové buňky C> podpůrné proliferační signály o deregulace supresorů růstu/proliferace o odolnost k buněčné smrti o neomezená replikace » neoangiogeneze í> invaze a metastázování 0 mutace a genomická nestabilita o zánět > přestavba energetického metabolismu > únik před zničením imunitním systémem Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg: Hallmarks of Cancer: Next Generation, Cell, 2011 Whole-body scan of a patient with metastatic non-Hodgkin's lymphoma (NHL). This is a fusion image of a CT (computed X-ray tomography) scan of the body's tissues (gray, blue) and a PET (positron-emission tomography) scan in which the uptake of radioactively labeled fluorodeoxyglucose (FDG) in various tissues (yellow) has been detected. FDG uptake indicates regions of high glucose uptake associated with aerobic glycolysis. The activity associated with the brain is normal. However, the yellow spots in the abdominal regions indicate multiple NHL metastases. igure 14.1 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Transforming growth factor - ß (TGF- ß) Epstein, F.H., N Engl J Med 2000; 342:1350-1358, 2000 Biologické funkce TGF-p * Hraje klíčovou úlohu během embryogenéze; * reguluje proliferaci, diferenciaci, buněčnou smrt, motilitu, adhezi (v závislosti na buněčném typu) = ovlivňuje homeostázu; C> reguluje expresi extracelulární matrix; - indukuje fibrilární kolagen a fibronectin; - inhibuje degradaci ECM (inhibicí MMPs a indukci TIMPs). Role TGF-p v rozvoji patologických stavů 0 Fibróza - deregulace exprese ECM prostřednictvím indukce proliferace fibroblastů a jejich myofibroblastového fenotypu. * Nádorová onemocnění - ztráta citlivosti epiteliálních buněk k inhibičnímu působeni TGF-P; - indukce angiogeneze. TGF-0 signaling component TGF-0 9 Endoglin : Type II receptors 1 Type 1 receptors 1 Smad2 Smad4 Cancers (somatic mutations) Increased expression leads to enhanced invasion and metastasis Colorectal (30%) Gastric (15%) Endometrial Prostate Breast Lung Hepatic Pancreatic Cervical Glioma Head and neck Breast (16%) Pancreatic Biliary Cervical Chronic lymphocytic leukemia Colorectal (11%) Lung (7%) Hepatocellular Pancreatic (50%) Colorectal (30%) Lung (10%) Breast Prostate Ovarian Head and neck Esophageal Gastric Bladder Hepatocellular Renal cell Other diseases (germ-line mutations or polymorphisms) Fibrosis Hypertension Osteoporosis Atherosclerosis Hereditary hemorrhagic telangiectasia Atherosclerosis Familial juvenile polyposis NEJM 342,18 (2000) 1350-1358 S MAD 3 Smad, mothers against dpp homolog 3 (drosophila) TGFBR2 Transforming growth factor, beta receptor ii (70/80>da) -1.5 Sub Class Class Box Plot - Description Prostate - normal vs. cancer -2.0 Sub Class Class Box Plot - Description normal, hyperplasia vs. cancer t \\. I li ľ "a 'I II IV. i \ľv: ONCOMINE™ Role TGF-p v carcinogenezi Normal cells a iaa a \ a »1* a.a a no Epithelium Cell enlarges and makes 1 new proteins G1 Arrest of growth Inhibition of proliferation NEJM 342, 18 (2000) 1350-1358 Role TGF-ß v carcinogenezi Rapid growth Loss of TGF-ß signaling, e.g.TßRIl mutation Normal cell TGF-ß 1 Benign lesion Perturbation of TGF-ß signaling, e.g. altered Smad2 Clonal expansion Carcinoma *~ Metastasis Increased Increased mutation rate mutation rate T Migration/invasion í Slowly expanding tumor Reversible EMT Carcinoma Metastasis TRENDS in Cell Biology TRENDS in Cell Biology Vol. 11 No. 11 2001 Figure 14.3 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) primary tumor localized intravasation transport arrest in extravasation formation invasion through micro vessels of circulation various organs J colonization -formation of a macrometastasis Figure 14.