Exprese a purifikaceExprese a purifikace
rekombinantnrekombinantníích proteinch proteinůů
Radka Dopitová
Rekombinantní proteinyRekombinantní proteiny
Rekombinantní DNA je arteficiální DNA sekvence, která vznikla
novou kombinací různých DNA sekvencí.
Rekombinantní proteiny jsou proteiny získané vnesením
rekombinantní DNA do heterologního hostitele (např.
mikroorganismus, kvasinky), ve kterém dojde k expresi genu.
Využití rekombinantních proteinůVyužití rekombinantních proteinů
Nadprodukce a purifikace rekombinantních proteinů jsou nezbytným
předpokladem pro:
• Biochemickou funkční charakteristiku proteinu (určení přesných
kinetických parametrů Km, kcat pro enzymy se substrátem, Ki pro enzymy s
inhibitorem, Kd pro protein - proteinové interakce či ligand -proteinové
interakce)
• Strukturní analýzu (NMR, krystalografie)
• Proteinové inženýrství (zlepšení vlastnosti proteinů – aktivita, stabilita)
• V průmyslovém měřítku jsou produkovány léky, vakcíny a potravinové
doplňky.
Cíl:Cíl: Vysoký výtěžek homogenního proteinu (mg – kg proteinu)
Zachování biologické aktivity
Proč vyrábět rekombinantní proteiny?Proč vyrábět rekombinantní proteiny?
• Obtížně se získavá (tkáně, orgány).
• Obtížně se kultivuje (bakterie, viry, tkáňové kultury).
• Limitovaná exprese
• Často obtížná purifikace proteinu
Přirozený zdroj:
Technologie rekombinantních proteinůTechnologie rekombinantních proteinů
Hostitelský organismus pro expresiHostitelský organismus pro expresi
rekombinantních proteinůrekombinantních proteinů
• Bakterie
• Kvasinky
• Rostliny
• Savčí buňky
• Hmyzí buňky s bakuloviry
• Transgenní živočichové
• Exprese proteinu in vitro
1. část: Exprese rekombinantních proteinů v E.coli
2. část: Purifikace rekombinantních proteinů
Obsah přednáškyObsah přednášky
Exprese proteinů fúzovaných s
GFP v E. coli
Purifikace proteinů fúzovaných s GFP
pomocí hydrofóbní matrice
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
VÝHODY :
• Vysoká produkce rekombinantních proteinů
• Dobře prostudovaný genom a proteom-usnadnění
genových manipulací
• Design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů
• Rychlý růst v poměrně levném médiu
• Přizpůsobivost systému
NEVÝHODY:
• Potřeba cDNA zkoumaného proteinu
• Absence eukaryotických posttranslačních systémů
(posttranslační modifikace)
• Tvorba nerozpustných inkluzních tělísek
• Omezená schopnost tvorby disulfidických vazeb
• Chybí sekreční mechanismus pro účinné uvolňování proteinu
do kultivačního média
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
Expresní systém pro produkciExpresní systém pro produkci
rekombinantních proteinů vrekombinantních proteinů v E.coliE.coli
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Expresní vektorExpresní vektor
= klonovací vektor, který obsahuje nezbytné regulační sekvence k
tomu, aby podporoval expresi inzertů cizích genů.
Klonovací místoKlonovací místo
Fúzní/purifikačníFúzní/purifikační
značky/kotvyznačky/kotvy
Gen pro rezistenciGen pro rezistenci
k antibiotiku (ampicilin)k antibiotiku (ampicilin)
Ribozom-vazebné místoRibozom-vazebné místo
Operátor -Operátor vazebné
místo pro represorvazebné místo pro represor
Transkripční
terminátor
Struktura vektoru proStruktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů vúčinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coliE.coli
promotorpromotor
Operátor -Operátor vazebné
místo pro represorvazebné místo pro represor
Struktura vektoru proStruktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů vúčinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coliE.coli
promotorpromotor
Vlastnosti promotorVlastnosti promotoru:u:
• Silný promotorSilný promotor (ptac, ptrp, lpL, pT7 )
- Protein zájmu by měl tvořit 10-30% a více z celkového bakteriálního
proteinu.
