EKOLOGIE MIKROORGANISMŮ 7 Rostliny a mikroorganismy •Interakce nejen mezi mikroby, ale i mezi mikroby a okolím – rostlinami • •Rhizosféra je zóna převážně komensálních a mutualistických vztahů mezi mikroby a rostlinami • •Eko- a endomykorhizní houby poskytují rostlinám minerální látky a vodu • •Rostliny jim poskytuje fotosyntetáty • •Asociace mezi fixátory dusíku a rostlinami • •Kolonizace nadzemních povrchů rostlin převážně komensálními mikroby • •Také negativní vztahy - virové, bakteriální a houbové choroby • •Mutualismus – vysoce specializované interakce Rostliny poskytují uhlíkaté látky bakteriím pro růst Baterie \houby zvyšují příjem minerálů •Komenzalismus – kořenové exudáty poskytují živiny bakterím rostoucím na povrchu nebo v bezprostřední blízkosti Bežnější než mutualismus •Parazitismus Overview of the general approaches used for exploitation of plant–microbe interactions for biotechnological purposes. Two major approaches, namely forward and reverse genetics, can be used for gene discovery pipelines in both plants and microbes. The forward genetics approach broadly relies on identification of plant genotypes that are more responsive to interactions with beneficial microbes to maximize plant productivity under stressful conditions. These plant genotypes can be integrated into farming systems either directly or after further breeding. Identification and functional characterization of plant genes that influence the outcome of a particular plant–microbe interaction may require cloning of candidate genes (e.g. through marker-assisted cloning). Plants can then be either selected and/or genetically modified for altered expression of these genes. Similarly, microbes with a potential to interact beneficially with plants can be selected. Reverse genetics analyses of candidate plant and microbe genes involved in beneficial or detrimental interactions can then be identified through transcriptome analyses of plant and microbial genes altered in expression during the interaction. These candidate genes can then be functionally studied for their phenotypic effects using a variety of established techniques, such as gene overexpression or knockout, as well as other relevant physiological, microscopic and biochemical techniques. The information gathered from reverse and forward genetics studies can then be used to produce commercial plant varieties with an ability to better resist pathogenic microbes while being more receptive to beneficial microbes. Similarly, microbes that have the ability to beneficially interact with plants can be obtained and exploited in farming systems for potential improvement of plant disease and stress tolerance (see the text for further details). http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(11)00192-2 Symbióza •Symbióza s mnoha organismy - lepší přežívání v asociaci s dalším partnerem •Rozsivky, obrněnky, mořské houby, lišejníky, mechy, Geosiphon, Gunnera, Azolla… • The diatom Epithemia turgida contains endosymbiotic cyanobacteria in many of the cells. The endosymbionts are visible as round bodies within the cytoplasm. Sumky – bohatá produkce polysacharidů, produkce celulózy (filtrují z okolné vody), produkují velké množství nasycených omega-3 mastných kyselin, potenciál pro rozvoj alternativních paliv (rozklad celulozy na jedn.sacharidy) a současně je využitelný i jako doplněk stravy pro rybí farmy Symbióza se sinicemi Nostoc a Anabaena •Jaterníky • Mechy (Bryophyta) •Kapradiny (pteridophytes) Nostok pruniforme - kolonie Cykasy •Rod Cycas má specializovanou strukturu na kořenech zvanou „coralloid roots“ ještě před invazí sinic •Cykasy jsou nahosemenné rostliny běžné v tropech, některé najdete i na Floridě •jsou jediné nahosemenné rostliny fixující dusík • jediné cévnaté rostliny s kořenovými hlízkami, kde je prokaryotickým partnerem sinice Gunnera – noduly (Nostoc) na stonku •neobvyklá krytosemenná rostlina • dusík fixující sinice v kapsách na bázi řapíku •sinice vytváří filmy na listech i jiných tropických krytosemenných rostlinách • Gunnera má jedny z největších listů na zemi, častá v jižní a centrální Americe, kde se nazývá „nalca“ •Mladé řapíky se často loupou a jí. Nostoc punctiforma Azolla a Anabaena •Vodní kapradina Azolla rostoucí na povrchu vody v tropických a subtropických oblastech •na spodní straně listů dutiny obsahující sinice Anabaena •produkuje neurotoxiny – ochrana rostliny před spásáním…? •Anabaena může fixovat několik kg N za den, ročně 50-150 kg/ha – rýžová pole •Fixace není potlačena ani dusíkatým hnojením, není citlivá k pH a salinitě http://theazollafoundation.org/azolla/the-azolla-superorganism/ Kořeny rostlin •výborné prostředí pro růst mikroorganismů • • na kořenech a v jejich blízkosti velké množství a interakce mezi mikroby a kořeny uspokojuje nutriční požadavky obou partnerů • Rhizosféra - tenká vrstva půdy, která zůstane na kořenech po jejich otřepání - velikost záleží na druhu rostliny (struktuře kořenů) • • kořenové vlášení značně zvyšuje plochu kořenů v porovnání s kulovým kořenem • Př. jedna rostlina pšenice : • přes 200 m kořenů • průměrný průměr kořenů 0.1 mm • povrch kořenů pak přes 6 m2 • jen 4-10% plochy kořenů (rhizoplanu) v přímém kontaktu s mikroby • víc mikrobů je pak v celé rhizosféře