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Lokální invaze a intravazace o Invaze do cév, závislá na degradaci ECM 0 Závislá na proteázové aktivitě o Nádorové buňky mohou produkovat své vlastní proteázy (MMP-2, -9) nebo kooptují stromální buňky a využívají jejich aktivity Fiqyie 14.6a The Biology crfCsoter (© Garland Menct ion] Tumor cells, fibroblasts Macrophages, cathepsin •at- _. CD34+ Immature myeloid cells Pohyb buněk lagging edge actin cortex lamellipodium leading edge substrate cortex under tension myosin contraction \ actin polymerization at ! plus end protrudes lamellipodium movement of unpolymerized actin focal contacts (contain integrins) extension of new lamellipodium control actin staining I cortical actin + heregulin actin staining I lamellipodium M(w| ■ filopodia (C) Rac ACTIVATION (D) Cdc42 ACTIVATION Figure H.1S T(w tahtgrrftirnrtDtiiJjndíôaKtJDMf Figure 14.36 The Biology of Cancer [© Garland Science 2014) N-WA5P ZBP1 EGF source PLC-y ■ PI(4,5)P2 —DAG cofilin „ + IP3 Tiaml • 2X Rho 3X ROCK —^ + 3X LIMK T \SSH 3X PKC? >y P-cofilin cofilin J cortactin Src 3X PI(4,5)K I -10x 6XArp2/3 PI(4,5)P2 complex J 5X capping protein |-4X MENA 1 barbed ends -«-F-actin severing t I -G-actin lamellipodia cofilin (total) 2X p-actin mRNA targeting -| Chemotaxis toward EGF Figure 14.40 The Biology of Cancer (© Garland Science 2014) Transport, cirkulace heart' liver lungs ■portal system arterial circulation v venous circulation gut spleen kidneys brain skin muscles breast t TTTT i Fgurr 14.« lhrBnlogrofCjK*f|CGuiindki«mi014! tissue capillaries, tumor microvessels oxygenated blood deoxygenated blood Figure 14.8 The Biology of Cancer (©Garland Science 2014) Metastatická kaskáda Cirkulující nádorové buňky (CNB)-klíčová úloha Maligní zvrat Vaskularizace Vzdálený orgán Adheze Transport Extravazace Invaze Neutratí I Erytrocyt a ! a i—5- oXío\ Vhodné mikroprostředí Proliferace Francia et al., Nat. Rev. Cancer (2011) Proč se cirkulujícími nádorovými buňkami zabývat? > 90% úmrtí spojených se solidními nádory -metastáze > Šíření primárně krví \> Klinicky významné > „Liquid biopsy" > Průběh terapie > Prognostický znak > Specifické mutace -> cíle terapie £J> Primární tumor Sekundární metastáza Krevní oběh CNB Schilling, era/., Nat. Rev. Urol. (2012) Vlastnosti cirkulujících nádorových buněk A) Systémy využívající detekce biologických vlastností CNB Systém Druh nádorového onemocněni Princip Možností následné analýzy Výrobce Reference AdnaTcst prostata, prso, tlusté střevo, ovaria, imunomagnetická separace EpCAM+ -i lýza -> izolace RNA RT-PCR Qíagen [URL 11 CelICollector plíce, prso, tlusté střevo, prostata zachycení EpCAM+ bunék in vivo pomocí sondy potažené protilátkami proti EpCAM zaváděné přímo do paže pacienta molekulární charakterizace, kultivace Gilupi [UT4L2] CellSearch metastázující: prostata, prso, tlusté střevo imunomagnetická separace EpCAMn-■> permeabilizace ■> značení na DNA (DAPI), CK, CD45 -> jako CNB jsou vyhodnoceny CD45-, DAPI+, CK+ stanovení prognózy (validováno) Veridex [URL3] CTC chip plíce,jícen, prostata, prso, tlusté střevo, aj. krev protéká přes mikrofluidní čip se sloupečky s EpCAM protilátkami molekulární charakterizace, kultivace (Sequist et al. 2009) HD-CTC metastázující: prostata, prso, pankreas lýza erytrocytů permeabilizace -> značení na CK, CD45, DNA (DAPI) -> vyhodnocení softwarem morfologické znaky a cytopatologické znaky, identifikace shluků CNB (Marrimicci et al. 2012) B) Systémy využívající detekce fyzikálních vlastností CNB Systém Druh nádorového onemocnění Princip Možnosti následné analýzy Výrobce Reference Akustický melanomy, karcinomy Průchod mikrorluidníra kanálem, vystaveni akustickým vlnám různé vlastnosti (velikost, defonn., hustota,...) různé vychýlení molekulární charakterizace, kultivace (Li eífl/,2015) Apostream různé separace na základě dielektrických vlastností molekulární charakterizace, kultivace. Apocell [URL4] Celsee