BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskop doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky: • konstrukce a princip fluorescenčního mikroskopu • objektivy • zdroje světla • filtry BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Otto Heímstaedta Heinrich Lehmann (1911-1913) • sestrojili první fluorescenční mikroskop s UV excitací • autofluorescence bakterií, protozoí, rostlinných a živočišných buně • organické makromolekuly - albumin, elastin, keratin Stanislav von Prowazek (1914) • pozorování ve fluorescenčním mikroskopu vazbu fluoroforů na živé buňky odhalení původce tyfu -Ricketsia prowazekii BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Fluorescenční mikroskop • je mikroskopem světelným • lze pozorovat i v procházejícím „bílém" světle Základní princip fluorescenční mikroskopie Principle of Excitation and Emission BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Transmisní fluorescenční mikroskop (Transmition light fluorescence microscope) Optical Path of The Transmitted Light Fluorescence Microscope n Eyepiece □ Barrier filter 0 UV protective shade n Objective EJ Widefield darkfield condenser UV protective tube Q Exciting inter □ Shutter □ Heat absorbing inter ■ Collector H Super high pressure mercury lamp Pre-centered tungsten bulb BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Transmisní fluorescenční mikroskop • výhodnější použití kondenzoru pro temné pole • excitační světlo nemíří do objektivu • oddělené filtry Epifluorescenční mikroskop (Reflected light fluorescence microscope) kostra zdroj bílého světla kondenzor stolek objektivy tubus okuláry ovládací prvky: makro+mikrošroub ovládání světla filtry, clony... ILUMINÁTOR zdroj světla kostky clony, filtry Peltier-Cooled CCD Camera Eyepieces Vertical (Episcopic) ^ [Illuminator—; Filter Optical Block Turret Breathshield — (UV Shield) Objective Stage — Condenser Turret Field Lens Fluorescence Microscope Arc-Discharge Lamphouse Figure 1 Transmitted Light Filters Mercury (HBO) Lamp Microscope Lamp J—Intensity Control ^—Tungsten Halogen Lamphouse rs/> BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. > ■T- y. Invertovaný fluorescenční mikroskop • práce s vysokým vzorkem (kultivační nádoby) Fluorescenční nástavec (iluminátor) Fluorescence Vertical (Episcopic) Illuminator Removable Collector Field and Heat Lens Aperture Fitter System Diaphragms Filter Block Turret Turret Housing Field Lens iaht Rotable Shutter Polarizer Breathshield (UV Shield) Filter Cube (Optical Block) Excitation Neutral Balancer Density Filters Figure 4 Mercury (HBO) or Xenon (XBO) Arc-Discharge Lamphouse BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. > ■T- y. Kóhlerovo osvětlení pro odražené světlo (1893-4) • uspořádání optické soustavy pro ideální osvětlení • výsledek: světlo vyplní celý otvor objektivu a) maximální osvětlení zvýšení intenzity díky kolektorové čočce, zdroj světla blízko ohniska cocky b) stejnoměrné osvětlení filtry k redukci „hot-spots" (místa s nadměrnou intenzitou) nebo difuznífitr BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Osvětlení Köhler Illumination in Reflected Light Fluorescence CollectorJ Arc Lamp Lens Plasma Ball I / Field Control's Field Diameter Field ' Lens 0 » ■ • osvetlení je tvořeno 3 konjugovanými (stejně zaostřenými) rovinami A) rovinou zdroje světla B) rovinou aperturní clony fluorescenčního iluminátoru C) zadní ohniskovou rovinou objektivu • vypadává přítomnost kondenzoru osvětlení přichází z objektivu a je jím také odváděno intenzita a kontrast osvětlení jsou regulovány jen aperturní clonou Are Image at Condenser Apertuře Diaphragm Figure 5 Excitation Filter Condenser and Objective Specimen— Image Plane -Emission (Barrier) Filter Dichromatic — Mirror Objective "ear Focal Plane nemění se tím velikost osvětleného pole BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Zobrazení • zobrazení je tvořeno 3 konjugovanými rovinami A) rovinou polní clony B) rovinou zobrazovaného objektu C) střední rovinou obrazu • obraz zdroje světla je mimo rovinu zaostření -> stejnoměrné