Vybrané biochemické metody


I. FLUORESCENCE


Postup:

1. Nastavení a kalibrace přístroje:    rychlost posunu (2nm)

                                                         citlivost fotonásobiče

                                                         napětí (korekce temného proudu)

2. 5 zkumavek:   jednotlivě 2 ml H[2]O, methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu

                            Do každé 20 mL 10 mM ANS (c=10^-5 mol.L^-1)

3.  měření



λ(nm)

F, AU

ε

Z

voda



                                                                                               80,4

                                                                                                 94

methanol



                                                                                               32,6

                                                                                               83,5

ethanol



                                                                                               24,3

                                                                                               79,5

propanol



                                                                                               20,1

                                                                                                 78

butanol



                                                                                               17,8

                                                                                                 77

dioxan



                                                                                                2,4



Permitivita, resp. energie absorpce CT-komplexu I^- - alkylpyridinium^+

Závislosti intenzity fluorescenčního záření na permitivitě prostředí:







Závislost intenzity fluorescenčního záření na parametru Z:





6 zkumavek – etanol dle tabulky, voda do 2 ml


 Etanol, ml - ca %

λ(nm)

F, AU

0                    0



0,4               20



0,8               40



1,2               60



1,6               80



2,0             100








Závislost fluorescence na koncentraci:


-5 zkumavek: roztok BSA 0,2% albuminu (s a bez ANS)

                                             zkumavka

                                              albumin

                                               voda

                                              bez ANS

                                               (AU)

                                            s ANS (AU)

                                             diference

                                               (AU)

                                           koncentrace %

                                               objem

                                                ml

                                               objem

                                                ml

                                                 1

0

0

2




                                                 2

0,01

0,1

1,9




                                                 3

0,02

0,2

1,8




                                                 4

0,05

0,5

1,5




                                                 5

0,1

1

1,0





-určení F[max][ ]z grafu (převrácená hodnota směrnice přímky):

1/c

1/F

                                                                                                 10

                                                                                             0,0135

                                                                                                  5

                                                                                             0,0357

                                                                                                  2

                                                                                             0,0052

                                                                                                  1

                                                                                             0,0036

F[max] = 1/0,0084 = 119




Koncentrční řada roztoku BSA s přídavkem ANS:

                                                                                                BSA

                                                                                                ANS

                                                                                                  F

                                                                                             c[ bx]

                                                                                                  ν

                                                                                     c[volny][ BSA]

                                                                                   ν/c[volny][ BSA]

                                                                                                 ml

                                                                                                 μl


                                                                                             mmol/l

                                                                                            mol/l/g

                                                                                             mmol/l


                                                                                                  2

                                                                                                  0

                                                                                               11,9

                                                                                                0,5

                                                                                              0,025

                                                                                                4,5

                                                                                               5,56


                                                                                                  2

                                                                                               12,5

                                                                                               0,53

                                                                                             0,0265

                                                                                               4,47

                                                                                               5,93


                                                                                                  3

                                                                                               24,5

                                                                                               1,03

                                                                                             0,0515

                                                                                               3,97

                                                                                              12,97


                                                                                                  5

                                                                                               33,8

                                                                                               1,42

                                                                                              0,071

                                                                                               3,58

                                                                                              19,83


                                                                                                 10

                                                                                               29,2

                                                                                               1,23

                                                                                             0,0615

                                                                                               3,77

                                                                                              16,31


                                                                                                 20

                                                                                                9,2

                                                                                               0,39

                                                                                             0,0195

                                                                                               4,62

                                                                                               4,11


                                                                                                 20

                                                                                                3,5

                                                                                               0,15

                                                                                             0,0075

                                                                                               4,85

                                                                                               1,55

c[ bx] je koncentrace jednotlivých přídavků ANS vypočítaná podle: F[max]=119..........c=5.10^-3

F[x][ ]........................c[bx]

ν vypočítáme jako podíl c[bx] a c[BSA]

c[volný][ BSA ]vypočítáme jako rozdíl celkové koncentrce ANS = 5.10^-3 a koncentrce vázaného ANS