prostata, prso, tlusté střevo mikrofluidní, separace pomocí filtračních komůrek DNA/RNA FISH, Kultivace, DeNovo Sciences [URL5] CellSieve různé filtrace za nízkého tlaku molekulární charakterizace, kultivace, histologie, enzym. aktivita Creatv microtech [URL6] MctaCcII různé filtrace usnadněná kapilárni silou MetaCell [URL7] Cluster chip metastázující: melanomy, prso, prostata mikrofluidní, pomalý průtok přes systém sloupců molekulární charakterizace, izolace shluků CNB (Sarioglu et al. 2015) OncoQuick karcinomy, melanomy gradientova centri fugace molekulární charakterizace, kultivace G re i ne r BioOne [URL8] Spiralni mikrofluidní různé (>12 tím) hydrodynamické oddělení na základě velikosti molekulární charakterizace, kultivace, izolace shluků CNB (Khoo et flí.2015) Vojtěch Dvořák, BP, MU, 2016 Detekce nádorových cirkulujících buněk Table 1 Circulating tumor cell (CTC) isolation technologies. Relevant performance characteristics of the discussed CTC isolation technologies. Capture efficiency refers to the percentage of cells isolated in cell spike experiments with cancer cell lines in whole blood. Purity refers to the captured number of target cells as opposed to captured non-target cells as expressed either as a percentage or log depletion. Blank spaces indicate that this metric was not provided by the reference Technology Year Capture efficiency Purity Throughput Clinical verification References CellSearch 2004 85.50% Low Breast, bladder, colorectal, [3] gastric, lung, ovarian, pancreatic, prostate, renal CTC Chip 2007 >60% 50% 1 mL/h Breast, colon, lung, [8,11,43"] pancreatic, prostate GEDI 2009 78-85% 68% 1 mL/h Breast, gastric, pancreatic, [12,13,38] prostate HTMSU 2008 94.50% 1.6 mL/h Pancreatic (PDX mouse) [14,39] HT-CTC Chip 2014 86% 1.38 mL/h Prostate [15] NanoVelcro 2011 95% 0.5 mL/h Lung [161 Hb Chip 2010 92% 14% 1.2 mL/h Prostate [17,41] LbL Hb Chip 2015 96% High Breast, lung [18] Oncobean 2014 82.7-100% Higher with increased Up to 10ml_/h Breast, lung, pancreatic [19] flow rates GO Chip 2013 94.20% High 1 mL/h Breast, lung, pancreatic [20") CTC-iChip 2013 77.8-98.6% 2.5-3.5 log depletion 8 mL/h Breast, colorectal, lung, [21",42",44*T pancreatic, prostate VerlFAST 2014 90% Lung [22] SB microfilter 2014 78-83% 1.7-2 x 103 Around 5 mL/h Tested in mouse model [26] FMSA device 2014 92.6% 1.4 x 104 Around 45 mL/h Breast, colorectal, and [27*,40] lung Vortex technology 2014 10-20% 57-95% for clinical Lung, breast [29] samples Multiplex spiral 2013 >85% 10% 3 mL/h Lung [34J device ApoStream (DEP) 2011 70% Reduction of WBCs 1 mL/h Prostate, breast, lung, [35] 99.33% ± 0.56% hepatocellular, bladder (2-3 log depletion) taSSAW 2013 >83% Around 90% removal 1.2 mL/h Lung [36,371 rate of WBCs (1 log depletion) Current Opinion in Chemical Engineering 2016, 11:59 66 Příklad: Filtrace >CNB: epiteliální původ -> větší velikost >Platformy: MetaCell, CellSieve, Celsee,... Buňky Průměr \nm\ Erytrocyty 6-8 Granulocyty 12-15 Monocyty 15-25 Lymfocyty 7-10,14-20 CNB 17-52 > Výhody - nezávislost na povrchových znacích > Heterogenní populace > Není nutná aktivace receptoru > Nativní stav > Nevýhody > Možný překryv s leukocyty > Nutné využít dalších znaků (CD45) > Různá velikost CNB? > polycarbonate membrane with 8 jim pores (CTCs over 20 jim > capilary force-driven filtration Experimental design supported by the shape of The " bottom" cell the rin9 population Growing media (without any concentration gradient) _ « * * * IHC slide Příklad: mikrofluidní separace HTMSU M Thermoplastics Ě GEDI Chip HT CTC Chip Hb Chip Micromixers CTC Chip LbL OncoBean Chip Immunocapture Verl FAST CTC-iChip CTC «f POST Silicon microposts * iVfilf Uood tri jm-í' -|. ^ .: ■,|l:l,:t.1:.ll' ii.Tidi:.';.1 Immunomagnetic separation Nanomaterials Current Opinion in Chemical