Rhizoplan – plocha kořenů s tenkou vrstvičkou půdy Rhizosheath – modifikace rhizosféry – relativně tlustý cylindr půdy lpící na kořenech - typický u pouštních trav •zrnka písku spojené dohromady extracelulárním „mucigel“ – asi konzervace vláhy, nejspíš zvýšená mikrobiální činnost, naměřena zvýšená fixace dusíku •interakce v rhizosféře založené na hospodaření s vodou, uvolnění org. látek kořeny, mikrobiální produkce rostlinných růstových faktorů, minerální ch živin • • Mucigel – slizovitá viskózní substance vylučovaná kořeny rostlin – hydratované polysacharidy - lubrikuje kořenovou špičku při pronikání půdou - půdní částice se tu přichytí – zlepšení příjmu vody a živin - podnícení růstu prospěšných hub a bakterií fixujících N rhizosferní efekt – v rhizosféře 5-20-100x víc mikrobů než ve volné půdě – dle rostliny a jejího fyziologického stavu • víc G- tyčinkovitých bakterií a méně G+ tyček, koků a pleomorfních bakterií než ve volné půdě •více pohyblivých bakterií jako Pseudomonas - organismy s vyšší rychlostí růstu • Procesy v rhizosféře jsou determinovány vzájemným působením rostliny, půdy a půdních mikroorganismů. Jedná se o obrovský komplex vzájemně provázaných dílčích reakcí… Kořenové exudáty •AK •ketokyseliny •vitamíny •cukry •taniny •alkaloidy •fosfatidy • •Kořeny obklopené mikroby uvolňují mnohokrát víc látek než sterilní kořeny • • některé inhibují, ale většina stimuluje růst mikrobů • •mikroorganismy v rhizosféře mají jiné požadavky na výživu než mikrobi z volné půdy • • mnohé vyžadují AK k růstu – pravděpodobně z kořenových exudátů • •sukcese mikrobiálních společenstev na kořenech dle růstových fází rostliny • • během vývoje rostliny se výrazná rhizosferní sukcese odrazí ve vývoji mikrobiální populace rychle rostoucích mikrobů vyžadujících růstové faktory Sukcese mikrobiálních společenstev na kořenech •odráží to změny ve složení látek uvolňovaných kořeny • •nejprve karbohydráty a slizovité látky podporující růst velké bakteriální populace ve žlábcích epidermálních buněk na povrchu kořenů a slizové vrstvě • •s dozráváním kořenů dochází k lyzi části kořenového materiálu a uvolňují se jednoduché cukry a AK • •Pseudomonas a další rychle rostoucí bakterie • •stárnutí rostliny – úbytek bakterií • • 4týdenní rostliny kukuřice – 7% fotosyntetátů uvolněno v kořenových exudátech (25% fotosyntetátů doručených do kořenů) Fixace N2 v rhizosféře • V rhizosféře tropických trav Digitaria (listy plazící se po zemi), Panicum (spíš vysoké travy) a Paspalum se pravidelně nachází mikroaerofilní Azospirillum i aerobní Azotobacter paspali - •v polních pokusech až 40 kg N/ha • •Azospirillum i v mírném pásmu (trávy, kukuřice) – fixace zanedbatelná • •vedlejší produkt může být i vodík •některé rody Rhizobium a Bradyrhizobium mají hydrogenázu, která vodík využije • někdy zde Acinetobacter – využívá H2, který normálně není v aerobním prostředí •mělké mořské pobřeží – trávy Zostera marina (mořská tráva, vocha mořská ) v mírném pásmu a Thalassia testudinum (želví tráva) v tropických Spartina alterniflora •fixace N2 ve slaniskách s trávou - zřejmě směs bakterií a sinic – epifytně na mrtvých stoncích trávy •i obtížné invazní rostliny - tichomořské pobřeží USA, zde se rozšířila slanomilná travina Spartina alterniflora dovezená z Evropy v 19. století • ze záplavového ekosystému učinila hustě porostlou slanou bažinu • zmizelo mnoho míst, kde hledali potravu migrující ptáci •některé vodní toky se zcela zanesly sedimenty, kterým hustý porost brání v odplavování Efekt rhizosférní populace na rostliny • zesílený růst rostlin • zvýšená recyklace a rozpouštění minerálních látek • syntéza vitamínů, AK, auxinů, cytokininů, giberelinů • antagonismus k patogenům - založený na kompetici a vývoji amensálníchvztahů – produkce antibiotik V záplavových půdách • kořeny musí přivést vzduch ale v anaerobních podmínkách se musí vypořádat i s H2S • rýže (a možná i další) je chráněna mutualistickou asociací s Beggiatoa – gamma Proteobacteria • ta využívá kyslík a enzym katalázu z kořenů rýže a na oplátku oxiduje sirovodík na síru nebo sulfát–ochrana cytochromových systémů v kořenech •látky produkované mikroby podporují bujný růst kořenů • auxiny a gibereliny zvyšují rychlost klíčení a rozvoj kořenového vlášení -Arthrobacter, Pseudomonas, Agrobacterium (IAA) •rhizosféra pšenice – produkce IAA – indolová kyselina (auxin) –zvyšuje růst kořenů Alelopatické (antagonistické) látky • uvolňované mikroby v rhizosféře jedné rostliny mohou bránit růstu rostliny jiné • rhizosferní mikroflóra mladé pšenice brání růstu hrachu a salátu • při dozrávání ústup této mikroflóry a náhrada mikroflórou produkující růst podporující látky podobné giberelinům Mikroflóra zlepšuje příjem •fosfátů – mikrobiální kyseliny rozpustí apatit • železo a mangan – chelatační mikrobiální látky • vápník – díky zvýšenému obsahu CO2 – zvýší rozpustnost Ca • transport těžkých kovů • Někdy ale naopak poutání minerálů: • bakteriální imobilizace zinku (nemoc „malých listů“ ovocných stromů) • oxidace manganu – šedé skvrny dubu • imobilizace N (do biomasy, ale i ztráty – denitrifikací) Mykorhiza • symbiotické soužití hub s kořeny vyšších rostlin – mutualismus (porušení rovnováhy až parazitismus) •pronikání houbových vláken do kořenových buněk primární