• Přenositelný do různých kmenůPřenositelný do různých kmenů E.coliE.coli
• Jednoduše a levně inducibilníJednoduše a levně inducibilní
- Teplotní indukce (lpL)
- Chemická indukce (ptac, ptrp, pT7): IPTG (isopropyl-b-D-
thiogalaktopyranozid)
• Vykazuje minimální hladinu bazální expreseVykazuje minimální hladinu bazální exprese
- Pokud jsou proteiny netoxické dosahuje se vysokých výtěžků proteinů
růstem buněk do vysokých hustot s následnou indukcí aktivity promotoru.
- U toxických proteinů pro je nutná minimalizace bazální transkripce před
přídavkem indukčního činidla pomocí vhodného represoru.
Ribozom-vazebné místoRibozom-vazebné místo
Transkripční
terminátor
Struktura vektoru proStruktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů vúčinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coliE.coli
Struktura vektoru proStruktura vektoru pro účinnou expresi rekombinantních proteinů vúčinnou expresi rekombinantních proteinů v E.coliE.coli
RibozomRibozom--vazebné místovazebné místo: zahrnuje Shine-Dalgarnova (SD) sekvenci a
translační iniciační kodon
Vzdálenost mezi SD sekvencí a iniciačním kodonem AUG je 4-13 nukleotidů,
tato vzdálenost ovlivňuje účinnost iniciace translace (optimální vzdálenost je
4-8 nukleotidů), oblast bohatá na AT páry.
Transkripční terminátorTranskripční terminátor T7 term, rrnT1,T2
(zabraňuje okluzi promotoru, zvyšuje stabilitu mRNA)
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Expresní systém pro produkciExpresní systém pro produkci
rekombinantních proteinů vrekombinantních proteinů v E.coliE.coli
Inducibilní exprese v hostitelském kmeni E. coli BL21(DE3)
Toxicita rekombinantního proteinu pro hostitelský kmenToxicita rekombinantního proteinu pro hostitelský kmen
• Není omezena na pouhý fakt, že je protein je pro buňku cizí, ale
může být způsobena i tím, že je nadprodukován určitý nativní gen.
Pro hostitele jsou smrtelné:Pro hostitele jsou smrtelné:
• Rekombinantní proteiny s hydrofóbními oblastmi mají toxický
účinek - asociují s membránou nebo se inkorporují do membránového
systému buňky (porušení membránového potenciálu).
• Proteiny, které inaktivují ribozomy.
Výběr hostitelského kmeneVýběr hostitelského kmene E.coliE.coli s ohledems ohledem
na toxicitu proteinu pro hostitelena toxicitu proteinu pro hostitele
BL21(DE3) firma Novagen
BL21(DE3)pLysS firma Novagen
Komerčně dostupné bakteriální kmeny s různými úrovněmi regulace
exprese, zajišťujícími minimalizaci bazální exprese.
• Nutná přísná regulace expresního systému
Různé úrovně minimalizace bazální expreseRůzné úrovně minimalizace bazální exprese
üBL21(DE3)BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
BL21
Cca 10 % hladina bazální exprese (před indukcí exprese) klonovaného
genu.
BL21(DE3)
üBL21(DE3)pLysS/EBL21(DE3)pLysS/E
BL21
Cca 1-3% hladina bazální (před indukcí exprese) exprese klonovaného
genu.
Různé úrovně minimalizace bazální expreseRůzné úrovně minimalizace bazální exprese
• Expresní kmen obsahující plazmidy pLysS nebo pLysE umožňující přísnou regulaci
expresního systému využívající T7 promotor. Tyto plazmidy kódují lysozym, který se
váže na T7 RNA polymerasu a inaktivuje ji a minimalizuje se tak bazální exprese.
BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
üBL21BL21
• Indukce exprese infekcí bakteriofágem CEG (gen pro T7 RNA
polymerasu)
Různé úrovně minimalizace bazální expreseRůzné úrovně minimalizace bazální exprese
Nejvyšší úroveň represe!!