Engineering Příklad: mikrofluidní separace Microti Iter Size Based Separation Inertial Effects Captured tumor cells Red blood cells • 1 Leukocytes parylene-C membrane nwov - OOov~'o,->.ov-'o/~.o OOO I ) DOC { ) 0 040 ( J OOO C } OOO o«{ ) OOO f ) OOO f)0 Doo f 1 ooo( ) ooq OOO { J OOO ( ) D 0^.0^0,^,0^0 O [ J OOO f J OOO ( } OOO O^O^O^O^O^—'o/-\0 OOO ( ) OOO f ) OOO í ) o • f J OOO f J OOO f ) OOO SB microfilter Spiral devices Current Opinion In Chemical Engineering Příklad: mikrofluidní separace Single Fife Alignment Magnetic Separation Running buffer Red blood cell (8x10»/ml) White blood cell (S x 10*/ml) CTC labeled with magnetic beads (1-100/ml) 20 n s -630 |jl/min Buffer Waste 1 Syringe PLT) pump - 600 uťmin Waste 2a (WBC-hi) -60 jil/min Product (CTC) ~54 M^min 20 p.s.i. Blood 120 nfmin CTC-iCtlip Stage 2 Waste 2b (WBC-low) -36 [il/min CTC-iChip running platform I PROTOCOL Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples Nezihi Murat Karabacak1,4, Philipp S Spuhler1'4, Fabio Fachin1, Eugene J Lim1, Vincent Pai1, Emre Ozkumur1, Joseph M Martel1, Nikola Kojic1, Kyle Smith1, Pin-i Chen1, Jennifer Yang1, Henry Hwang1, Bailey Morgan1, Julie Trautwein2, Thomas A Barber1, Shannon L Stott1'2, Shyamala Maheswaran2, Ravi Kapur1, Daniel A Haber2-3 & Mehmet Toner1 'Department of Surgery and Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. 'Cancer Center, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. 'Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, Maryland, USA. 4These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to M.T. (mtoner@hms.harvard.edu). Published online 27 February 2014; doi:10.1038/nprot.2014.a44 SCIENTIFIC REPpRTS open Microfluidic Isolation of Circulating Tumor Cell Clusters by Size and Asymmetry R«tn«£: »Junuv M17 H.Au", JonEdd*, Amy E. Stoddard1, Keith H. K. Wong", Fabic Fächln", Shy a mala Antpml ZI Man* MIT Maheswaran*-', Daniel A. Haber1*', Shannwi L. hHW, Ravi Kapur5 & Mehmet Tonern M PlMiMudi«: 26 M*} 2017 Klinické využití detekce cirkulujících nádorových buněk > Odhad prognózy pacienta > Monitoring průběhu onemocnění > Včasná detekce > Metastázující karcinomy prsu a prostaty - hranice 5 CNB/7,5ml > Metastázující karcinom tlustého střeva - hranice 3 CNB/7,5 ml > CellSearch systém Veridex - schváleno FDA www.cellsearchctc.com Množství cirkulujících nádorových buněk korelují s prognózou (A) CTC at baseline -t-< 5 -t- S 5 (B) al baseline ^ 0 ^ 0 10°" E a. > o c o u S? CL 0.75 CO 0.50 0.25 0.00 Logrank p < 0.0001 Cox HR (95% Cl) = 2.52(1.74-3.67) p < 0.0001 tu c ŕ-« j» CO CC 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Time Since Start of Treatment (months) Number at risk by time <5 Ž5 101 69 88 39 58 23 47 12 34 9 20 4 8 1 8 0 3 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 1.00- 0.75 0.50 .Q 2 S. 5 0.25 O o.oo- Logrank p < 0.0001 Cox HR (95% Cl) = 4.76(2.72-8 32) p < 0.0001 c (J J3 CO 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 Time Since Start of Treatment (months) Number at risk by time <5 > 5 101 96 80 68 54 39 26 19 10 3 1 1 1 1 69 51 40 30 21 15 7 4 4 2 0 0 0 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 Time Since Start of Treatment (months) Time Since Start of Treatment (months) r, Í01J I J ORIGINAL ARTICLE WILEY ■ Circulating tumor cells and survival in abiraterone- and enzalutamide-treated patients with castration-resistant prostate cancer Brsm De UereV; I Steffi Oeyen1 Peter Van Oyen; l Christophe Ghysel2 Jozef Ampe' I Piet Ost3 Wim Demey-1 I Lucien Hoekx5 Dirk Schrijvers1' Barbara Brouwers7 WNtem Lybaert8 I Ets Everaert* I Piet Van Kerckhove7 Daan De Maeseneer* I Michiel Strübos" I Alain BolsT Karen Fransis5 Nick ßeije10 I Inge de Kruijfr"10 I Valerie van Dam1 I Anja Brouwer1 I Pieter-Jan van Dam1 Gert Van den Eynden111 I Annemie Rutten" Stefan