kůry (endomykorhiza) •vlákna jen v mezibuněčném prostoru (ektomykorhiza) •houbové mycelium nezasahuje nikdy do středního válce kořenu rostliny • až 90% rostlin má mykorrhizu • v travnatých porostech až 100m mycelia na 1 g půdy. • jde o specifický vztah – specializace • zvýšený příjem vody a živin, především P a N •Mykorhizní houby stimulují rhizosférní mikrofloru a její enzymatické aktivity, což je významné pro výživu, růst a zdravotní stav rostlin Ektomykorrhiza •zevní pseudoparenchymatická pochva víc než 40μm silná • 40% suché hmoty kořenů • hyfy v mezibuněčných prostorách epidermis a kortexu, ale nikdy v buňce! •Změněná morfologie kořenů– kratší a dichotomické větvení Typy mykorhiz schematicky znázorněné v příčném řezu kořenem. (E) - ektomykorhiza (kořen je obalen hustým hyfovým pláštěm, hyfy nevstupují do buněk, ale prorůstají mezibuněčnými prostory a tvoří tak Hartigovu síť), (A) - arbuskulární mykorhiza (v buňkách jsou keříčkovité arbuskuly, mezi buňkami váčkovité vezikuly), (O) - orchideoidní mykorhiza (hyfy tvoří charakteristické smotky v primární kůře, v některých buňkách jsou již tyto smotky odumřelé a zvolna se ztrácejí) , (Er) - erikoidní mykorhiza (hyfy tvoří také smotky, ale převážně v krycích vrstvách kořene), (M), (At), (Ee) - přechodné typy mezi endo- a ektomykorhizami: (M) - monotropoidní mykorhiza, (At) - arbutoidní mykorhiza, (Ee) - ektendomykorhiza. Všimněte si chybějících kořenových vlásků u ektomykorhizy, erikoidní a všech přechodných (Ee, At, M) mykorhiz. Kořenové špičky muchomůrky (Amanita) v mykorhizním svazku. Ektomykorhiza • nachází se u nahosemenných i krytosemenných (kvetoucích) rostlin • většina stromů mírného pásma má ektomykorrhizu • ascomycetes a basidiomycetes – acidofilní pH 4-6 (3) • houby někdy vyžadují vitamíny • naopak uvolňují auxiny, gibereliny, cytokininy, vitamíny, antibiotika, mastné kyseliny • někdy i enzymy – celulázy – ty ale v symbióze potlačeny • Přínos pro rostlinu • prodloužený růst a životnost kořenů • lepší příjem živin z půdy – větší plocha kořenů • rezistence k patogenům (fyzická bariéra + antibiotika) • zvýšená tolerance k teplotě, suchu, pH • Houba – fotosyntetáty (unikne kompetici o živiny) •bez rostliny často netvoří plodnice (i když roste) • dichotomické větvení a prodloužený růst kořínků • tvorba vlasových kořínků potlačena - nahrazeny hyfami • zvýšený příjem P a K (primární hromadění v mycéliu) • někdy kořeny uvolňují těkavé org. kyseliny s fungistatickým účinkem • rovnováha s mycorh. houbou i ochrana proti houbovým patogenům Příčný řez ektomykorhizním kořenem jeřábu ptačího (Sorbus aucuparia), s paraepidermálním typem Hartigovy sítě. Povrch kořene je kryt silnou vrstvou hyf houbového pláště (HP). Z něj vrůstají hyfy do mezibuněčných prostor jednovrstevné kořenové epidermis (=rhizodermis, Ep) a vytváří paraepidermální typ Hartigovy sítě (Hs). Další vrstvy primární kůry (PK) jsou již prosty kolonizace, stejně tak jako celý střední válec (SV). Ektomykorhiza Příčný řez ektomykorhizním kořenem vrby, na jehož obvodu je zvláště patrný několikavrstevný hyfový plášť tvořený symbiotickou houbou, Endomykorhiza •Hyfy vnikají do buněk •Unikátní postavení v symbióze - buňky jsou vně i uvnitř hostitele •Nevytváří se pochva kolem kořenů VAM vesikulo- arbuskulární mykorhiza • •Přítomnost arbuskulárních mycelií hub v půdě či v kořenech rostlin není - na rozdíl od hub ektomykorhizních - rozpoznatelná pouhým okem (mikroskop) • •Arbuskulární mykorhizní houby vstupují do kortikálních buněk kořenů hostitelské rostliny a vytvářejí zde typické útvary – arbuskuly a vesikuly •Krátkověké arbuskuly, které svou podobou připomínají malé stromečky, jsou místem intenzivní výměny živin mezi hostitelskou rostlinou a houbovým symbiontem • •Naproti tomu vesikuly, kulovité nebo oválné ztlustliny vytvářené na koncích nebo uprostřed intraradikálních hyf, plní zásobní funkci VAM vesicular arbuskulární mykorrhiza • ze 2,6 miliónů známých rostlinných druhů odhadem 240 tisíc může mít mykorrhizu s 6000 druhy hub •tři čeledi: Glomaceae, Acaulosporaceae, Gigasporaceae • tyto houby se objevily zhruba před 383-462 milióny let a asi pomohly rostlinám kolonizovat zemi •VAM typ nezmění strukturu kořenu, proto hůře detekovatelný • Častý u pšenice, kukuřice, brambor, bobu, sóje, rajčat, jahod, jablek, pomerančů, hroznů, bavlny, tabáku, čaje, kávy, kakaa, cukrové třtiny, javoru, gumovníku, a různých bylin •kvetoucí rostliny (angiosperms), gymnosperm (konifery), pteridophytes, bryophytes a většině důležitých zem. plodin •VAM houby se nepodařilo pěstovat v čisté kultuře •Největší známé houbové spory – 20-400 μm • Gigaspora margarita •Gigaspora margarita - až 250.000 bakteriálních endosymbiontů v jedné houbové spoře – identifikovány PCR jako Burkhorderia (prekurzor eukaryotických mitochondrií?) – nif gen – fixace N? • Mycelium odolnější stresům než kořeny (sucho, kovy, pH) •Zvýšený růst rostlin - zvýšený příjem P, Zn, sulfátů, amonného iontu VAM •Důležité zvláště v tropických půdách deficitních na P – problémy po vykácení tropických pralesů •Bujnost tropických pralesů založena na mykorhize (uzavřený cyklus živin: rostliny-mykorrhiza); •V porovnání s lesy mírného pásma zde není téměř humus, opad a téměř žádné minerální soli – vše vymyté tropickými dešti •Po vyklučení pralesa jedna nebo maximálně pár úrod a pak vše vyplaveno a bez hnojiv nic neporoste – opuštění půdy, eroze •Může fungovat jen v malém měřítku (nízká hustota populace), kdy prales po 2-3 plodinách opět zaroste malé políčka (na desítky let) •endomykorhiza mnohem méně nápadná než ektomykorhiza • •oba typy mají externí hyfy, endomykorhiza netvoří hyfový obal kolem kořene • •endomykorhiza – na stále rostoucích i dočasně rostoucích kořenech • •ektomykorhiza – jen na dočasně rostoucích bočních krátkých kořenech • •na rozdíl od ektomykorhizy, hyfy endomykorrhizy pronikají stěnu buněk kortexu- vesicle a arbuscule • •ale ani jedna mykorhiza neproniká cytoplasmatickou membránou • •ani jedna mykorhiza neproniká za endodermis • • ektomykorhiza - dub, borovice, eukalyptus, bříza, Dipterocarpus či oliva • •jen pár stromů v mírných oblastech jsou jen endomykorhizalní (douglaska, osika, Liliovník tulipánovitý, Javor cukrový and ambroň ) •Nejméně několik těchto druhů (douglaska, osika) mohou vytvářet oba typy Erikoidní endomykorhiza •hyfy pronikají do buněk rostliny • nejde o typ vesicular-arbuscular • najdeme u pár řádů rostlin, například vřesovcotvaré (borůvka,drchnička, rododendrony) –– rašeliniště, vřesoviště • houba kolonizuje buňky rhizodermis • v buňkách klubka a smyčky – výměna látek • houba nefixuje N2, ale rostlina má lepší přístup k N, P a ostatním minerálům – významné v půdách s nízkým obsahem minerálních látek a nízkým pH • houba čerpá živiny z odumřelých houbových hyf i živočichů (chitinázy, proteázy) Kultura erikoidní houby izolovaná z rostliny Woollsia pungens Kultura erikoidní houby izolovaná z rostliny Woollsia pungens Orchideoidní mykorhiza • téměř všechny orchideje - je to obligátní • zcela mykotrofní jsou nezelené heterotrofní orchideje •např. Neottia nidus-avis (hlístník) a klíční stádia všech druhů orchidejí – semena malá s málo živinami • často Armillaria mellea, Rhizoctonia solani •houba proniká do buněk vnějšího kortexu, později zaniká (využita rostlinou) – vytváří zde klubíčka hyf • ale houby mohou být i parazité hostitelů a naopak hostitel může strávit houbu –to se i děje – kolaps klubíček • přesně vyvážený vzájemný parasitismus • Armillaria mellea – václavka – bioluminiscence Orchidejové louky Bílé Karpaty Průmyslová fixace dusíku • •V průběhu 19. století se postupně zvyšovala poptávka po dusičnanech a amoniaku - hnojivo a výbušniny • •zjevným zdrojem byl atmosférický dusík (N2), který tvoří téměř 80 % vzduchu • •vzdušný N2 je velmi stabilní a nereaguje přímo s jinými chemikáliemi • •Haber-Boschův proces - umělý proces fixace dusíku-v současnosti hlavním postupem pro průmyslovou výrobu amoniaku • •Proces přeměňuje atmosférický dusík (N2) na amoniak (NH3) reakcí s vodíkem (H2) za vysokého tlaku a teploty a za přítomnosti kovového katalyzátoru • N2 + 3 H2 → 2 NH3 (ΔH° = −91.8 kJ) => (ΔH° = −45.8 kJ·mol−1) •Množství dusíku z průmyslové fixace je podobné biologické fixaci, cca 100 mil tun N hnojiv za rok Fixace dusíku Biologická fixace dusíku •diazotrofie, je schopnost některých prokaryotických organismů (bakterií včetně sinic) redukovat trojnou vazbu v molekule atmosferického dusíku a začlenit jej do organické sloučeniny (amoniaku) •proces - pomocí enzymu nitrogenázy a za dodání energie (ATP) •Diazotrofní organismy jsou klíčové v koloběhu dusíku v přírodě, protože umožňují fixaci atmosférického dusíku do organických sloučenin organismů • •bakterie, které umí fixovat dusík vstupují často do symbiotického svazku s vyššími rostlinami • •Tyto symbiotické bakterie se často označují jako hlízkové bakterie, protože žijí v specializovaných orgánech-hlízkách •Mnoho dusík fixujících bakterií však nemá tendence asociovat se s kořeny vyšších rostlin (žijí volně) •velké množství dodané energie, která je nutná k fixačním reakcím- největší význam autotrofové (zejména sinice) • •Heterotrofní bakterie většinou vstupují do relativně úzké symbiózy s rostlinou, která jim energii dodává •Reakce se odehrává v několika krocích: N2 +H2→ HN=NH +H2→ H2N-NH2 +H2→ 2 NH3 +2H+→ 2 NH4+ •Amoniak je kvůli své jedovatosti (při vyšších koncentracích) ihned zabudováván do neškodných aminokyselin (např. glutaminu) a v této formě dále rozváděn po těle • •obrovské množství energie - 16 molekul ATP, nutné k redukci jediné molekuly N2 • • údajně až 20% veškeré energie produkované při fotosyntéze v hostitelské rostlině se spotřebovává v hlízkách k hlízkové fixaci • •s každým fixovaným N2 je také vytvořen H2 a může být redukován substrát jako acetylén na etylén (detekce fixace N) • •jen některé kmeny rhizobií a bradyrhizobií mají hydrogenázu a mohou využít vytvořený vodík (jinak uvolňován jako odpad) • Typy diazotrofů •Diazotrofové - v mnoha bacteriálních taxonomických skupinách -v Eubacteria, ale pár i v Archaea •i u druhů, které fixují N2, mohou být kmeny nefixující (Postgate, 1998) •Fixace je zastavena, pokud je k dispozici jiný zdroj N a u mnoha druhů i za přítomnosti většího množství kyslíku •Různé mechanismy ochrany před kyslíkem Diazotrofní organismy se dají obecně rozčlenit do několika skupin: • žijící volně v půdě - rody Azotobacter, Azomonas, Azotococcus, Beijerinckia • • žijící v asociaci s kořeny rostlin - aerobní (nebo mikroaerofilní) spirily - například rod Azospirillum • žijící v symbióze s kořeny bobovitých rostlin - rody Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, souhrnně hlízkové bakterie •Dále jsou fixace vzdušného dusíku schopné některé sinice (Nostoc, Anabaena) a aktinomycety (Frankia), některé bakterie oxidující síru a enterobakterie (Escherichia) Mechanismy ochrany proti O2 • exprese enzymů jen v anaerobních podmínkách •exprese enzymů v oddělených tkáních od fotosyntetických (některé sinice) • časové oddělení fotosyntézy a fixace dusíku den – noc – u některých sinic •využití proteinů odstraňujicích kyslík – leghemoglobin - jenž je nezbytný při plnění funkce enzymu nitrogenázy Volně žijící diazotrofové • méně prozkoumané, často obligátní anaerobové netolerující kyslík i když nefixují N2 • • žijí v prostředí s nízkým obsahem kyslíku – půdy, rozkládající se organická hmota (Clostridium) • •sulfát redukující bakterie – důležité v mořských sedimentech (e.g. Desulfovibrio) • •některé methanogenní Archea – fixace dusíku v bahně a zažívacím traktu zvířat • •Fakultativní anaerobové – rostou v prostředí s/bez kyslíku, ale fixacejen v anaerobních podmínkách • •Často rychlost respirace kyslíku odpovídá rychlosti jeho doplňování – výsledkem je nízká koncentrace volného kyslíku • •Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa, B. macerans a Escherichia intermedia • •Aerobové – vyžadují kyslík k růstu ale jejich nitrogenaza je stále ke kyslíku citlivá • •Azotobacter vinelandii – vysoká rychlost respirace a ochranné sloučeniny • •Další druhy používají stejný způsob, ale rychlost respirace je nižší • •Fototrofové - fotosyntetické bakterie – produkce O2 při fotosyntéze •Ale některé i tak fixují N2 – heterocysty - nemají část fotosyntézy produkující kyslík - Anabaena cylindrica a Nostoc commune •Jiné sinice nemají heterocyty a fixují N2 jen za nízké úrovně osvětlení a kyslíku (např. Plectonema) Hlízková symbióza •především v čeledi bobovitých Fabaceae, citlivkovitých (Mimosaceae) a sapanovitých (Caesalpiniaceae). bobovité rostliny se často sázejí na polích za účelem zvýšení obsahu dusíku v půdě •Bakteriálním symbiontem (fixátorem dusíku) jsou gramnegativní bakterie, souhrnně zvané hlízkové bakterie (rhizobia) • •57 druhů v 12 rodech, nejznámější jsou rody Rhizobium, Bradyrhizobium či Sinorhizobium •bakterie a bobovité rostliny tvoří vnitrobuněčnou symbiózu • •Rostlinné buňky obsahují váčky s bakteroidy, kterým jsou dodávány energeticky bohaté organické látky (např. kyselina jablečná a sukcinát) a ionty železa, molybdenu a síry • •Rostlina naopak přijímá amonný kationt (NH4)+ (mutualistické soužití) • •silná hostitelská specifita, jež je realizována lektiny - proteiny na povrchu kořene, které jsou rozpoznávány bakteriálními receptory produkovanými geny Nod Hlízka (nodul) •uměle vytvořený orgán v kořeni, který vzhledem k vysokému obsahu proteinu leghemoglobinu, jenž je nezbytný při plnění funkce enzymu nitrogenázy, dostává růžové zbarvení • • Vzniku hlízky předchází soubor interakcí mezi bakteriemi a hostitelskou rostlinou • • bakterie najdou svou rostlinu po směru koncentračního spádu flavonoidů, sekundárních metabolitů, které aktivují některé bakteriální geny (tzv. Nod geny), díky nimž bakterie začne syntetizovat vlastní chemikálie patřící do skupiny lipooligosacharidů •na tyto látky zareaguje rostlina diferenciací speciálních dělivých pletiv (hlízkové meristémy), které zahájí tvorbu hlízky • • bakteriálními signály dochází k ohnutí kořenového vlásku, narušení buněčné stěny a kontaktu bakterie s endoplazmatickým retikulem hostitele • •prorůstáním membrány infikovaným kořenovým vláskem vzniká infekční vlákno, které proniká do dalších rostlinných buněk, kde se odškrcují váčky s jednotlivými bakteriemi • • bakterie (nyní již nazývané bakteroidy) se následně zvětšují a mění tvar Rhizobium - leguminózy, čeleď Fabaceae • kyslík je vázán na leghemoglobin v kořenových hlízkách a dodáván v množství, které nepoškodí nitrogenázu • Frankia – hlízkám podobné struktury – v nich frankie vytváří struktury podobné heterocystám – fixace N2 •Frankie také produkují hemoglobiny (Beckwith et al., 2002), ale jejich role méně prozkoumaná než u rhizobií • na první pohled se může zdát, že infikují skupiny nepříbuzných rostlin (olše, Přesličník přesličkolistý -Casuarina equisetifolia, Latnatec, Vřesna bahenní, dryádky), revize fylogeneze kvetoucích rostlin prokázala těsný vztah těchto druhů a leguminóz •Sinice – existují i symbiotické sinice – některé s houbami (lišejníky), s játrovkami, kapradinami a cykasy •Nevytváří hlízky, mnohdy tyto rostliny ani nemají kořeny •Asociace s kapradinami jsou i významné ze zemědělského hlediska - vodní kapradina Azolla s Anabaena - rýže Symbiotická fixace dusíku •Jeden z nejdůležitějších symbiotických vztahů mezi bakteriemi a rostlinami • •Bakteriální buňky proniknou do kořenů vhodné rostliny a vytvoří zde nádoru podobné struktury – hlízk •y •Nitrogenázový enzymový systém: dinitrogenáza (MoFe protein) adinitrogenáz reduktáza (Fe protein) • •chemotaxí ke kořenovým vláskům – rostlinné lectiny (specificita) • •tryptofan z kořenových exudátů rhizobii přeměněn na IAA – ohyb nebo rozvětvení k. vlásku kolem bakterií • •polygalakturonáza depolymerizuje a změkčí buněčnou stěnu kořenových vlásků • • rhizobia do