Arabidopsis thaliana [gbpln]: 80395 CDS's (31098475 codons)
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 21.8(678320) UCU 25.2(782818) UAU 14.6(455089) UGU 10.5(327640)
UUC 20.7(642407) UCC 11.2(348173) UAC 13.7(427132) UGC 7.2(222769)
UUA 12.7(394867) UCA 18.3(568570) UAA 0.9( 29405) UGA 1.2( 36260)
UUG 20.9(649150) UCG 9.3(290158) UAG 0.5( 16417) UGG 12.5(388049)
CUU 24.1(750114) CCU 18.7(580962) CAU 13.8(428694) CGU 9.0(280392)
CUC 16.1(500524) CCC 5.3(165252) CAC 8.7(271155) CGC 3.8(117543)
CUA 9.9(307000) CCA 16.1(502101) CAA 19.4(604800) CGA 6.3(195736)
CUG 9.8(305822) CCG 8.6(268115) CAG 15.2(473809) CGG 4.9(151572)
AUU 21.5(668227) ACU 17.5(544807) AAU 22.3(693344) AGU 14.0(435738)
AUC 18.5(576287) ACC 10.3(321640) AAC 20.9(650826) AGC 11.3(352568)
AUA 12.6(391867) ACA 15.7(487161) AAA 30.8(957374) AGA 19.0(589788)
AUG 24.5(762852) ACG 7.7(240652) AAG 32.7(1016176) AGG 11.0(340922)
GUU 27.2(847061) GCU 28.3(880808) GAU 36.6(1139637) GGU 22.2(689891)
GUC 12.8(397008) GCC 10.3(321500) GAC 17.2(535668) GGC 9.2(284681)
GUA 9.9(308605) GCA 17.5(543180) GAA 34.3(1068012) GGA 24.2(751489)
GUG 17.4(539873) GCG 9.0(280804) GAG 32.2(1002594) GGG 10.2(316620)
Coding GC 44.59% 1st letter GC 50.84% 2nd letter GC 40.54% 3rd letter GC 42.38%
Využívání kodonůVyužívání kodonů E.coliE.coli (codon usage)(codon usage)
• Geny u prokaryot a eukaryot se vyznačují nenáhodným využíváním synonymních
kodonů.
• Kodony zřídka využívané u E. Coli se mohou hojně vyskytovat u heterologních genů
pocházejících z eukaryot, archebakterií aj.
• Frekvence využití synonymních kodonů obvykle odráží zastoupení jejich tRNA v
cytoplazmě.
http://www.kazusa.or.ip/codon/
Málo preferované kodony uMálo preferované kodony u E.coliE.coli
Exprese heterologní genů obsahujících málo preferované kodony vede k translačním
chybách !
• Předčasné ukončení translace (zkrácený produkt)
• Posunutí čtecího rámce (posun až o 2 AK v místě kodonu AGA)
• Záměna aminokyseliny - často arginin (kodon AGA) za lyzin
Makrides, 1996
Výběr hostitelského kmeneVýběr hostitelského kmene E.coliE.coli
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RIL
•AGG/AGA (arginine,R), AUA
(isoleucine, I) and CUA (leucine, L)
firma Stratagene
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RP
•AGG/AGA (arginine, R) and CCC
(proline, P)
firma Stratagene
•Rosetta or
Rosetta (DE3)
•AGG/AGA (arginine, R), CGG
(arginine, R), AUA (isoleucine, I)
CUA (leucine, L)CCC (proline), and
GGA (glycine, G)
firma Novagen
• Pro produkci genů obsahující velké množství kodonů, které jsou máloPro produkci genů obsahující velké množství kodonů, které jsou málo
využívanévyužívané E.coliE.coli, je možné použít komerčně dodávané kmeny, které produkují
tRNA málo užívaných kodonů.
NEBO: Místně řízená mutageneze - záměna málo využívaného kodonu.
Plasmidy komplementující tRNA.
Optimalizace kodonů – syntéza genůOptimalizace kodonů – syntéza genů
Optimální složení kodonů pro produkci v jednom či více organismech s ohledem na vznik
sekundárních struktur a stabilitu mRNA.
