Predikce sekundárních struktur proteinů Struktura proteinů primární (sekvence) sekundární terciární kvartérní ADSQTSSNRAGEFSIPPNTDFRAIF FANAAEQQHIKLFIGDSQEPAAYHK LTTRDGPREATLNSGNGKIRFEVSV NGKPSATDARLAPINGKKSDGSPF TVNFGIVVSEDGHDSDYNDGIVVL QWPIG Aminokyseliny glycin alanin valin leucin izoleucin asparagovákys. asparagin glutamovákys. glutamin arginin lysin histidin fenylalanin serin threonin tyrozin tryptofan methionin cystein prolin selenocystein Gly Ala Val Leu Ile Asp Asn Glu Gln Arg Lys His Phe Ser Thr Tyr Trp Met Cys Pro Sec G A V L I D N E Q R K H F S T Y W M C P U Třídění aminokyselin Aminokyseliny s podobnými vlastnostmi mohou plnit v proteinu stejné funkce – bývají vzájemně zastupitelné O NH2 CH3 CH3 OH O NH2 CH3 CH3 OH Isoleucine Leucine Hemoglobin S - vliv jediné substituce HbS (Glu6Val) – deoxyHb je 50x méně rozpustný než oxyHb à dlouhé asociované řetězce Kostra polypeptidového řetězce Peptidová vazba – planární – Konformaci kostry určují dva torzní úhly φ a ψ (úhel ω je 180°) Ramachandranův diagram a) Colored areas show sterically allowed combinations of the f and y angles. b) Observed values for all residue types except for glycine. Each point represents f and y values for an amino acid residue in a well-refined x-ray structure. c) Observed values for glycine Ramachandranův diagram Vazby zprostředkovávající vyšší struktury • Vodíková vazba (H-můstek) • Nabité AK • Kontakty polárních AK • Nepolární / hydrofobní AK • Stacking – aromatické AK • Cystein / cystin – vazba S-S • Vazba iontů kovů 2-D struktury • Stabilní konformace polypeptidového řetězce • Důležité pro udržení proteinové 3-D struktury • Cca 50 % aa residuí je součástí a-helixů nebo b-skládaných listů • Predikce sekundárních struktur znamená předpověď zda residuum spadá mezi H (helix), E (list) nebo C (smyčka) • Důležité pro klasifikaci proteinů • Separace domén a funkčních motivů • SS jsou mnohem konzervovanější než aminokyselinová sekvence • Předpověď SS předchází obvykle jako mezikrok při předpovědi terciární struktury při threadingových metodách. Predikce 2D struktury Predikce 2D struktury • Rozlišujeme tři základní typy – H – helix – E – β-list – C/(-) – smyčka/náhodné klubko (coil) – někdy jsou rozlišovány tyto dvě varianty • S dobrou přesností lze určit helix (jejich tvorba je je určena interakcemi „krátkého dosahu), u β -listu (interakce „dlouhého dosahu) úspěšnost určení 2D struktury klesá • Některé programy přidávají i číslo vyjadřující pravděpodobnost pro daný AK zbytek (např. H 60% znamená, že s 60% pravděpodobností se jedná o helix) α-helix stabilizace mezi rezidui i+4 a i-4 H-vazbami 5.4 Å Vzestup 1.5 Å per residuum Boční a horní pohled Jiné helixové struktury • 310 helix – obvykle na začátku nebo konci a-helixu • p-helix – zřídka, považován za málo stabilní • kolagen – levotočivá šroubovice 310 helix p-helix Porovnání 16 aa v typických helixech a-helix 310-helix p-helix Vodíkové můstky 0i k Ni+4 0i k Ni+3 0i k Ni+5 Počet residuí na otáčku 3.6 3 4.4 Počet atomů na otočku 13 10 16 Vinutí (na 1 aa) 1.5 2.0 1.15 β-list Antiparalelní β-list Paralelní β-list Výskyt b-listů v proteinech Pootočení b-listů v realitě Torze řetězce 0 - 30 na reziduum Otáčky (turns) • větší množství otáček (obrácení směru polypeptidového řetězce), různé počty AK b-otočky