rostlinných buněk – tvorba infekčního vlákna (rostlinný materiál) • • infekční vlákno do kortexu a infikuje tetraploidní buňky, které se začnou množit a vytvoří tkáň hlízky • •rhizobia uvolněna z infekčního vlákna, ztrácí tyčinkovitý tvar, vytvoří bakteroidy a začne fixace dusíku Sinorhizobium meliloti on the roots of the legume Medicago truncatula The central micrograph shows the cellular components of M. truncatula root nodule during an early stage of infection and at a magnification of 1600. Clearly visible and labeled are traditional organelles such as the nucleus (N), vacuole (Vac), endoplasmic reticulum (ER), plastid (P) containing starch grains, and cell wall/plasma membrane. The micrograph provides an image of the rhizobia infection thread (IT) which results from the invagination of the cell wall/plasma membrane and contain rhizobium bacteria. Bacteroides are formed as the bacteria segregate from the infection thread and enter the cell and are encapsulation by a symbiosome plant membrane. The number of bacteroides generally increases with the maturity of the nodule cell. http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2013.00112/full Azorhizobium •hlízky na kořenech a stoncích rostlin Sesbania rostrata (tropy) • schopné využívat atmosferický dusík i volně •Rhizobia – volně v půdě, ale málo a nefixují Vztah Rhizobium – hostitelská rostlina • oboustranně specifický vztah • •Rhizobia a bradyrhizobia přitahována AK a dikarboxylovými kyselinami v kořenových exudátech a také velmi nízkými koncentracemi látek - flavonoidy • •Lectiny -rostlinné proteiny s vysokou afinitou ke karbohydrátovým skupinám na povrchu vhodných rhizobií – specifické mediátory - přichycení rhizobií k kořenovým vláskům • •Flavonoidy a isoflavonoidy vylučované rostlinou indukují expresi nod genů v rhizobiích – enzymy biosyntézy substituovaných lipooligosacharidů, Nod faktorů • •exkretovány, způsobí ohnutí kořenových vlásků a dělení meristematických buněk vedoucí k vytvoření hlízky • •V hlízce buňky s bakteroidy jsou tetraploidní, mezi nimi i normální buňky které spojují hlízky s kořenovým cévním systémem • •Při přeměně rhizobiální buňky na bakteroid dochází k degeneraci bakteriálního chromozómu – bakteroid se pak už nemnoží • •Tvorba nitrogenázy v bakteroidu – rostlina hraje roli v zahájení a kontrole její syntézy •Hlízky – červenohnědé - díky leghemoglobínu – nosič elektronů • zásobuje bakteroid kyslíkem pro tvorbu ATP a zároveň chrání nitrogenázu proti kyslíku •Hemová část kódována rhizobiem, globinová část rostlinou • • Signal exchange in Rhizobium-plant symbiosis. Flavonoids produced by the host plant induce rhizobial nod genes. This leads to production of Nod factors. The insert shows an infection thread passing the root cortex toward a cluster of dividing cells that will become a root promordium. Neleguminózní dusík fixující mutualistické vztahy • s rhizobiemi, sinicemi a aktinobakteriemi •Rhizobium a tropický strom Trema – pionýrská rostlina •v tropických a subtropických oblastech Frankia alni – také tvoří hlízky na kořenech stromů • v mírném a subpolárním pásmu část hyfy se diferencuje do tzv. vesicles – fixace N2 •Frankia fixující dusík vytváří vezikula i bez rostliny v čisté kultuře • • s rody: Alnus, Myrica (vavřín- nové koření), Hippophae - Rakytník rešetlákový 10x víc C než v pomerančích Frankia and actinorhizal nodules a Frankia in pure culture; nitrogen-fixing vesicles 2-6 mm (v) and sporangia (s) can be observed. b Actinorhizal multilobed nodules on the root system of the actinorhizal plant Allocasuarina verticillata. c Pseudolongitudinal section of a nodular lobe from A. verticillata; the nitrogen-fixing zone contains large cells filled with Frankia (f), and the infection zone (iz) is located in the apex of the nodular lobe. https://www.researchgate.net/publication/225535435_Franche_C_Lindstrom_K_Elmerich_C_Nitrogen-fixing _bacteria_associated_with_leguminous_and_non-leguminous_plants_Plant_and_Soil_321_35-59/figures?lo= 1 Casuarina – v tropické a subtropické oblasti Austrálie s Frankia Dryas – dryádka • trvalka (bylina) arktických a alpinských oblastí Evropy, Asie a Severní Ameriky •Hyfy aktinobakterie pronikají kořenem, stimulace buněk kortexu – dělí se •Hyfy proniknou do těchto buněk, dělají klastry a formují vezikula na koncích hyf •V okolí infikovaných buněk je indukováno kořenové primordium, které roste do kortexu •Aktinobakterie vnikne do meristematických buněk primordia a látky produkované aktinobakterií stimulují další vývoj kořenového primordia •Dichotomické dělení vrcholu meristému vytvoří klastry laloků zvaných rhizothamnoion A cortex swelling called « prenodule », that constitutes the first step in the establishment of the nodule, longitudinal cut of an alder nodule, stained with cotton blue in order to visualize cortical cells full of Frankia vesicles. http://www.ecologiemicrobiennelyon.fr/spip.php?article677&lang=en Interakce mikroorganismů se vzdušnými částmi rostlin •Stonky, listy a ovoce – epifytní mikroflóra – heterotrofní a fotosyntetické bakterie, houby (především kvasinky), lišejníky a některé řasy •fylosféra – habitat/prostředí přiléhající k povrchu listů •Phylloplane – fyloplán – přímo povrch listů • •Na jehličnanech – Pseudomonas (fluorescens) •Populace bakterií z jehličnanů využívají jako zdroje C cukry a alkoholy •ve srovnání s mikroflórou pod stromy (litter layer) – zde víc lipolytické a proteolytické aktivity • Žito – sezónní změny •květen – xanthomonady a růžové chromogeny •červenec – xanthomonady a pseudomonady •září – xanthomonady •říjen – listeriae, staphylococci • Kvasinky jsou častou mikroflórou listů •Sporobolomyces roseus •Rhodotorula glutinis •R. mucilaginosa •Cryptococcus laurentii •Torulopsis ingeniosa •Aureobasidium pullulans •Mikroflóra listů včetně kvasinek bývá často pigmentovaná– ochrana proti UV •Mikroflóra na listech musí vydržet i další stresy – sucho, teplo– specializované ochranné buněčné stěny •speciální způsoby rozšiřování na další listy – např. hmyz přenáší mikroorganismy z plodu na plod (octomilka a kvasinky) • Někdy i těsný synergický vztah mezi mikroorganismem, hmyzem a rostlinou: • jeden druh fíkovníku (Calimyrna) musí být opylen speciální fíkovou vosou (Blastophaga psenes), která zároveň infikuje fík kvasinkou Candida guilliermondii var. carpophila a Serratia plymuthica, které se zde pomnoží, ale nezpůsobují kažení fíku https://www.youtube.com/watch?v=oSuoH72jpeo Schéma vztahu mezi fíkovníkem a opylovací vosičkou. Samice fíkovnice s pylem fíkovníku vstupuje do sykonia, kde klade vajíčka do některých samičích květů. Současně tyto i ostatní květy opyluje. Jakmile splní svůj úkol, zahyne a v sykoniu se vyvíjejí její larvy obou pohlaví i několik semen fíkovníku. Po nějaké době se vylíhnou mladé vosičky. Samci kopulují se svými sestrami a zahynou. Oplozené samice opouštějí sykonium, cestou však na sebe nanesou pyl fíkovníku. Sporobolomyces • je asi nejúspěšnější houba na povrchu listů •produkce ballistospor – střílí z listu na list •mnoho dalších hub izolováno z fylosféry: Ascomycota, Basidiomycota,Deuteromycota •některé alochtonní (normálně se nachází v půdě) •některé patogenní (Alternaria, Epicoccum, Stemphylium – dobře rostou pouze za příznivých podmínek) •počet a druhové složení mikroflóry dle ročního období (sezónnost) a věku listů •Ascochytula, Leptosphaeria, Pleospora, Phoma – saprofyt – začne víc růst až na začátku senescence listů Sporobolomyces Mikroflóra květů •krátkodobý habitat pro epifytní mikrofloru • zde často Candida reukaufii a C. pulcherrima, Torulopsis,Kloeckera, Rhodotorula; •po opylení a během zrání se podmínky a s nimi i mikrobiální populace mění – často pak dominantní Saccharomyces • Pozitivní a negativní vztahy mezi mikrobiálními populacemi na rostlinném povrchu: •osmofilní kvasinky sníží koncentraci cukrů a připraví prostředí pro jiné mikroorganismy • nenasycené mastné kyseliny produkované kvasinkami inhibují G+ bakterie • bakterie na ovoci závislé na růstových faktorech (thiamin, kyselina nikotinová) produkovaných kvasinkami • kvasinky závislé na růstových faktorech produkovaných bakteriemi •Mikroorganismy rostou na kůře stromů – lišejníky a houby (Myxomycetes – Licea, Trichia, Fuligo) – i fixace N2 – v korunách • •Lišejníky v korunách stromů – fixace dusíku …… •Symbiotická fixace N nejen na kořenech-Azolla rostoucí na povrchu •vody v tropických a subtropických oblastech má na spodní straně listů dutiny obsahující sinice Anabaena Anabaena může fixovat několik kg N za den, ročně 50-150 kg/ha – rýžová pole •Fixace není potlačena ani dusíkatým hnojením, není citlivá k pH a salinitě Free-living Anabaena and Azolla a Free-living Anabaena strain cultured in medium deprived of nitrogen; heterocysts (h) can be observed among vegetative cells (v). b Frond of Azolla pinnata digested by cellulase and pectinase; cavities (c) filled with symbiotic Anabaena azollae are visible. https://www.researchgate.net/publication/225535435_Franche_C_Lindstrom_K_Elmerich_C_Nitrogen-fixing _bacteria_associated_with_leguminous_and_non-leguminous_plants_Plant_and_Soil_321_35-59/figures?lo= 1 •Fixace N i ve fylosféře terestriálních rostlin včetně konifer •Část N fixovaného v „phylloplane„ zůstane v korunách stromů a je recyklována zdejší mikroflórou, část se spláchne do půdy, část přijata přímo listy, část zkonzumována býložravci •Některé bakterie mohou infikovat listy čeledi Myrsinaceae a Rubiaceae, vytvořit na nich listové hlízky, některé schopné fixace N Některé houby mohou růst intercelulárně v travách čeledi Poaceae a chránit je proti herbivorům •Kostřava rákosovitá (Festuca arundinacea) a jílek vytrvalý (Lolium perenne) s houbami Acremonium coenophialum a A. lolii •Endofyt nezpůsobuje žádné příznaky nemoci, získává fotosyntetáty a syntetizuje alkaloidy jako ergopeptidy, loliny, lolitremy a peraminy •jsou jedovaté nebo alespoň odpudivé pro nematody, mšice a další hmyz a býložravce •Lolitremy jsou zvlášť silné neurotoxiny - mohou způsobit ztráty na dobytku Kostřava rákosovitá Jílek vytrvalý Acremonium • není známá volně žijící forma, není infekční •množí se (udržuje se) semeny trav – tyto obsahují endofyta • endofyt se dá odstranit skladováním semen při vyšší teplotě • není známé sexuální stádium – Deuteromycota • je velice podobné Epichloe typhina - plíseň dusivá, parazituje na stéblech a pochvách trav - také asymptomatický endofyt až do kvetení trávy – zde se projeví, mycelium se objeví vně a zastaví kvetení • možná se Acremonium vyvinulo z tohoto parazita Bakterie