DDegradaceegradace proteinuproteinu
Bakteriální proteolytický systém:
- E. coli obsahuje velké množství proteas, nejvíce v cytoplazmě
- Selektivně odstraňuje „abnormální“ proteiny:
• Nekompletní polypeptidy
• Proteiny se zaměněnými AK
• Nadměrně syntetizované podjednotky multimerních proteinů
• Proteiny poškozené oxidací nebo volnými radikály
• Cizí, rekombinantní proteiny (problémem jsou proteiny < 10 kDa)
Výběr hostitelského kmeneVýběr hostitelského kmene E.coliE.coli
Kmeny deficiKmeny deficienentní na proteasytní na proteasy
• Mutace, eliminující produkci proteas a tím proteolytickou
degradaci rekombinantních proteinů.
Expresní kmeny BL21 jsou deficientní na:
cytoplazmatickou proteasu lon
periplazmatickou proteasu ompT
Aminokyseliny redukující stabilitu heterologního proteinuAminokyseliny redukující stabilitu heterologního proteinu
1. N-koncové pravidlo
• Stabilita proteinu je ovlivněna aminokyselinou, která následuje první
aminokyselinu polypeptidového řetězce (methionin).
• Aminokyseliny na této pozici redukují stabilitu proteinu:
Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr a Trp
• Poločas rozpadu proteinu pouze 2 min
2. Lysin ve vnitřní sekvenci poblíž N-konce proteinu
• Degradace ubiqutin-dependentními proteasami
3. PEST hypotéza
• Oblasti bohaté na Pro (P), Glu (E), Ser (S), Thr (T)
• Po fosforylaci PEST degradace proteinu Ca-dependentními proteasami
Cílená exprese proteinuCílená exprese proteinu
Cytoplazmatická exprese
Periplazmatická exprese
Extracelulární exprese
(do kultivačního média)
Cytoplazmatická expreseCytoplazmatická exprese
VýhodyVýhody
• Vysoký výtěžek proteinu
• Jednodušší plazmidové konstrukty
• Inkluzní tělíska
NevýhodyNevýhody
• Inkluzní tělíska
• Redukční prostředí
• Proteolýza
• Více komplexní purifikace
• Preferovaný způsob
Inkluzní tělískaInkluzní tělíska
Nerozpustné shlukyNerozpustné shluky (cca(cca 22mmmm33))
složené z nativních proteinů s nízkou rozpustností, zsložené z nativních proteinů s nízkou rozpustností, z
nesložených nebo z částečně poskládaných proteinůnesložených nebo z částečně poskládaných proteinů
Co způsobuje jejich tvorbuCo způsobuje jejich tvorbu??
1. Prostředí v E.coli se liší od přirozeného prostředí ve smyslu redoxního potenciálu1. Prostředí v E.coli se liší od přirozeného prostředí ve smyslu redoxního potenciálu
(redukční prostředí v cytoplazmě E.coli), pH, osmolarita, absence chaperonů,(redukční prostředí v cytoplazmě E.coli), pH, osmolarita, absence chaperonů,
kofaktorů, absence post-translačních modifikacíkofaktorů, absence post-translačních modifikací
2. Vysoká hladina exprimovaných proteinů
- exponované hydrofóbní domény nesbalených polypeptidových řetězců navzájem
(intramolekulárně) asociují
Inkluzní tělíska – nerozpustný proteinRozpustný protein
Výhody
• Snadná izolace ve vysoké čistotě a koncentraci
• Ochrana před proteasami
• Pro produkci proteinů, jejichž aktivita je pro buňku letální
Nevýhody
• Proteinová nerozpustnost
• Refolding pro opětné získání biologické aktivity
• Refolding nemusí vést k zaktivování proteinu
• Redukce výtěžku proteinu
• Zvyšují se náklady
Inkluzní tělískaInkluzní tělíska
Možnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísekMožnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísek
• Snížení teploty kultivace bakteriální kultury
• Koprodukce chaperonů
• Použití fúzního partnera zlepšujícího solubilizaci
(thioredoxin)
• Selekce různých kmenů E.coli kmenů - např. bakteriální
kmene deficientní na thioredoxin reduktasu
Inkluzní tělíska
Rozpustný proteinExprese
rekombinantního
proteinu v E. coli
Izolace a následný
refolding
Modifikace expresních podmínek
Rozpustný protein
• Pokud protein obsahuje jeden nebo více disulfidických vazeb, správné poskládání
proteinu je stimulováno v hostiteli s více oxidujícím prostředí cytoplazmy.
