Praktikum z genetiky rostlin JS 2017 Genetická analýza a genetické markery 1.Genetická analýza a zjištění počtu genů odolnosti k padlí u ječmene. 2.Identifikace genů - určení DNA markerů v genetické vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. 3.Genetické mapování genů odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Využití mapovacího softwaru. 4.Identifikace transgenních rostlin Arabidopsis thaliana. 5.Celogenomová genotypizace u jetele lučního • Genetické markery •Marker (genetický marker) •= signální gen, signální linie • •morfologické •bílkovinné (izoenzymy) •DNA • 1. založené na hybridizaci DNA • 2. založené na polymerázové řetězové reakci • amplifikace - specifických sekvencí • - náhodných sekvencí • • • • Především z důvodů velikosti rostlinného genomu, jsou potřeba nástroje, které umožňují jeho studium. Takovými nástroji jsou mutageneze, ale i genetické markery. Pokud hovoříme o genetických markerech v širším slova smyslu – morfologické, molekulární - bílkovinné, DNA. Význam jednotlivých skupin Morfologické – málo, spíše náhodně, využití především ve šlechtění jednoduchá detekce – podle fenotypu Molekulární – výhody – počet, pokrytí genomu, složitější detekce – elektroforeticky – agar, PAGE, kapilární, různé typy různý počet, srovnání mezi model druhy a plodinami, srovnání s genomem člověka Klasifikace podle metody, význam PCR Vlastnosti markerů 1.vysoký polymorfizmus 2.kodominantní charakter dědičnosti 3.častý výskyt v genomu 4.nezávislost na podmínkách prostředí 5.snadná dostupnost 6.snadné a rychlé testování 7.vysoká reprodukovatelnost 8.snadná výměna údajů mezi laboratořemi • • Typy DNA markerů: • 1. založené na hybridizaci DNA • 2. založené na polymerázové řetězové reakci • amplifikace - specifických sekvencí • - náhodných sekvencí • •Klasifikace DNA markerů podle použitých sond •= cílových lokusů (genů): •1. jednokopiové a vícekopiové sondy • RFLP (Restriction fragment length polymorphism • CAPS 2. mnohokopiové sondy • mikrosatelity, RAPD, AFLP • • • •- Izolace DNA • •- Restrikční analýza • •- Elektroforetická separace • •- Přenos DNA na membránu • •- Značení sondy • •- Hybridizace • •- Vizualizace rflp rflp-gel •Schéma RFLP markerů •Schéma CAPS markerů O153F O151F •Schéma SSR (=STR) markerů •RAPD - random amplified polymorphic DNA •DAF - DNA amplification fingerprinting •SCAR - sequence characterised amplified regions gelblack RAPD Dom, 1 oktamer až dekamer, sekvence náhodná, nespecifická PCR, nižší teplota anenalingu 40C DAF modifikovaná RAPD, primer 5 nukleotidů, produkt separován na PAGE, barven stříbrem • • JECNEM98 • •RAPD příklady : ječmen •Analyzována kolekce jarních ječmenů využívaných ve šlechtění na sladovnickou kvalitu • •Malé rozdíly v genetickém založení kolekce •AFLP - amplified fragment length polymorphism O152 AFLP O152 AFLPband •Vhodný pro hodnocení • •genových zdrojů • •vyhledávání markerů • •kvantitativní znaky • •Kapilární •elektroforéza Využití genetických markerů •Základní výzkum i šlechtění •Studium rostlinných genomů • 1.Otisk DNA (fingerprinting) 2.Stanovení evolučních vztahů (příbuznost genotypů), taxonomie 3.Genetické mapování Charakterizovat oblasti využití následně Ad 1 – využití především mnohokopiových sekvencí Ad 2 – speciální např. taxonomie – charakterizace sekvencí genů pro rRNA (DP) 3. Genetické mapování •1. Konstrukce genetických map určitého druhu •2. Identifikace nových DNA markerů -Vytváření nástrojů pro MAS (marker-assisted selection) -Poziční klonování genů • • •Konstrukce genetických map hlavních plodin •1986 – 1. mapa RFLP markerů u kukuřice a rajčete pocet map •Databáze projektů zabývajících se mapováním rostlinných