osvětlení • polní clona reguluje změnu velikosti osvětlení pole • nemění se tím intenzita osvětlení • nastavení co nejmenší, ale aby nebyla vidět (x photobleaching) Köhler Illumination in Reflected Light Fluorescence Field Diaphragm Controls Field Collector Diameter Field Arc Lamp Le.ns m ' Lens Plasma Ball II #i_xcitation Arc Image / pi|ter at Condenser / MKer Aperture / / Diaphragm / Condenser and Objective Figure 5 ^ Specimen— r Image \ Plane -Emission (Barrier) Filter Dichromatic — Mirror -Objective Rear Focal Plane BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. > ■J- .B Objektivy pro fluorescenční mikroskopii intenzita fluorescence (jas) • počet fotonů na jednotku plochy za čas • u FM snímajících odražené světlo (z preparátu), závisí na numerické apertuře objektivu (NA) a zvětšení (M) • Intenzita ~ NA4/M2 použití objektivů • plan-fluoritových a plan-apochromatických objektivů • NA =1,3-1,4 pro olejovou imerzi • musí propouštět UV a VIS světlo • sklo musí mít minimální autofluorescenci • antireflexní vrstvy BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Typy objektivů Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, červená a modrá je zaostřena stejně Apochromáty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů Axial Chromatic Aberration Blur = 0.30 mm L Single Lens ----- 450nm 550nm m w 650nm Blur = 0.01 mm Achromat Doublet Figure 1 Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci, ale i pro pozorování ve světlém poli BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. > Numerická apertura NA = n. sinu (NA = n. sin a/2) vzduch n - index lomu prostředí voda \jl - polovina tzv. otvorového úhlu imerzní olej (n = l) (n=1.33) (n = 1.51) (a) Figure 2 NA = (n)sln(p) (a) p = 7° NA = 0.12 (b) u = 20° NA = 0.34 (c) p = 60* NA = 0.87 imerzní olej krycí sklo podložní sklo Změna indexu lomu prostředí ^mbrs/> http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/iava/microscopv/immersion/index.html BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Rozlišovací schopnost nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě vnímáme jako oddělené R=X/2NA NA = n. sinu OBJECTIVE TYPE Plan Achromat Plan Fluorite Plan Apochromat Magnification N.A Resolution (Mm) N.A Resolution (pm) N.A Resolution (um) 4x 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375 10x 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61 20x 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37 40x 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29 60x 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29 100x 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20 N.A. = Numerical Aperture pro 550nm - zelená BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop Visible Light Spectrum **— Ultraviolet Infrared — __i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—t—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—A— 400 500 600 700 Figure 1 Wavelength (Nanometers) Wavelength Range (nanometers) Perceived Color 340-400 Near Ultraviolet {UV; Invisible) 400-430 Violet 430-500 Blue 500-570 Green 570-620 Yellow to Orange 620-670 Bright Red 670-750 Dark Red Over 750 Near Infrared (IR; Invisible) BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Zdroje světla pro světelný mikroskop žárovky - el. proud rozžhaví vlákno wolframová žárovka • 300-1400nm • W vlákno ve vakuu nebo inertní atmosféře (Kr, Xe) • na světlo se spotřebuje 5-10% energie (zbytek na teplo) • vysoká teplota vlákna (až 2500°C při 100W) • s časem klesá intenzita světla, černání Tungsten Halogen Lamphouse Ventilation wolframovo-halogenové žárovky • v ochranné atmosféře přítomnost jódu nebo bromu • vlákno má delší životnost Figuře 1 Lamphouse (d) (e) BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. To Microscope Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop výbojky • naplněná plynem pod vysokým tlakem (xenon, páry rtuti) • obsahuje elektrody • světlo vzniká ionizací plynu mezi elektrodami • 10x-100x jasnější než žárovky připOJenO POČítad IO hodin Fluorescence Microscope Arc-Discharge Lamp