•AD494 • Mutace v genu pro
thioredoxinreduktasu (trxB)
• Novagen
•Origami • Dvojitá mutace v genu pro thioredoxin
reduktasu (trxB) and glutathionreduktasu
(gor)
• Novagen
Výběr hostitelského kmeneVýběr hostitelského kmene E.coliE.coli
Možnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísekMožnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísek
Periplazmatická expresePeriplazmatická exprese
Výhody
• Jednodušší purifikace
• Není zde tak rozsáhlá proteolýza
• Zlepšení tvorby disulfidických můstků/foldingu
Nevýhody
• Signální peptid nezajistí vždy transport do periplazmy
• Mohou se také tvořit inkluzní tělíska
• Periplazma obsahuje jen 4% všech buněčných proteinů (cca 100 proteinů)
• Transmembránový transport je zprostředkován signálním peptidem na Nkonci
proteinu
• Prokaryotické signální peptidy úspěšně použité v E.coli (ompA, ompT z
E.coli, protein A z S. Aureus, endoglukanasa z B.subtilis)
Extracelulární expreseExtracelulární exprese
• Sekrece proteinů do kultivačního média
• Chybí účinná cesta pro transport skrz vnější membránu (E.coli sekretuje velmi
málo proteinů).
• Některé proteiny sekretované do periplazmy pasivně difundují do média.
• Zatím spíše neúspěšná manipulace s různými transportními cestami, které by
usnadňovaly sekreci cizího proteinu.
VýhodyVýhody
• Minimální kontaminace ostatními proteiny (jednodušší
purifikace)
• Nejmenší hladina proteolýzy
• Zlepšení foldingu
NevýhodyNevýhody
• Často nízká sekrece
• Hodně zředěný protein
Modifikace růstových podmínek
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
Podmínky kultivacePodmínky kultivace
Možnosti zvýšení produkce rozpustného proteinu
Experimentálně se optimalizuje:
• Hustota buněčné kultury
• Složení média (pH, přídavek specifických substrátů, kofaktorů,
složení živin-bohaté či minimální média)
• Teplota růstu bakterií a teplota po indukci exprese
• Koncentrace indukčního činidla
• Délka indukce exprese
podmínky Specifická
aktivita
(nkat/mg)
LB médium pH 6 2,0
LB médium pH 7 4,2
LB médium pH 8 2,8
1% celobiosa (na
indukci exprese)
2,7
• pH LB média
• Přítomnost substrátu
(celobiosa na indukci
exprese)
Vliv různých podmínek exprese na aktivitu mutantní formy kukuřičné bglukosidasy
F461L.
Specifická aktivita byla po expresi za uvedených
podmínek měřena v nativních lyzátech použitím
substrátu PNPG.
VVliv složení média na produkci rostlinné b-glukosidasy vv E. coliE. coli
1. Médium: LB médium, bakteriální kmen BL21(DE3)pLysS
Růst (OD600~0.5-0.6) Indukce 0,4 mM IPTG/3hodiny
22°C 22°C (3)
37°C 22°C (2)
37°C 28°C (1)
2. Příprava proteinových lyzátů za silně denaturačních podmínek (celková produkce
proteinu= rozpustná+nerozpustná forma) a za nativních podmínek (rozpustná
forma proteinu).
3. SDS PAGE denaturačních a nativních proteinových lyzátů
s následnou analýzou western blotingem.
4. Detekce proteinu pomocí série protilátek a kvantifikace signálů pomocí programu
pro analýzu 1-D gelů (př. Quantity One- BioRad, Quanti Scan-přístupný na
internetu).
1 2 3
Podmínky:
Test rozpustnosti:
Rozpustná forma proteinu
Celková produkce proteinu
VVliv teploty kultivace na produkci rostlinných AHPAHP
proteinů vproteinů v E. coliE. coli
73 %81 %30 %100%78 %71 %22°C/22°C
51 %81 %0100%73 %82 %37°C/22°C
076 %0100%85 %8 %
37°C/28°C
AHP6AHP5AHP4AHP3AHP2AHP1
t(°C)
Růst/indukce
Procenta produkce AHP proteinů v rozpustné formě
VVliv teploty kultivace na produkci rostlinných AHPAHP proteinů vproteinů v
E. coliE. coli
2.2. část: Purifikace rekombinantních proteinůčást: Purifikace rekombinantních proteinů
Purifikace proteinů fúzovaných s GFP
pomocí hydrofóbní matrice
Purifikace proteinu z komplexní směsi makromolekul přítomných v
biologickém vzorku (buněčný nebo tkáňový extrakt)
• Několik tisíc proteinů z různými vlastnostmi (~5000-8000) a v různých množstvích
(aktin ~ 10%, unikátní trankripční faktor < 0,001% z celkového proteinů)
• DNA, RNA, polysacharidy, lipidy
Analýza buněčného extraktu 2D elektroforézou
Než začneme………………………Než začneme………………………
1.1.Proč???Proč??? Pro jaký účel ?Pro jaký účel ?