genomů (celkem pro 66 různých druhů rostlin) •http://www.nal.usda.gov/pgdic/Map_proj/ • Teoretické otázky genetického mapování rostlinných genomů •Podstata genetického mapování •Pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi 2 lokusy •Polymorfizmus a jeho detekce •Výchozí křížení • Výchozí křížení fenotypově kontrastních rostlin – předpoklad pro genetickou odlišnost, a na molekulární úrovní předpoklad polymorfismu •Populace využívané k mapování • •F2 znak dominantní 3:1 • znak kodominantní 1:2:1 •B1 1:1 •Aneuploidní linie – viz schéma •Dihaploidní linie – homozygotní materiál •Rekombinantní inbrední linie (RIL) •Blízké izogenní linie (NIL) • •Znaky kvalitativní x znaky kvantitativní •Velikost populace •Počet DNA markerů pro zachycení vazby • • • http://plantbreeding.coe.uga.edu/images/f/f6/5_3.jpg •Aneuploidie 1 •1 •Lokalizace genů do vazbových skupin pomocí aneuploidů • trizomiků •1. Mutace a je lokalizována na trizomickém chromozomu • P: AAA x aa • F1: AAa Aa • F2: • 2 A a • AA 2 AAA AAa • 2 Aa 4 AAa 2 Aaa • 2 A 4 AA 2 Aa • a 2 Aa aa • • Fenotypové štěpné poměry: • A-- : aaa 1 : 0 • A- : aa 8 : 1 •2. Mutace b není lokalizována na trizomickém chromozomu • • P: AAA BB x AA bb • F1: AAA Bb AA Bb • F2: • AB Ab • AAB AAA BB AAA Bb • AAb AAA Bb AAA bb • A B AA BB AA Bb • A b AA Bb AA bb • • Fenotypové štěpné poměry: • AAA B- : AAA bb 3 : 1 • AA B- : AA bb 3 : 1 • • • •htthttp://www.helmholtz-muenchen.de/imi/zs/e-prinzip •Význam aneuploidie v současnosti •Identifikce 1 chromozomu při celogenomových studiích velkých genomů •Pšenice – polyploidie, příprava aneuplodů pro jednotlivé chromosomy, • jejich třídění průtokovou cytometrií Příklad: Genetické mapování mutace lycopodioformis Arabidopsis thaliana Materiál: morfologická mutace ly Populace F2 DNA markery – SSR (Simple sequence repeats ) mikrosatelity – CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) • • • • •Columbia • •lycopodioformis Schéma křížení Krizeni Vysvetlivky 1. Etapa práce 30 až 50 mutantních rostlin F2, hrubé mapování •Lokalizace používaných DNA markerů v genetické mapě •Arabidopsis thaliana •CAPS zeleně •SSR černě • •EAT •3,9 •nga63 •11,4 •G2395 •28,1 •CAT3 •29,9 •F19G10-23714 •33,8 •M235 •34,0 •UFO •49,6 •GAPB.2 •66,3 •nga280 •83,8 •G4026 •87,0 •AthATPASE •117,8 •1CH • •nga1145 •9,6 •PHYB •34,5 •nga1126 •50,7 •C2SOD2 •57,0 •nga168 •73,8 •MI79A •87,6 •Ml •90,8 •2CH • •GAPC •8,4 •nga162 •20,6 •AthGAPAb •43,8 •TOPP5 •59,2 •F1P2-TGF •60,0 •Bgl1 •75,2 •nga6 •86,4 •3CH • •MI122 •5,1 •GA1.1 •17,7 •nga1111 •29,6 •G4539 •57,6 •PRHA •78,9 •ATMYB3R •82,3 •nga1139 •83,4 •CAT2 •85,3 •nga1107 •104,7 •4CH • •MUK11D •CIW15 •8,5 •CIW17 •9,0 •nga225 •14,3 •CIW18 •15,0 •CIW16 •16,0 •PAI2 •17,0 •nga158 •18,1 •nga249 •23,7 •R89998 •38,7 •nga139 •50,5 •nga76 •68,4 •AthSO191 •79,9 •FM4 •93,1 •G2368 •125,1 •PDC2 •134,5 •5CH Postup •20 až 30 vzorků DNA ly z F2 •Kontroly: rodiče, F1 • •PCR pro SSR markery •ELFO • •PCR pro CAPS markery •Štěpení enzymem •ELFO •Segregující populace F2 a molekulární analýza - příklady gel lc • • •150 bp •140 bp •M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 • •nga249 gel280 •nga1126 • • •199 bp •191 bp •M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 •Výpočet podílu rekombinace r : • • • • •C…rekombinovaný chromozom • •Výpočet střední chyby podílu rekombinace sr: • • • • •n…celkový počet chromozomů • • •Odhad mapové vzdálenosti D dle Kosambiho mapovací funkce •(Kosambi, 1944): • • •Výpočet střední chyby odhadu mapové vzdálenosti sD: • Lokalizace mutantní alely ly v genetické mapě Arabidopsis mapa pro Biotechnologii2006001 •černá – SSR markery •zelená – CAPS markery •červená – analyzované mutace •2. Zpřesnění mapové pozice (200 mutantních rostlin) • vzdálenost 1 až 3 cM (200 až 600 kb, 45 až 135 genů) • •3. Identifikace kandidátních genů • až 2000 F2 rostlin, identifikace dvou DNA markerů v • co nejbližší pozici, identifikace rekombinantů • Nezbytná vysoká vysycenost genomu DNA markery • SNP, In/Del • • Charakterizace mutace na úrovni DNA • aagttacaaaagaaaATGGAGAATATGGGAACTAGAGTGATAGAGCCATTGATAATGGGGAGAGTGGTAGGAGATGTTCTTGATTTCTTCACTCCAACA ACTAAGATGAATGTTAGTTATAACAAGAAGCAAGTCTCCAATGGCCATGAGCTCTTTCCTTCTTCTGTTTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCATGGT GGTGATCTCAGATCCTTCTTCACTTTGgtaaatacatatatttaaattattttataataatgttggttttatttatattgtgccaaaaaaaaccatata aaacgtctcacttccttttcctcttacaagttttccatttctaactcaataatcttataaattgtagctttagtttttatcattcctttttccagtctt ttttttttaatggtaaaactcaaccgaaatgcaaaacagGTGATGATAGACCCAGATGTTCCAGGTCCTAGTGACCTCTTTCTAAAAGAACACCTGCAC TGgtacgtttaatttatttattctttcttttcattttgggcccatattccatatacattgcatttaaatcatttcgttataaccctaataaagtttttt ttgggtgtaagttatatacatttgagttggtcaaagatctccatcgccatgagttctcagaactttttctgtaaagtaataatattagtattgttgaat gtttcaatagGATCGTTACAAACATTCCCGGCACAACAGATGCTACGTTTGgtaaggcctcttcatgaatcttgtaatttaaatacttatacatatatc atgttatatagaaataaaaatatttgcattgtaatatagGCAAAGAGGTGGTGAGCTATGAATTGCCAAGGCCAAGCATAGGGATACATAGGTTTGTGT TTGTTCTGTTCAGGCAGAAGCAAAGACGTGTTATCTTTCCTAATATCCCTTCGAGAGATCACTTCAACACTCGTT AAATTTGCGGTCGAGTATGATCTTGGTCTCCCTGTCGCGGCCGTCTTCTTTAACGCACAAAGAGAAACCGCTGCACGCAAACGCTAGtttcatgattgt cataaactgcaaaaatgaaagaagaaaatttgcatgtaatctcatgtttatttgtgttctgaatttccgtactctgaataaaaactgccaaagatgagt tgaatccgaaatatcaattgagtttacagaagtattgataacgatctgtcgattatcagaataaaaactagattaattgcatatcatgtttagcattgt aatactacaaaaatagtaaactcttgattaattaataaaatctaagttgctgtagtatataaatcattaaatcctcatacatggcttgataggtcacat cacatgtagtgaaccttattatatgataaacgtggagatacggaaaaggatagttaaacgatgaaaactttttttagttctggtcaaagtgacaagacc ttgatgaccatctaaaatatgatcctctcc • • lycopodioformis (ly) qKlasická mutageneze (EMS) q qRaně kvetoucí rostlina s terminálním květenstvím a celkově malým habitem q q1 gen, recesivní alela q qChromozom 5; 12,4±1,3 cM q qKandidátní gen: q TFL 1 (Terminal Flower 1) • Důkaz: test na alelismus • • •lycopodioformis •S96 - standard PB080020 •terminal flower PB080028 logosci Znaky se sníženou vitalitou nebo letalitou •Důsledek - štěpné poměry? •Letální alela – recesivní •Test mutagenity – Müllerův embryonální test na letální gametické mutace Figure 3A Figure 3B Figure 3C Figure 4A Figure 4B Figure 4C •Kontrolní linie •Col • •Mutantní linie • •VIII-41 •280-4-4 Figure 1 • • • • • • • • Figure 5A Figure 5C Figure 5B •VIII-111 pTAc1 •Kyjovská et al.: Genetica 2003 T-DNA mutageneze Metodické přístupy související s genetickými modifikacemi Neinformativní charakter mutací, embryonální test Muller •Speciální problémy řešitelné mapováním u druhů s velkým genomem • •Podrobné mapování určité oblasti genomu • •Identifikace DNA markerů v těsné vazbě s genem •Speciální populace pro mapování – RIL, NIL, •BSA (Bulk Segregant Analysis) s cílem MAS • • • • • •RIL (recombinant isogenic lines) •Rekombinantní inbrední linie • • • • • • • • •F2 50,0% • •F3 75,0% •F4 87,5% •F5 93,8% •F6 96,9% •F7 98,7% •F8 99,5% • • • •F1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •X • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Křížení polymorfních •(fenotypově kontrast- •ních) linií •Ä časová náročnost •Å vysoká homozygotnost Homozygoti dom a rec, oba znaky v F8, eliminace heterozygotů – všichni informativní jedinci. Počítáme pro jednotlivé markery podíl rekombinace pro určitou fenotypovou kategorii. Rekombinovaný fragment druhého fenotypu, tedy 2. genetického pozadí • NIL (near isogenic lines) Izogenní