Housing Ventilation Rtuťová výbojka (HBO) • obsahuje rtuťové páry • neposkytuje souvislé spektrum • emituje v několika úzkých pásmech • UV, fialová, modrá, zelená, žlutá, oran • životnost 200-400h >va Xenónová výbojka (XBO) • obsahuje xenón • stejná intenzita ve viditelném spektru • v UV nízká emise • v IR vysoká emise -> přehřívání • životnost 400-1200h Xenon Arc Lamp Emission Spectrum 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Wavelength (Nanometers) BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop LASER -Light Amplification by the Stimulated Emission of Radiation • emituje paprsek světla o určité vlnové délce (nebo několika délek) • světlo je koherentní - má stejnou frekvenci, směr kmitání, fázi • vlnová délka je specifická v závislosti na typu kostrukce a materiálu Common Laser System Configurations Konstrukce laseru: 1. aktivní prostředí v rezonátoru (různé skupenství - pevné, plyn, kapalina, plazma) 2. zdroj záření (elektrický proud, výbojka, chemické reakce..) 3. odrazné zrcadlo 4. polopropustné zrcadlo 5. laserový paprsek BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Princip laseru zdroj energie vybudí elektrony aktivního prostředí ze základní energetické hladiny do vyšší energetické hladiny -> excitace postupná excitace většiny elektronů aktivního prostředí Spontaneous Emission or Decay při přestupu elektronu na nižší hladinu dojde k emisi fotonů fotony interagují s dalšími excitovanými elektrony, spouštějí stimulovanou emisi fotonů ffljiffij1 emitované fotony mají stejnou frekvenci a fázi Spontaneous and Stimulated Processes Before After t r Upper Level Lower Level Photon Upper. Level Lower Level One Photon (a) Two Photons MA* (b) mezi zrcadly (v rezonátoru) dochází k odrazu paprsku fotonů a jeho opětovnému průchodu prostředím -> zesilování toku fotonů paprsek opouští tělo laseru průchodem skrze polopropustné zrcadlo <3 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. > Stimulovaná emise Stimulated Emission in a Mirrored Laser Cavity ř> Emi! :' Emission Li Output-Mirror HÉfe —Reflected Hü „Emission, . » * »* »y Total —Reflection Mirror • 9n Light Escaping Cavity / Equilibrium State Figure 1 http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/iava/lasers/heliumneonlaser/index.html BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Nejčastěji používané lasery využití - konfokální mikroskopie Kryptonový laser emituje v UV i VIS (647 nm) Argonový laser emituje v UV i VIS (488 a 514 nm) He-Ne, He-Cd ... Argon Ion Lasei Coolant Return Magnet _ Amy Electrode Brewster Window Mirror Output Lens Brewster Window Cathode Assembly Segments Cup Bore Copper Cue Laser Illumination Source Emission Spectra EL - a o i > CK Krypton Emission Spectrum IN « «9 w> "" II? || <0 -J W 0 _ 1 O cr> CO * Argon Emission Spectrum ■* r><~> r> to _ to ■ wo I i eo Figure 5 300 400 500 600 700 Wavelength (Nanometers) 800 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Output Wavelengths of Common Lasers Laser Type Wavelength(s) (Spectral Region) (Nanometers) Argon Fluoride Excimer (UV) 193 Krypton Chloride Excimer (UV) 222 Krypton Fluoride Excimer (UV) 248 Xenon Chloride Excimer (UV) 308 Xenon Fluoride Excimer (UV) 351 Helium Cadmium (UV. Visible) 325. 442 Mitrr.no n /I IVA Krypton (Visible) 476. 528. 568. 647 Argon (Visible) 488.514 Copper Vapor (Visible) 510.578 Md:YAG Frequency Doubled (Visible) 532 Helium Neon (Visible. Near IR) 543.594.612. 633, 1150.3390 Gold Vapor (Visible) 628 Rhodamine 6G Dye (Visible. Tunable) 570-650 Ruby (Visible) 694 Diode Semiconductor (Visible. Near IR) 630-1600 Ti:Sapphire (Visible - Near IR) 680-1130 t Jd: vAG (Near IR) 1064 Erbium (Near IR) 1540 Hydrogen Fluoride {Near IR) 2600-3000 Carbon Dioxide (Far IR) 9600.10600 Další užívané lasery ve fluorescenční mikroskopii Laser vs. fluorochrom http://olympus.magnet.fsu .edu/primer/java/excitatio nefficiency/index.html BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Filtry ve fluorescenční mikroskopii SUN LIG EXCITATION FILTFR «. 