BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Principy a postupy imunofluorescenčního značení buněk doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky: • imunocytochemie • typy protilátek a jejich výroba • postup imunofluorescenčního barvení BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury - sondy DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána... mitochondríální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, annexin V, phalloidin.. BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Imunocytochemie (ICC) • soubor metod, které umožňují detekci antigénu v tkáni nebo buňce [in situ) • pomocí značených protilátek Albert Hewett Coons, M.D. (1912- 1978) • zakladatel imunofluorescence ♦ použití fluorochromem značené protilátky Coons, A. H., Creech, H.J. and Jones, R. N. (1941). 'Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.' Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.), 47, 200. LOCALIZATION OF ANTIGEN IN TISSUE CELLS II. Improvements in a Method for the Detection of Antigen by Means of Fluorescent Antibody*- $ By ALBERT H. COONS, M.D., and MELVIN H. KAPLAN$ {From the Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, Boston) (Received for publication, August 6, 1949) BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. > Protilátky • patří do skupiny imunoglobulinů • třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM (u savců) • složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L) • H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig -> podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí) • L řetězce: lambda nebo kapa - různě, v závislosti na typu Ig • H a L - spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární struktuře, udržuje stabilitu Ig • nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Name Heavy Chain IgA 1,2 a IgD IgE IgG 1,2,3,4 Y IgM Description Found in mucosal areas, such as the gut, respiratory tract and urogenital tract, where it prevents colonization by pathogens. Also found in saliva, tears, and breast milk. Functions mainly as an antigen receptor on B cells that have not been exposed to antigens. It has also been shown to activate basophils and mast cells to produce antimicrobial factors. Binds to allergens and triggers histamine release from mast cells and basophils, and is involved in allergy. Also protects against parasitic worms. In its four forms, provides the majority of antibody-based immunity against invading pathogens. The only antibody capable of crossing the placenta to give passive immunity to the fetus. Expressed on the surface of B cells as a monomer, and in a secreted form as a pentamer with very high avidity. Eliminates pathogens in the early stages of B cell mediated (humoral) immunity before there is sufficient IgG. Antibody Complexes Monomer: IgD, IgE, IgG Pentamer: IgM BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Antibody Human and Mouse Human Mouse lgG Light Subtype Heavy Light Subtype Heavy Chain Chain Chain Chain k or A IgGi Y1 k or A IgGi yi K or A lgG2 Y2 k or A lgG2a Y2a KOrA lgG3 Y3 KorA lgG2b Y2b k or A lgG4 Y4 k or A lgG3 Y3 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. IgG obecný vzorec: gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2 průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa domény - variabilní (V) a konstantní (C), velikost 80-120AA na N-koncích : L řetězec: lx VL doména H řetězec: lx VH doména na C-koncích : L řetězec: lx CL doména H řetězec: 3x - CH1, CH2, CH3 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. VL a VH tvoří vazebné místo antigenu, v této části hypervariabilní oblasti - tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže (0,2 - 0,3 nm) Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má jiný idiotyp Struktura - odvozena od enzymatického štěpení papain- štěpí v pantové oblasti H řetězce vznik: > 2x monovaletních Fab (Fragment antigen binding) > lx Fc (Fragment crystallizable) pepsin - štěpí v C-koncové oblasti H řetězce vznik: > lx bivalentní F(ab')2 > zbytek Fc fragmentu je degradován BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. > IgM • pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po 180kDa obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5 • struktura spojena řetězcem „J" (15kDa) • stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik lOx Fab a Fc; 5x F(ab)2 Fc - cyklický pentamer (340kDa) Imunitní odpověď • imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a extravaskulárním prostorem • zachytávání antigénu v uzlinách • latentní (indukční) fáze - asi týden • první tvorba IgM - primární odpověď později nebo po další imunizaci (booster)- převážně tvorba IgG -sekundární odpověď • různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny Pnm&ry Boster Vaccinaton £,ose Polyklonální protilátky pro ICC • produkce různými klony B- lymfocytů • reakce s různými epitopy daného antigénu • nejčastější producent - králík (New Zeeland White rabbit), koza, prase, ovce... RAISING ANTIBODIES IN ANIMALS Antibodies can be made in the laboratory by injecting an animal (usually a mouse, rabbit, sheep, or goat) with antigen A. =y*--t^^-^ ^—-tC^í ' <3>j\ ($=( ®\ inject antigen a take blood later Repeated injections of the same antigen at intervals of several weeks stimulates specific B cells to secrete large amounts of anti-A antibodies into the bloodstream. ■a 1111 - • navržení a syntéza peptidu l!am • ověření čistoty hmotnostní spektrometrií T a chromatografií • coupling - vazba s KLH glykoproteinem • KLH - Keyhole limpet hemocyanin • měkkýš (Megothura crenulata) • produkce vysoce imunogenního glykoproteinu KLH • dodá imunogenitu i peptidu Příprava polyklonálních protilátek • imunizace - kontrola specificity vůči antigenu • získání séra Nom ▼ Date ^ Description 1 03.12.2009 Peptide ordered 2 28.12.2009 Peptide ready 3 05.01.2010 Peptide coupling via C-terminal cysteine 4 08.01.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 1st injection 5 29.01.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 2nd injection 6 05.02.2010 Rabbit sera after second injection of antigen 7 09.02.2010 Testing of the sera after 2nd injection of antigen using dotblot 8 01.03.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 3rd injection 9 08.03.2010 Rabbit sera after third injection of antigen 10 11.03.2010 Testing of the sera after 3rd injection of antigen using dotblot 11 01.04.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 4th injection 12 08.04.2010 Final bleed after fourth injection of antigen BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Příprava polyklonálních protilátek imunizace Immunisation protocol 1) First injection - day 1: subcutaneous injection of 100 - 500 ug of purified protein or peptide coupled to KLH (in complete Freuiid's adjuvans). 2) Second injection - day 15: subcutaneous injection of 100 - 5(X) ug of purified protein or peptide coupled to KLH (in incomplete Freuiid's adjuvans). 3) Test sera - day 20: 5 nils of test sera 4) Third injection - day 46: subcutaneous injection of 100 - 500 ug of purified protein or peptide coupled to KLH (in incomplete Freuiid's adjuvans). 5) Test sera or final bleed - day 54: cither 5 nils of the test sera or 50 - SOmls of the final sera. 6) Fourth injection - day 76: subcutaneous injection of 100 - 500 ug of purified protein or peptide coupled to KLH (in incomplete Freuiid's adjuvans). 7) Final sera collection - day 84. 50 - SOmls of the final sera. BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. ^Xna^ Ověřování afinity protilátky k antigénu metoda: dot-blot 1) na membránu nanesen antigén 2) kapka různě ředěné protilátky 3) detekce anti-králičí protilátkou konjugovanou s chromogenem BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Monoklonální protilátky pro • produkovány pouze jedním klonem B-lymfocytů • všechny molekuly imunoglobulinu jsou totožné reagují pouze s jedním specifickým epitopem na antigénu • nejčastěji myší • příprava pomocí hybridomů: fůze B-lymfocytu a myelomové b. ICC tumor cell from cell culture divides indefinitely but does not make antibody B cell from animal injected with antigen A makes anti-A antibody but does not divide forever I FUSE ANTIBODY-SECRETING B CELL WITH TUMOR CELL I hybrid cell makes anti-A antibody and divides indefinitely lRS/> BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. > ■j- Tvorba monoklonalních protilátek http://sites.sinauer.com/cooper7e/ani mation0413.html mouse immunized with antigen X cell making q^b anti-X antibody —^o* B lymphocytes (will die after a few days in culture) mutant cell line derived from a tumor of B lymphocytes A T (cells will grow indefinitely in normal medium, but will die in selective medium) FUSION I products plated in multiple wells secreted | / anti-X antibody P&8o°o I I I only hybridomas grow on the selective medium I 1 ' test supernatant