linie Ä časová náročnost – vytvoření F1 + 6 x BC, selekce na daný gen (znak) v každé generaci •Å vysoká homozygotnost, rozdíl jen v lokusu konkrétního genu a jeho okolí •Å polymorfismus (DNA) mezi NIL s vysokou pravděpodobností souvisí s vazbou marker-gen • • • • • • • • • • • • •X • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •B1 •B2 • • • • • • • •B7 •P1 Donor •P2 Recipientní rodič •25% P1 •12,5% P1 •0,42% P1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •BSA (bulk segregant analysis) Årychlá příprava kontrastních skupin genotypů • z F2 generace • dominance, recesivita • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Rezistentní Segregující Náchylné •F2 • • •BSA • • •Rodič R Rodič S F1 R-Bulk S-Bulk • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •RIL • Rezistentní Náchylné • • • Genetické mapování genu odolnosti u ječmene •Hordeum vulgare •Padlí ječmene • • • • • •Šlechtění odolných odrůd •Významné zdroje genů odolnosti jsou plané ječmeny – H. vulgare ssp. spontaneum, H. bulbosum •23 zdrojů (donorů) odolnosti ječmene (H. vulgare ssp. spontaneum) k padlí ječmene (PI…..) • barley-powdery-mildew srovnání •původce Blumeria graminis •f. sp. hordei •v ČR i celosvětově jedna ze •závažných chorob ječmene padlí konidie Plant Introduction Genetické aspekty choroby Rostlina (hostitel) Patogen genom 1 genom 2 geny odolnosti R geny avirulence Avr většinou dominant alela dominantní protein 1 protein 2=elicitor Aktivace mechanismů odolnosti •interaction •rozpoznání Resistance mechanisms Plants have evolved a complex array of biochemical and enzymatic defence, both constitutive and inducible that is not involved in pathogen detection but whose effectiveness influences pathogenesis and disease resistance. Among the PR proteins, for example, chitinases and endoglucanases that attack and degrade the cell walls of pathogens, and with pathogens counterattack with inhibitors. Classicaly, two levels of resistance have been defined: Non-host resistance – where entire plant species or genus is resistant and therefore not a host for particular pathogen Host resistance - individuals within a species have developed genetically inherited ways of defending themselves against the organism that cause disease on other individuals within plant species. Passive=constitutive mechanisms of resistance –structural elements such as cuticle, root border cells, pre-formed antimicrobial chemical compounds within plant termed phytoanticipins. Active=induced mechanisms – hypersensitive response (local plant cell death), induction of specific gene expression within the plant, including gene involved in cell wall strengthening, repairing structural defences, genes for biosynthesis of additional antimicrobial compounds=phytoalexins, induction of genes encoding hydrolytic enzymes and, PR proteins. other defence-related proteins post-transcriptional gene silencing PTGS systemic resistance mechanisms systemic aquired resistance induced systemic resistance geny R 1.Mají schopnost detekovat (rozpoznat) patogena 2.Mají schopnost aktivovat obranné mechanismy • 1. • koncept gen – proti – genu Horizontal versus vertical – Horizontal – numerous genes have small additive effects; resistance varies by small amounts between cultivars, on the level of species? Vertical – gene for gene resistance, on the level of genotypes, controlled by single genes, resistance is either close to complete immunity if the gene is present, or complete susceptibility if it is absent. 