Sleijfer311 \ Jean Vandebroek12 Steven Van Laere1 I Luc Dirix112 Molekulární charakterizace CNB -> cílená terapie > Biopsie - identifikace mutací - zacílení terapie > Uvolňovány i z metastáz -> komplexita > Vývoj onemocnění -> chemorezistence, identifikace nových cílů > Využití v budoucnu? Počáteční stav Krevní řečiště ' =1 =] <■! =J =1 =1 =1 =1 =1 4 =! =1 =1 =1 =1 & cg , Progrese po počáteční terapií \ Cílená f \ terapie A / /£ %\ (např. EGFR \ \ inhibitor) / . iny lu(M) \ Cílená terapie B nebo chemoterapie Iniciační klon v převaze Převaha vyselektovaných klonů Progrese po další terapii ^> <3 & „ <3 Větší komplexita? Krebs et al., Nat. Rev. Clin. One, (2014) Cirkulující nádorové buňky - prekurzor metastáz > Množství CNB nekoreluje s množstvím metastáz > Rozsev nádorových buněk může probíhat v časných stádiích (b) > K vytvoření metastáz nutná další stimulace -m i kro prostředí, mutageneze > Relaps: metastáze původem z rozesetých buněk (a) > „Tumor self-seeding" > Oblast intenzivního výzkumu Primary tumour XX XX XaaX OOOOOOOO 0000 0000 Liver Lung metastasis metastasis Primary tumour Naxerova et al., Nat. Rev. Clin. One. (2014) Plasticita cirkulujících nádorových buněk > Tvorbu metastáz ovlivňuje řada faktorů - mj. plasticita CNB > Epiteliálně-mezenchymální přechod > Podíl na vzniku CNB > Vyšší motilita a invazivita > Vznik chemorezistence > Detailní mechanismy stále předmětem výzkumu > Význam popsán u řady karcinomů (prsu, prostaty, plic, tlustého střeva, vaječníku, atd.) Vznik metastáz Karcinom in situ Podněty z prostředí: zánět, hypoxie Loká|ní inv Proliferace Extravazace EMT CNB Krevní destičky TGF-B1 Tsai et al., Cancer Cell, (2012) - upraveno Epiteliálně-mezenchymální přechod > U CNB popsán epiteliální i mezenchymální fenotyp > M+ buňky - spojeny s progresí onemocnění > Dynamické změny (g) Disease progression (r) Treatment response |E E>M E=M |M>E M Month 1 Circulating Breast Tumor Cells Exhibit Dynamic Changes in Epithelial and Mesenchymal Composition Min Yu,1*6* Aditya Bardia,1-3* Ben S. Wittner,1 Shannon L Statt,1-2 Malgorzata E. Smas,1 David T. Ting,1 Steven ]. Isakoff,1,3 Jordan C. Ciciliano,1 Marissa N, Wells,1 Ajay M. 5hah,! Kyle F. Concannon,1 Maria C. Donaldson,1 Lecia V. Sequist,1,3 Elena Brachtet,1'4 Dennis Sgroi,1'4 Jose Baselga,1'3 Sridhar Ramaswamy,1,3 Mehmet Toner,2,1 Daniel A. Haber,1,3'^ Shyamala Maheswaran1,1^ Yu etal., Science, (2014) Nádorové buňky uvolněné do cirkulace > Klíčová úloha ve vzniku metastáz > Heterogenita a plasticity > Detekce > Oblast intenzivního výzkumu > Klinicky významné > Počet koreluje s prognózou > Molekulární charakterizace - personalizace medicíny Extravazace o Penetrace buněk do okolní tkáně O Interakce nádorové buňky se stěnou cévy o Možnost proliferace uvnitř lumen cévy tissue (1) cancer ceil parenchyma (2) platelets endothelial cells _\_ Po° O ° (5) (3) capillary basement membrane Figure 14.9d The Biology of Cancer (© Garland Science 2014) Kolonizace o Velice nízká účinnost O Dormantní mikrometastázy o Metastatický relaps ÖXTOTÖXrCÖ genetically heterogeneous primary tumor dissemination of metastatic cells, subsequent removal of primary tumor acquisition of ■ ability to colonize mierom etastases scattered throughout the body (minimal residual disease) macroscopic metastasis new, secondary shower of metastatic dissemination new colonization-competent mierom etastases ® I 1 1 1 I multiple macroscopic metastases, disease relapse rapid expansion CK+ buňky v kostní dřeni negative N = 47 ■§ 0.4 -Q O 0.2 10 15 20 25 30 35 40 45 months after diagnosis Figur-; H,IM The Biology al ian Reversible acquisition of migratory and invasive properties by epithelial cells Role in embryonic development, fibrosis, cancer Basement Epithelial membrane cell Normal epithelium Prim; ca Card Primary EMT Patietal endoderm Mesoderm formation Neural crest delamination xSmc ri, R. and R.A. Weinberg, Secondary EMT Connective tissue of body wall muscle Arigioblast (blood vessels) Haematopoietic progenitors Endocardial progenitors Endocrine cell Hepatoblast migration to the migration t*..