2.2. Jak???Jak??? Jak protein detekovat?Jak protein detekovat?
3.3. Co???Co??? Jaké vlastnosti má protein ?Jaké vlastnosti má protein ?
1.1. Proč???Proč??? Pro jaký účel ?Pro jaký účel ?
AplikaceAplikace MnožstvíMnožství ČistotaČistota PoznámkaPoznámka
IdentifikaceIdentifikace 0,002-0,20,002-0,2 mmgg vvysokáysoká
((>>95%95%))
• Edmanovo odbourávání (5-10 pmol),
přístupy hmotnostní spektroskopie (0,2-1
pmol)
Produkce protilátekProdukce protilátek mmg-mgg-mg střední-vysokástřední-vysoká • Pro imunizaci: ~ 0,1 mg proteinu
• Čím větší čistota tím větší a rychlejší šance
pro zisk vysoce specifické imunitní
odpovědi.
EnzymologieEnzymologie 1-5 mg1-5 mg vvysoká >ysoká > 95 %95 % • Množství proteinu závisí na citlivosti
analýzy.
• Čistota závisí na specificitě analýzy a
ovlivnění výsledků analýzy kontaminacemi.
Biofyzikální studieBiofyzikální studie mg-gmg-g vvysokáysoká
((>>95%95%))
• CD spektroskopie, rezonance povrchových
plasmonů, fluorimetrie, analytická
ultracentrifugace, UV spektroskopie
3D struktura3D struktura
(krystalizace, NMR)(krystalizace, NMR)
10-20 mg10-20 mg vysokávysoká
((>>95%)95%)
• Hledání krystalizačních podmínek ~ 1-2 mg
proteinu, zisk krystalu o velikosti dostatečné
pro rentgenovou difrakci 5-10 mg proteinu
• Pro první 1-D NMR spektra se vyžaduje ~
0,5 mmol proteinu, protein (velikost 5-
20kDa) značený 15 N / 13C je nutný pro
vyřešení struktury.
FarmaceutickéFarmaceutické
účelyúčely
mg-kgmg-kg vysokávysoká
(99,9%)(99,9%)
• Pro klinické účely nesmí proteiny
obsahovat pyrogeny a bakteriální toxiny a
musí být velmi stabilní kvůli dlouhodobému
skladování.
22.. Jak???Jak??? Jak budeme proteinJak budeme protein analyzovatanalyzovat??
1. Polyakrylamidová gelová elektroforéza se specifickou detekcí :
Detekce proteinu zájmu během jeho purifikace (SDS PAGE)
• Pomocí protilátek
Sledování biologické aktivity proteinu během purifikace (NATIVNÍ PAGE)
• U enzymů např. barvení v gelu pomocí chromogenních substrátů (nebo stanovení
specifických konstant v komplexních vzorcích )
SDS PAGE s následných
westernovým přenosem
nativní PAGE, zymogram
28% čistota 80% čistota 95% čistota
2. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za denaturujících
podmínek s nespecifickou detekcí
• Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,...
• Sledování čistoty purifikovaného proteinu
22.. Jak???Jak??? Jak budeme proteinJak budeme protein analyzovatanalyzovat??
Nativní PAGE Dimer
Monomer
3. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za nativních podmínek
s nespecifickou detekcí
• Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,...
• Sledování homogenity purifikovaného proteinu
4. Stanovení koncentrace proteinu
• Nejvíce využívané metody: dle Bradfordové, Lowryho metoda,….
22.. Jak???Jak??? Jak budeme proteinJak budeme protein analyzovatanalyzovat??