nejčastější H-vazby ob reziduum Coils – smyčky, neuspořádané klubko • Vše ostatní, co nespadá mezi a-helix, b-list či otočky 3D vizualizace 2D struktur Jednoduché motivy helix-otáčka-helix β –vlásenka (hairpin) Jednoduché motivy Řecký klíč (greek key) β-α–β motiv Motivy - Domény • Kombinací jednoduchých motivů jsou tvořeny supermotivy • Motivy vytvářejí proteinové domény • Dle zastoupení 2D struktur dělíme proteiny na: – α -proteiny – β-proteiny – α / β proteiny – kombinace β-α–β motivů – minoritní skupiny – oddělené domény tvořené jen α či jen β strukturami, domény bohaté na kovy,… Fold versus topology! β -struktury β –barel propeller blade • Greek key barel • Jelly roll barel • β -helix β -struktury α -proteiny/motivy • Globinový fold • Membránové proteiny • Strukturní proteiny – keratiny, cytoskelet,… – coiled-coil – čtyřhelixový svazek (Four-Helix Bundle) α -proteiny/motivy α / β motivy Centrální jádro tvořené β -listy obklopené α -helixy • TIM barrel • Rossmanův fold • Horseshoe fold – leucin-rich motivy Organizace proteinů – jedno- i vícedoménové proteiny myoglobin pyruvátkinasa Zinkový prst Výskyt: transkripční faktory Několik typů – Zn atom je vázán AK zbytky Cys a His Typické znaky α -helix Často je helix částečně exponovaný – tj. jedna strana je otočena dovnitř proteinu (hydrofobní), druhá ven (hydrofilní) Potom pro 3.6 helix (α-helix) platí, že i, i+3, i+4 & i+7 -té reziduum míří na tutéž stranu. Jsou-li všechna hydrofobní či naopak hydrofilní = zřejmě α -helix Typické znaky β -list U β -listu se střídají rezidua po 180 a pro částečně zanořený β -list platí analogicky: • i, i+2, i+4, i+8 –té reziduum je polární a zároveň • i+1, i+3, i+5 –té je nepolární Typické znaky β -list • Zcela zanořený β -list (typicky u α / β barelu) je tvořen řadou nepolárních AK Predikční algoritmy 1. generace: ab-initio, vychází z fyzikálněchemických vlastností a ze statistiky pro jednotlivá rezidua (Chou-Fasman, GOR (Garnier, Osguthorpe, Robson)) 2. generace: plus incorporation of more local residue interactions, zahrnuje i vliv nejbližších AK na zkoumané reziduum – předpověď max. 60% správnost, u β -listu do 40% Relative Amino acid Propensity Values for Secondary Structure Elements Used in the Chou-Fasman Methods Ri(SS) Rt (SS) S Ri S Rt Predikční algoritmy 1. generace: ab-initio, vycházela z fyzikálněchemických vlastností a ze statistiky pro jednotlivá rezidua (Chou-Fasman, GOR (Garnier, Osguthorpe, Robson)) 2. generace: plus incorporation of more local residue interactions, zahrnovala i vliv nejbližších AK na zkoumané reziduum – předpověď max. 60% správnost, u β -listu do 40% 3. generace: homology-base models, zahrnuje navíc multiple sequence alignment a využívá skutečnosti, že 2D struktura se zachovává déle než sekvenční podobnost – až 80% spolehlivost (závisí na metodě) 3. Generace - Homology-based methods Predikce sekundárních struktur pro každou sekvenci HHHCHCCEEEECCHH HHHHHCCEEEECCHH ECCHHCEEEECCCEE HHHHHCCCCEEECCH HHHHCCCEEEECHHC HHHHHCCEEEECCHH MSA fitování předpovězené sekundární struktury do AA přiložení Konečná předpověď Založená na konsensuální sekvenci 3. Generace – neuronové sítě Sekvence se známou sek. strukturou Trénink, přiřazování Váh jednotlivým funkcím Aplikace nalezených algoritmů na neznámou sekvenci Hydrophobic cluster analysis