for anti-X antibcdy and clone cells from positive well at -1 cell per well \ \ I \ I 1 1 \ \ \ • o • o • o o o o allow cells to multiply, then test supernatant for anti-X antibodies; positive clones provide a continuing source of anti-X antibody BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. > x První monoklonální protilátka (1975) myší monoklonální protilátka - klon Spi (IgM) proti SRBC (sheep red blood celis) fůze myších buněk z myelomu a sleziny Nature Vol 256 August 7 1975 Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity M RC Lalwratory of Molecular Biology, H ills Road, Cambridge CB2 2QHt UK G. KOHLER C. MlLSTElN Myeloma cells (10T P3-X67A g8) were fused to 10B spleen cells from an immunised BALB/c mouse. Mice were immunised by intraperitoneal injection of 0.2 ml packed SRBC diluted 1:10, boosted after 1 month and the spleens collected 4 d later. After fusion, cells (Sp-I) were grown for 8 d in HAT medium, changed at 1-3 d intervals. Cells were then grown in Dulbccco modified Eagle's medium, supplemented for 2 weeks with hypoxanthineand thymidine. Forty days after fusion the presence of anti-SRBC activity was revealed as shown in a. The ratio of plaque forming cells/total number of hybrid cells was 1/30. BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Konjugace protilátky s fluorochromem vazba přes aminoskupinu, vznik amidu BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Konjugace protilátky s fluorochromem • vazba přes thíolovou skupinu (-SH) • nutné v redukujícím prostředí - porušení disulfidických vazeb • vyšší senzitivita konjugátu - specifičtější místo značení Přímá vs. nepřímá imunofluorescence • přímá imunofluorescence- původní metoda (1942) • přímá vazba protilátky s fluorochromem na antigén • rychlá, méně univerzální, nižší intenzita signálu • využití pro flow-cytometrii fluorochrom epitop antigénu imunoglobulin BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Přímá imunofluorescence a) značená protilátka od dodavatele b) vlastní označení zvolené protilátky vybraným fluorochromem Lightning Link-Rapid prepare and add the add the quench label modified antibody solution 00.00 29 sees 15 minutes Isec labeled antibody eady to use h minutes < 20 minutes Innova Biosciences, Lightning-Link® mm BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. > ■j- ^na^ Nepřímá imunofluorescence - " A dvoukroková 1) primární protilátka x antigénu 2) sekundární značená protilátka x primární protilátce antibody Secondary antibody Epitope • univerzální, více primárních protilátek z jednoho organismu lze kombinovat s jednou sekundární protilátkou • vyšší citlivost - na I. Ab více rozeznatelných epitopů, více navázaných molekul II. Ab BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení buněčných kultur 1) fixace 2) permeabilizace 3) blokování nespecifických vazeb 4) inkubace s protilátkou / protilátkami 5) counterstaining (detekce DNA) 6) montování BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení tkáňových řezů 1) parafínové řezy (±4 u.m) na podložním skle 2) deparafinizace - xylen 3) rehydratace - sestupná alkoholová řada 4) reaktivace antigénu (antigén retrieval) v tlakové komoře při vyšší teplotě (97°C) 5) blokování nespecifických vazeb 6) inkubace s protilátkou/-ami (chromogen - platí jen pro IHC) 5) counterstaining 6) montování BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Fixativa požadavky • rychle proniká do buňky/tkáně • fixuje b. struktury a zabraňuje reakci buňky a tím vzniku strukturálních artefaktů • zamezí ztrátě rozpustných proteinů • nesmí vykazovat autofluorescenci • rozdíly v závislosti na detekované struktuře • chemická fixativa • mrazová substituce • mikrovlnná fixace BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Chemická fixativa koagulační chemická fixativa • MetOH - nejčastěji/-20°C, bez permeabilizace • EtOH • aceton výhody • rychlá fixace, díky dehydrataci • proteiny jsou koagulovány nebo extrahovány • zachovává rozpoznání antigénu nevýhody • výrazné smrštění vzorku (až o 50%) • zkreslení morfologie a velikosti BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Crosslinkující chemická fixativa vytváří metylenové vazby -CH2- (crosslinks) mezi různými skupinami makromolekul o • formaldehyd h"^h • glutaraldehyd.. 