«L. Mn. Neural arches mesenchyme to septum ^iE. Ribs transversum baioiiiio ceiis Tendons mesenchyme eClin Tertiary EMT Cardiac/ Cushion _ mesenchyme . Cardiac valves 3d vessel ollagens ,V Secondary epithelial tumor Cancer cell extravasation MET ormal land airix xis irarrsruurrs irr ueveruprrrern 139(5): p. 871-90. M S Simonson Kidney I international 71 , 846-854 (May (1) 2007) Znaky a regulátory EMT E-cadherin EM j a-catenin y-catenin Program vimentm Fibronectin N-cadherin T Epithelial markers repressed Mesenchymal marke i induj EMI» Mitochondrion -+■ H.-nspj).. RTKs Mm. / Invasive carcinoma WNIR Kornelia Polyak & Robert A. Weinberg Nature Reviews Cancer 9, 265-273 (April 2009) Natura Reviews Cancer TGF-ß ——— ——————— ————» ^»jj^jj^jjjjjj^^j j^>wjj*>jjjwj ■yyyw»»»* ^wwwwwvww» ■»^■v>yyvvy>y»'>-»yv> ■w»»»/vv»yv»v>-< »»>■»•»■»■»»■»•>-»•>■> Smad2/3) Transcription factor 1 Snail family Sraill Snail2 Claudins Cccludin E-cadherin Desmoplakir Pia kopl- ihr Crumbs3 Cytokeratins > Fibronectin Vitronectin N-Cadherin Collagen MMPs Twist, Ids ZEB 1/2 < Jian Xu, Samy Lamouille, Rik Derynck Cell Research (2009) 19:156-172. I bHLH family E12/E47 Twist Ids Claudins ZO E-cadherin Plakophilin Crumbs3 i < Vitronectin N-cadherin MMPs Claudins Occludin E-cadherin Desmoplakin Plakoglobin >-< Fibronectin Vitronectin N-cadherin SPARC ct5-integrin Klíčové objevy v EMT a rakovině Experimentální přístupy ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF AN IMMORTALIZED BUT Malignant Transformation in a Nontumorigenic Human Prostatic Epithelial NON-TRANSFORMED HUMAN PROSTATE EPITHELIAL CELL LINE: BPH-1 Cell Line1 S. W. HAYWARD, R. DAHIYA, C. R. CUNHA, J. BARTER, N. DÉSHPANDE, ua> P. NARAYAN Simon \V. Hayward.2 Yuzhuo Wang. Mel Cao. Vun Kit Horn, Baohui Zhang. Gary D. Grossfeld. Daniel Sudilovsky, and Gerald R. Cunha Urethra • EMT markers • EMT TGF-ß regulators • Cell shape and behavior Cancer associated fibroblast - tumor derived TGF-ß EMT M) 60 u 50 •I 40= E 4 2 0 I 4» X membrane electrode Matrigel endothelial © cell cells 1 electrode cells ♦ electrode ♦♦mmm electrode without cell - Ml electrodes with otie cell attached electrode with two ceils attached ♦ electrode with two strongly-attached cells Figure 14.41c The Biology of Cancer (© Garland Science 2014} Diseminace solidních nádorů figure 14.42 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) CTGF\ ~ - I-I — M ^1 CXCR4 MMP1 GAPDH High5 Low5 High-4 High-3 IL-11,CTGF, IL-11,CTGF, CXCR4, MMP1 MMP1 Figure TIk Biology of Carrara Garland Science 2014) Thirty-three cells from a large population of human MDA-MB-231 cells were each expanded into a clonal population in culture. The mRNA expression pattern of each subclone was analyzed (columns, arrayed left to right) using probes for the mRNAs of five genes—IL11 (interleukin-11), OPN (osteopontin), CTGF (connective tissue growth factor), CXCR4 (chemokine receptor 4), and MMP1 (matrix metalloproteinase-1)—and, as loading control, a probe for GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA. In addition, the expression patterns of the original tumor cell population (ATCC, left column) and a subcloned cancer cell population termed 2287 (which was selected for its ability to generate osteolytic metastases; 2nd column) were analyzed. The five experimental genes were chosen because of their overexpression in osteotropic metastatic cells and their known biological properties in promoting osteolytic metastases. Clone 2 cells (red box), when injected into the arterial circulation of