400 nm Figure 1.6. Experimental schemalic for detection of the Stokes shift. excitační filtr - propouští takové světlo, které je schopno vyvolat excitaci s následnou emisí u daného fluoroforu emisní (bariérový ) filtr - propouští světlo, které je emitováno fluoroforem BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. FM obsahuje 3 typy filtrů v optické dráze uloženy v bloku (kostce) - důležitá orientace • excitační filtr • emisní filtr • dichromatické (dichroické) zrcátko (beamsplitter) Fluorescence Emission Fluorescence Filter Spectral Profiles Fluorescence Filters 100 Barrier (Emission) Filter Threaded Retaining Ring Dichromatic -(Beamsplitter) Mirror -Incoming Light Waves Figure 2 Optical Block (Filter Cube) Excitation Filter 300 400 500 600 Wavelength (Nanometers) 700 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Funkce dichromatického zrcátka • u mikroskopů s odrazem fluorescence • odráží excitační záření • propouští emisní záření • sklon 45° k excitačnímu i emisnímu filtru Dichromatic Mirror Function in Reflected Light Fluorescence Illumination Emission Emission Illumination Illumination Emission BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. rozdělení filtrů dle šířky propouštěného spektra • short pass - propouští kratší vlnové délky než je určitá hodnota • long pass - propouští delší vlnové délky než je určitá hodnota • wide band pass - omezen z obou stran spektra • narrow band pass - omezen na úzké rozmezí vlnové délky Short Pass Filter Long Pass Filter Dichromatic Beam Splitter 100- s to is (A c e I Block Reflect P.1SS UV (a) IR UV (b) IR uv (c) Narrow Band Pass Filter s**n Pas* and Long Pass Filter Combination SP-LP Wide Band Pass Filter 100 t is (A I Block Block Pass -^Ě \ i M \ IL UV (a) IR UV BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. 89 Zá kladní typy kostek - Olympus Excitation Ctil>e Excittltion FBtei(nm) Dielu oic Mil loi (nm) e: ■.....■ i Filtei U U-MWU 330-385 400 420- U U-MNU 360-370 400 420- U UMNUBP 360-370 400 420-460 v U-MNV 400-410 455 455- BV U-MWBV 400-440 455 475-- BV U-MNBV 420-440 455 475-- B U-MWB 450-480 500 515-- IB U-MWIB 460-490 505 515ff- IB U-MNIB 470-490 505 515IF - IB U-MNIBBP 470-490 505 515-550 B U-MWIBBP 460-490 505 515-550 G U-MSWG 480-550 570 590- G U-MWG 510-550 570 590- G U-MNG 530-550 570 590- IG 11 r i r j i -. 520-550 565 580IF-- tf U MWJY 545-580 600 61»-- Filter Color Codes Code Filter Type U UltMrviolet V Violet BV Blue-Violet B Blue IB Inteifeieiice Blue Filtei G Green IG In hi ii in- Gold St.imitKj Method BF Biiylrtfield, Mi.r.t- COIltl.lSt. and DIC only BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Kombinace excitačního a emisního filtru http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/optica paths/index.html Kombinace fluoroforu s blokem OLYMPUS http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/matchi ngfilters/index.html NIKON http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralprofiles/ind ex.html ^ms/^ BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Filtry pro vícenásobné značení • double band • triple band for DAPI/FITC/TRITC U-DM-DA/FI/TR2*3 100.0 375.0400.0 500.0 600.0 700.0 Wavelength (nm) Excitation filter Emission filter Dichromatic mirror BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Excitační balancer • při použití vícepásmových kostek • změna intenzity excitačních vlnových délek • dvojice short pass a long pass filtrů Excitation Illumination Balancer Filter Configuration and Spectral Profiles 100 LP Filter 300 400 500 600 Wavelength (Nanometers) - 60 100 z o a 80 ft ■ a. 40 o 20 o -i o T> IT O -1 0 > 1 o ■o o ■=, 700 Thin-Film Rectangular Interference Filter Excitation Balancer 3 UV-Absorbing Fluorophore (DAPI) Blue-Absorbing Fluorophore (FlfC) Green-Absorbing Fluorophore (Texas Red) Figuře 1 http://www.microscopvu.com/tutorials/java/fluorescence/excitationbalancer BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3. Filtry a zdroje světla pro fluorescenční mikroskopii http://mediajnvitrogenxom.edgesuite.net/tutorials/3L So urces Filters/player.html BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 02 / 14.3.