0- H I HO-FC-OfH I .H 8-100 nejčastěji paraformaldehyd (4% PFA) • reaktivní skupiny: amidová, guanidinová, thiolová, fenolová, imidazolová a indolylová • crosslinky i v nukleových kyselinách (ne však v lipidech) • pomalejší vytváření crosslinků, ale rychlejší průnik do buňky (než glutaraldehyd) • toxický, potenciální karcinogén BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Permeabilizace • použití v závislosti na umístění detekované molekuly • na externí straně pl. membrány - netřeba • po fixaci aldehydy, nutnost permeabilizovat membránu, aby mohly být detekovány intracelulární molekuly Blokování nespecifických vazeb nutnost vyvázání: • nespecifických vazebných míst, na která by mohla nasednout protilátka nevymytého fixativa polárních nebo velmi hydrofobních struktur zvyšuje specificitu protilátky snižuje signál z pozadí nejčastěji používané: bovinní sérový albumin (BSA): 1-10%, sérum (ze stejného zvířete jako II. Ab, nebo jiné než I. a II. Ab) želatina BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Prima a nepnma imunofluorescence Treatment with labeled antibody 1 Antigen Present Antigen Absent \ : n n And gen Present Art gen Absent _ Iftatment with iinlabplled primary antibody \ U n b 0 U fl4 ,>M i ti 11 lI y vf.i Tin-il. i w.iy •v T reatment with unla be I ltd i p rondary anti b □ dy uv Light Unbnund .inrihndy waited .lway UV Light ../Jr. - i lijui.....i ij- Ihm-i I where -n i ■ ii I du ted Unbound «rondary antibody h ed away uvught H u □ r p s < p n ce □ b ived wh p rrvei antl fen i i lotd tp d BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. 'S! Dvojité značení nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch?v=OH2GFeaGV6w Celkový postup nepřímá imunofluorescence http://www.youtu be.com/watch ?v=pte06FRWo3g BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Negativní kontrola • nutné pro vyloučenífalešných výsledků • vícenásobné značení - kontroly pro jednotlivé fluorochromy • použití isotypové kontroly - stejný typ protilátky s fluorochromem bez specificity • použití neznačených buněk - vyloučení autofluorescence Pozitivní kontrola • detekce „ověřeného" proteinu (tubulin, aktin) • linie s ověřenou expresí daného proteinu • transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu Montování = uzavírání • uchování preparátu na delší dobu • bez přístupu vzduchu • v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence • mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.) tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média • na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) - tuhne • na bázi glycerolu (např. Vectashield) - potřeba zarámovat sklo -gel, parafín, lak na nehty.. > BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. ^Xna^ Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení- 1. část Cefc are harvested by wntntugation Cel petel is resupsended ri 1 i PBS -> Cells are adieredlo pofy L lysino slides SMes incubated with sofcjtiori ol neutral prolan to block surface ol the side <:- LkxXing prolan Celit are fiied and cell meiribrane permeac-dJsed <;- Nucleoli! Mitochondria or other Other proteins '$\ jJjcdM^role^r^^^^ Micropores csi&ed by permeaWiialicn Slides are incubaled with pnmaiy anlibody solution which recognizes prolan ol uteres! BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení - 2. část SMecvencubatedmli pi t .v, .in t p -i, NM H A?- yti nnvBM pni n eft ■ Im Mfli m Btockng protein washed to remove unspw*caly bound pnmary <7 V Other protant :•..■« r 4 [M'c n Secondary antbody T Agan slides are washed to remove unspeahcarfy bound secondary -> K o; P'cltrin or infĽ-ehl OttierpfoMni Block ngpejtMl Prmary anitody t DNrV» turned with DAPI (or other DNA Stan) SUM are mounted, covered wti covertftp and <- sealed BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin.. Phalloidin • mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek • Amanita phailoides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %) • inhibice depolymerizace aktinových filament Annexin V + fluorochrom detekce fosfatidylserinu („eat me" signál) v apoptóze Phosphatidylserine "Flip' 1 ApoptOSiS Annexin V Conjugates BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3. Interaktivní materiály *http://www.proteinatlas.org/ »http://www.abcam.com/ 'http://www.cellsignal.com/index.jsp 'http://www.agilent.com/en/dako-products 'http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html 'https://www.scbt.com/scbt/home/ 'http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html 'http://www.protilatky.cz/ BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2018 - 03 / 28.3.