způsobující tvorbu ledových krystalů na rostlinách • některé kmeny Pseudomonas syringae a Erwinia herbicola produkují povrchový protein, který může zahájit tvorbu ledových krystalů • při teplotě -2 - - 4 oC se formují ledové krystaly-poškození a bakterie pak zkonzumují rostlinu • při nahrazení jinou mikroflórou krystaly až při teplotách -7 - -9oC • genetické inženýrství „ice-minus“ P. syringae •https://www.youtube.com/watch?v=hKT_SGK2qtY Snět kukuřičná - 1970 (Helminthosporium maydis) – Ustilago maydis Destrukce 10 mil akrů kukuřice (4 mil. ha – 40 tis km2 – ½ ČR) ARTICLES The Southern Corn Leaf Blight Epidemic L. A. Tatum 1 A dramatic shift in the genetics of host-parasite interaction and balance occurred in the U.S. corn crop in the 1970 growing season. Southern corn leaf blight incited by Helminthosporium maydis Nisikado & Miyake evolved from a minor disease that causes an average annual loss of less than 1 percent, to one that caused more than the 12 percent average expected from all diseases of corn in the United States. In 1970 the losses to corn leaf blight approaches 710 million bushels (cca 36 litrů). Reserves of corn and other grains ease the impact on the economy and food supplies but there are important domestic and foreign effects of the loss. The epidemic illustrates the vulnerability of our food crops to pests. Přenos patogena na rostlinu •Patogenní mikroorganismus se dostane do styku s rostlinou buď v rhizosféře nebo častěji fylosféře • •Většina houbových patogenů se šíří vzduchem– kontakt s listy nebo stonkem/kmenem • •Viroví patogeni přenášeni především hmyzem – tedy také fylosféra • •Půdní fauna (nematody) také přenáší choroby • •Pohybliví bakteriální (Pseudomonas) a houboví (Oidium) patogeni přítomní v půdě také vstupují kořeny (chemotaxe) • •Přichycení houbových spor přenášených větrem - konidiospóry askomycety Magnaporthe grisea (zničí tolik rýže, co by stačilo k obživě 60 mil. lidí) •přichytí k hydrofobním povrchům jako je listová kutikula pomocí slizu ve vrcholu spory; •vlhký vzduch nebo rosa způsobí bobtnání slizu, vrchol spory praskne a přilepí sporu ke kutikule • • konidiospory Botrytis cinerea ve dvou fázích: • hydratovaná ale neklíčící konidiospora se přichytí povrchu listů slabými hydrofobními interakcemi •hydrofobnost povrchu podporuje toto počáteční uchycení (surfaktanty jej silně inhibovaly) •za několik hodin konidiospory začnou klíčit a je vylučována látka (glukóza, galaktózamin, proteiny) přilnavá k hydrofobním i hydrofilním povrchům (odolává i silných chemickým činidlům) • Další možnosti vstupu patogenů • poraněními •přirozenými otvory – stomata – jak rozeznají otvor? Uromyces appendiculatus (rez na fazolích) • používá topografický signál – 0,5 μm vysoký hřeben buněk stomatu - když vymodelován z polystyrenu – dojde k morfologické diferenciaci a vytvoří se appresoria (ploché hyfy) nezbytné k proniknutí do stomatu •Pokud hřeben nižší než 0.25 μm nebo vyšší než 1 μ m, k diferenciaci nedojde. •Mnohé viry vstupují ranami způsobenými hmyzem přenášejícím tyto viry •Některé vstupují kořeny s vodou •Někteří patogeni jsou schopni překonat kutikulu bez cizí pomoci •Kutikula a další tkáně jsou často atakovány enzymaticky, změkčeny (padlí – Erysiphe sp.; Botrytis cinerea – plíseň šedá, nebo také ušlechtilá plíseň na vinné révě; Fusarium solani – suchá hniloba hlíz). •Po vstupu do hostitele naruší normální funkci rostlin produkcí degradativních enzymů, toxinů a růstových regulátorů •Půdní patogeni produkují pektinázy, celulázy, hemicelulázy jejichž výsledkem jsou hniloby a jiné poranění •Destrukce rostlinných růstových regulátorů má za následek trpasličí formy rostlin, produkce IAA, giberelinů a cytokininů, tvorbu nádorů (puchýřů) a nadměrný růst stonků do délky Cell wall-associated structures commonly observed at sites of interaction with powdery mildews and other fungal pathogens. (A) A fungal penetration attempt halted by deposition of a cell wall apposition (blue). Inset image illustrates a top-down view of the penetration site as typically visualized by light microscopy. (B) A successful penetration event in which the fungus has formed a haustorial feeding structure. The cell wall apposition materials form a neck-band or collar around the neck of the haustorium. (C) A haustorium partially surrounded by a haustorial encasement. Encasements contain materials similar to those found in cell wall appositions. (D) A fully encased haustorium. CW, cell wall; PM, plasma membrane; C, conidiospore; PGT, primary germ tube (note that not all powdery mildew species develop PGTs); AGT, appressorial germ tube; PP, penetration peg; H, haustorium; EHM, extra-haustorial membrane; NB, haustorial neck-band; P, papilla (e.g., cell wall apposition); E, haustorial encasement. http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2012.00085/full •Produkce toxinů narušuje metabolismus rostliny •Někdy jde o nízkomolekulární cyklické peptidy a lineární polyketoly – narušují mitochondrie a buněčné membrány – umožní šíření infekce •Rezistence bývá založena na modifikaci receptoru •Rostliny vykazují různé morfologické nebo metabolické abnormality • Častá reakce na mikrobiální atak je tvorba papillae Tvorba papillae Drosanthemum floribundum DĚKUJI ZA POZORNOST