mice, showed a tendency to produce osteotropic metastases, as indicated by in vivo imaging; these cells expressed high levels of all five experimental mRNAs. Clone 3 cells (yellow box), in contrast, expressed low levels of all five mRNAs and preferentially formed lung metastases. And clone 26 genes (yellow box), which expressed essentially none of these mRNAs, formed no metastases at all. Moreover, when otherwise poorly metastatic cells were forced to express combinations of three of these genes, they acquired the ability to form bone metastases efficiently (not shown), pointing to the causal role of these genes in forming these metastases. Metastases were visualized through the presence of a luciferase gene in the tumor cells, which causes cells to release a bioluminescent signal. (From Y. Kang et al., Cancer Cell3:537-549, 2003.) Cell Cell 733, 66-77, Apr! 4, 2008 Tumor cells Gland #4 TGFp Primes Breast Tumors for Lung Metastasis Seeding through Angiopoietin-like 4 David Padua,1 Xiang H.-F. Zhang,1 Qiongqing Wang,1 Cristina Nadal,5 William L. Gerald,2 Roger R. Gomis,; and Joan Massague1-3 * B Lung Colonization Mastectomy Lung mets jUl 7 days -Vr 1000 LM2 cells • - TGF(1 ■ + TGFp - - c o o QBE H 1 801 M p <0.005 40 I-1 20- p<0.01 i 1—i - + 11 p Breast tumour Lung capillary oToTbl LM2 CN34 2A LM2 cells • - TGFp ■ *TGFp = 80 ■ Bone Colonisation c o □ 60 BoM-1833 cells | 40 A -TGFp ♦ + TGFp 20 O z o ami T TGFP i - + , i - » i LM2 BoM-1833 Vol 459 18 June 2009 doi:10.1038/nature08021 nature LETTERS Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain Paula D. Bos1, Xiang H.-F. Zhang1, CristinaNadal't, WeipingShu1, Roger R. Gomis't, Don X. Nguyen1, Andy J. Minn2, Marc J. van de Vijver3, William L. Gerald4, John A. Foekens5 & Joan Massague1,6 e Competence to seed Latent disease Competence to colonize (years to decades) Brain metastasis _. ^ALNACS, (brain colonizati01 COX2, HBEGF, ANGPTL4? m Qenesj Lung metastasis (lung cc genes) # COX2, EREG, ANGPTL4 ^ Q (lung ^Ionization Bone Bone metastasis (fenestrated sinusoids) ^ CXCR4 PTHLH IL11,MMP1,OPN Trends in Cancer Metastatická kolonizace mozku Trends in Cancer Metastatická kolonizace jater Claudin-2 Stellate ce Activated stellate cell Hepatocyte Fenestrated endothelium Trends in Cancer Bone marrow Bone matrix Osteoclast progenitor Ottier stromal cell Ok) I Oste°9er|ic niche Osteogenic cells TGF-p, BMP Bone lysis Activated osteoclast Osteoclast differentiation Osteotropní metastáze IQ osteoblastic meloítasií mineralized bone / osteoclast (ore)- 1 RANKL osteoclast precursors osteoblasts Trends in Cancer Osteotropní metastáze MDA-MB-231cells transfected with: o Parathyroid hormone-related pepetide (PTHrP) o Behěm laktace produkován normálními MECs -mammary epithelial cells - > mobilizace vápníku o Nádorové buňky - adaptují tento mechanismus -osteolýza kostí vede k uvolnění řady růsových faktorů stimulujících nádorové buňky dn TGF-ßRIl dn TGF-ßRIl + ca TGF-ßRI Figjif 14,49 Thí Biologyoľían«r<-oGoiljní Síkn«2014> Oč* dn TGF-ßRIl + PTHrP breast cancer cell lb lhrtroloqrafbM«rr/GGaflMdh*flcrlOMJ Aktivace růstových signálů Autocrine activation J Autocrine and intracellular i_ amplification Paracrine Paracrine activation amplification Cell-cell contact and activation Stem-cell growth and survival pathways NATURE I VOL 529 I 21 JANUARY 2016 I Reactive stroma Drug-resistant tumour NATURE I VO Table 1 | Preclinical and clinical history of four metastasis-directed drug development efforts Description Pathwa Denosumab Monoclonal antibody to RANKL Preclinical validatio RANKLactivates osteoclasts and promotes bone destruction; denosumab reduced bone resorption in mice expressing humanRANKL" Pivotal Trials and end points Outcomes SREs* in metastatic setting; adjuvant trials used time to first bone metastasis