1940 Flor working on flax/flax rust (Melampsora lini) in the USA and Oort working independently on wheat(wheat smug (Ustilago tritici) in The Netherlands, made the major breakthrough – it was possible to discriminate between different genotypes in the pathogen population by using different resistance genes in the plant populations. It was found that virulence was generally recessive and avirulence dominant, and this led to gene for gene koncept stating that for every dominant gene determining resistance in the host, there is a matching complementary dominant avirulence gene in the pathogen. Such gene have been identified in plants that confer resistance against bacteria, fungi, viruses, oomycetes, nematodes and insects, and a simple model to explain this concept is the elicitor/receptor model. In this, recognition of the elicitor derived from the functional avirulence gene in the pathogen by the product of the R gene in the plant activates a signal transduction pathway leasing to the hypersensitive response and resistance. It should also be noted that some R genes are only semi-dominant – Mla, allowing a greater degree of fungal ingress in the heterozygout state, and other R genes are influenced in their effectiveness by environmental conditions (e.g. temperature), and also by the age of the plant. Cíle studia donorů rezistence • • 1.Zjistit charakter dědičnosti genů u nových zdrojů odolnosti ječmene k padlí ječmene •2. Lokalizovat zjištěné geny odolnosti v genomu • ječmene pomocí DNA markerů •3. Vyvinout molekulární markery alespoň pro • některé ze zjištěných genů odolnosti (MAS) Od úrovně fenotypové – projev hodnocení choroby Genotypové - počet genů Molekulární Strategie řešení •1. Vytvoření vhodných populací pro analýzy • odrůda ´Tiffany´x zdroj odolnosti F2 •2. Fytopatologické testy – P, F1, F2 •3. Genetická analýza • Určení počtu genů determinujících odolnost •4. Získání DNA markerů pro ječmen H. vulgare • Určení polymorfismu u rodičů •5. Určení DNA markerů ve vazbě s jednotlivými geny odolnosti: • Analýza balků – náchylného a odolného Lokalizace genů na chromozomech ječmene • Mapa SSR markerů ječmene využívaných v laboratoři Barley Cons Varshney - mame •Druh – ječmen Hordeum vulgare •Hodnocený znak - odolnost k padlí travnímu •Původce padlí travního – Blumeria graminis • f. sp. hordei (houba) •Populace F2 •Křížení 7: •náchylná (S) x odolná (R) •H. vulgare cv. Tiffany x H. vulgare ssp. spontaneum • PI466200 • (zdroj odolnosti – planý ječmen) • • F1 F2 (100 rostlin) • Úkol č. I Analýza rezistence ječmene •1. Určit počet genů determinujících odolnost k padlí travnímu v uvedeném zdroji odolnosti ječmene, statisticky ověřit •2. Určit typ dědičnosti genu/genů odolnosti •3. Určit SSR/CAPS markery ve vazbě (analýzou balků) • • Rostliny rodičovské, F1 i jednotlivé rostliny F2 jsou otestovány virulentním izolátem Bgh • Stupnice hodnocení: • 0, 0-1, 1, 1-2, 2, 2-3, 3, 3-4, 4 • 0 až 3 – rostliny odolné, • 3-4 a 4 - rostliny náchylné • Tiffany RT4 • Zdroj odolnosti 7 RT0 • F1 RT0 • F2 balky (DNA) každý 17 rostlin • F2 100 rostlin (DNA) • F2 240 rostlin (fytopatologická analýza) • • Úkol č. 3 Určení markerů ve vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. Materiál: Zdroj odolnosti 7 (PI460200) Populace F2 (Tiffany x PI460200) Krajní třídy RT0 a RT4 DNA markery – SSR (Simple sequence repeats ) CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) chromozom 1H RGH1aE2d, Bmac0213, K06257 chromozom 2H Bmac0134 chromozom 3H K00088 chromozom 5H EBmac0684 chromozom 7H Bmag0011, Bmag0507 •Analýza bulků při dominanci odolnosti • S – z náchylných rostlin F2 • R – z odolných rostlin F2 • S1 – testovaný SSR marker není ve vazbě s genem odolnosti • S2 – testovaný SSR marker je ve vazbě s genem odolnosti • cross6Bmac0134 - tr4(15+6)upr cross6Bmac0154 tr0,0-1,4upr •