Programové balíky • AGADIR - An algorithm to predict the helical content of peptides • APSSP - Advanced Protein Secondary Structure Prediction Server • GOR - Garnier et al, 1996 • HNN - Hierarchical Neural Network method (Guermeur, 1997) • HTMSRAP - Helical TransMembrane Segment Rotational Angle Prediction • Jpred - A consensus method for protein secondary structure prediction at University of Dundee • JUFO - Protein secondary structure prediction from sequence (neural network) • nnPredict - University of California at San Francisco (UCSF) • Porter - University College Dublin • PredictProtein - PHDsec, PHDacc, PHDhtm, PHDtopology, PHDthreader, MaxHom, EvalSec from Columbia University • Prof - Cascaded Multiple Classifiers for Secondary Structure Prediction • PSA - BioMolecular Engineering Research Center (BMERC) / Boston • PSIpred - Various protein structure prediction methods at Brunel University • SOPMA - Geourjon and Deléage, 1995 • SSpro - Secondary structure prediction using bidirectional recurrent neural networks at University of California • DLP-SVM - Domain linker prediction using SVM at Tokyo University of Agriculture and Technology Predikce obsahu helixu ve struktuře – Agadir (http://www.embl-heidelberg.de/Services/serrano/ agadir/agadir-start.html) PSIpred APSSP Většina programů má uživatelsky jednoduché rozhraní Který program je však nejlepší??? SSpro8 (http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/ ) Nepoužívá pouze základní tři typy 2D struktury (helix, β-list a ostatní), ale využívá kompletní klasifikaci dle DSSP (Database of Secondary Structure Assignments) – tj. 8 typů struktury: • H: alpha-helix • G: 310-helix • I: π-helix (extremely rare) • E: extended strand • B: beta-bridge • T: turn • S: bend • C: the rest Výsledná přesnost cca 63% Rozšíření možností 2D predikce SSpro8 – ukázka výstupu Rozšíření možností 2D predikce Vedle předpovědi 2D struktury je rovněž analyzována – Přístupnost pro solvent – Předpověď transmembránového helixu • Určení zda je/není transmembránový • Podíl hydrofobních řetězců (AK zbytků) na povrchu – umožňuje postihnout i částečně zanořené membrány Rozšíření možností 2D predikce Predikce 3D struktury? Viz. Další přednáška: 3-D topologie proteinů, předpověď 3-D struktury, threading Benchmark – porovnání algoritmů Porovnání výsledků predikce se skutečně zjištěnou strukturou. Benchmark EVA (http://cubic.bioc.columbia.edu/eva/) – průběžné testování existujících serverů – testování 2D i 3D predikce Benchmark Dle benchmarku EVA v současnosti na předních místech: – PROFsec (http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein ) – PSIpred (http://insulin.brunel.ac.uk/psiform.html ) – SABLE (http://sable.cchmc.org/ ) Zopakování / shrnutí ▼ 2D struktura – vzájemné uspořádání AK jednotek proteinu (α-helix, β-list) ▼ 3D struktura – celkové rozmístění atomů proteinu v prostoru ▼ Strukturní motivy – na rozhraní mezi 2D a 3D, vznikají kombinací 2D struktur Zopakování / shrnutí ▼Řada programů využívajících rozdílné přístupy – použití závisí na vstupních datech a účelu ▼Neexistuje univerzální program – nejlepší je kombinace výsledků z více programů ▼Predikce 2D struktury je do značné míry spolehlivá – zejména pro proteiny s α-helix; vzrůstá při podobnosti s proteinem se známou strukturou