or fracture*"" FDA approved For prevention of SREs in solid tumours: approved as adjuvant therapy in prostate cancer Be vac izumab Monoclonal antibody to VEGI Client; itide avp3 and avß5 integrin peptide inhibitor 1 Adhesion h Motility 1 Viability • Angiogenesis •Viability Dosatinib and saracotenib 5RC kinase and BCR-ABL kinase inhibitor Endothelial cell Integrirrs • Bevacizumab inhibited corneal angiogenesis and lymphangiogenesV4 • In multiple cancer xenograft models, bevacizumab reduced primary tumourgrowth rates and, in some studies, enhanced survival. Reduced angiogenesis and vessel normalization was observed** • Prevention or, less Frequently, abrogation of metastasis2*6-*47 • Stabilization of glioma growth and angiogenesis. Synergistic inhibirion of glioma wirhTMZ61"64 • Synergy with therapeutics in melanoma primary tumour growth", synergy with radio- i m munoth e rapy i n brea st ca ncer tumour growthi4B • Inhibition of metastasis" • Synergy with verapamil increased angiogenesis and reduced metastasis^49 • Inhibition oFCML models"0 • Inhibition oF primary tumour growth Fn multiple model systems, as monotherapy or in combination"1"*" • Prevention of metastasis in multiple cancer model systems""1-"8, but not osteosarcoma"9 • Inhibition oF prostate cancer-growing in bone and bone remodelling*1-*' • Recurrent ovarian cancer, PF535-* • Metastatic colorectal cancer, OS™1 • Metastatic or resistant HER2J breast cancer, PFS36 • Metastatic renal cancer, PFS™ • Glioblastoma, OS, PFS263 • Advanced lung cancer, OS37 ■ Adjuvant therapy in triple-negative breast cancer, DFSH1 * Phase III CENTRIC EORTC, with radiation therapy and TMZ, for glioma. OS. Newly diagnosed glioma, same combination, recurrence65 * Phase II trials in melanoma and lung and prostate cancers, PFS66-W * Cytogenetic response end points ForCML * Response for advanced solid tumours71-80 « OS in Phase III prostate cancer67 • FDA approved for resistant ovarian, cervical and colorectal cancers, glioblastoma, also advanced or metastatic lung, colorectal and renal cancers • Revoked for metastatic breast cancer • Negative trials for first-line treatment of glioblastoma All advanced trials were negative • FDA approved for CMLand resistant ALL • Discontinued in advanced lung, ovarian, colorectal and breast cancers • Negative in prostate cancer Phase III trial with docetaxel • Multiple adjuvant trialsterminated ALL. acute lymphoblastic leukaemia; CML, chronic myelogenous leukaemia; DFS, disease-free survival; ECM, extracellular matrix; FAK. focal adhesion kinase; FDA. US Food and Drug Administration: 05. overall survival: PFS. progression-free survival: RANK, receptor activator of NF-kB: RANKL. RANKligand: RTK. receptor tyrosine kinase; TMZTtemozolomtde:VEGF, vascular endothelial growth factor. *Skeletal-related event (5RE) captures the deleterious effects of new lesions and progression of existing lesions to cause patient morbidity. NATURE REVIEWS I CANCER Shrnutí * 90% úmrtí na nádorová onemocnění souvisí s metastázováním o Invazivní kaskáda zahrnuje: lokální invazi, intravazaci, transport, extravazaci, formovaní mikrometastáz a kolonizaci * Nízká efektivita celé kaskády, nejméně efektivní je kolonizace o EMT, řízena pleiotropními TF v různých fázích embryogenéze, adaptována během tumorigeneze o Motilita je řízena malými GTPasami, Rho rodina > Proteázy (MMP) umožňují invazi nádorových buněk, degradace ECM O Tkáňový tropismus nádorových buněk lze v některých případech vysvětlit organizací oběhového systému, často prozatím neobjasněn Otázky + Jaké je možné vysvětlení nízké účinnosti kolonizace mikrometastáz? o Jaký mechanismus může vysvětlit korelaci mezi velikostí nádoru a prognózou vzniku metastáz? o Jaké důkazy podporují zapojení EMT v nádorové patogenezi, jaké jsou naopak proti?