3. Co??? Jaké vlastnosti má protein ?
InformaceInformace o proteinu zájmu a příbuzných proteinecho proteinu zájmu a příbuzných proteinech z databz databází nebo zází nebo z
pilotních experimentů:pilotních experimentů:
• Velikost proteinu (SDS PAGE, gelová filtrace nebo analytická centrifugace)
• Izoelektrický bod (izoelektrická fokusace)
• Stabilita (pH, teplota, přítomnost solí, proteas, additiv zajišťujících
rozpustnost proteinu)
2D a nativní PAGE2D a nativní PAGE
• Komplexita vzorku, vlastnosti proteinu zájmu a i ostatních
kontaminujících proteinů
InformaceInformace o proteinu zájmu a o příbuzných proteinecho proteinu zájmu a o příbuzných proteinech zz literatury:literatury:
• Strategie purifikace (metody, pufry, stabilita proteinu, …..)
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vysoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Kolik purifikačních kroků je potřeba?
Obohacení vzorku cílovým proteinem,
zakoncentrování a stabilizace cílového proteinu
Odstranění většiny nečistot – jiné
proteiny, nukleové kyseliny……, další
zakoncentrování cílového proteinu
Vysoká čistota cílového proteinuodstranění
drobných nečistot,
proteinů podobných vlastností
purifikační kroky
Čistotaproteinu
ZISK CÍLOVÉHO PROTEINU
DALŠÍ PURIFIKACE
DOČIŠTĚNÍ
PŘÍPRAVA VZORKU PRO CHROMATOGRAFII
Odstranění nesolubilních podílu hrubého extraktu, lipidů,
zakoncentrování vzorku (precipitace solemi nebo ultrafiltrace)
Většina proteinů je purifikována
minimálně ve čtyřech krocích.
Rychlost
Rozlišení
Kapacita
Výtěžek
Logická kombinace purifikačních krokůLogická kombinace purifikačních kroků
Rozlišení je rozsah separace mezi
dvěma chromatografickými píky
(bez dostatečného rozlišení
nedochází k separaci proteinů).
Kapacita (max.) je
maximální množství vzorku,
které může být navázáno na
chromatografickou kolonu.
Rychlost kroku je
důležitá zejména v
kvůli možné
degradaci cílového
proteinu působením
proteas v
komplexním vzorku.
Výtěžek-minimalizace
ztráty proteinu během
purifikace.
Každá separační technika je vyznačuje rovnováhou mezi čtyřmi parametry.
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
Zisk cílového proteinu z proteinového extraktuZisk cílového proteinu z proteinového extraktu
Cíl: rychlá izolace, stabilizace a zakoncentrování.
Purifikační techniky: afinitní chromatografie
iontoměničová chromatografie
hydrofóbní chromatografie
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
Další purifikace proteinuDalší purifikace proteinu
Cíl: Purifikace a zakoncentrování.
Purifikační techniky: iontoměničová chromatografie
hydrofóbní chromatografie
gelová filtrace
afinitní purifikace
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
Dočištění proteinu a úprava podmínek pro
jeho skladování (pH, soli, additiva)
Cíl: Produkt o požadované vysoké čistotě.
Purifikační techniky: gelová filtrace
afinitní purifikace
Základní zásady pro pořadí purifikačních krokůZákladní zásady pro pořadí purifikačních kroků
• Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a
rozlišením ® velké množství levného vstupního materiálu.
• Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná
® ve vzorku již investovaná práce, množství proteinu je menší.
• Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků,
jako je výměna pufru mezi jednotlivými separačními technikami
příklad: po precipitaci síranem amonným nebo iontoměničové chromatografii (protein je
eluován z kolony za vysokých koncentracích soli) zařadit hydrofóbní chromatografii (vzorek
dávkován na kolonu ve vysoké koncentraci soli)
• Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat.
• Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu.
Fúzní proteinyFúzní proteiny
Translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a
a) krátký peptid [př. (His)n, (Asp)n, (Arg)n ... ]
b) přirozený oligopeptid [př. MBP, GST, thioredoxin …]
• usnadnění purifikace (uniformita purifikace)
• zvýšení výtěžku, rozpustnosti
• umožnění detekce , sekrece
• Fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit.
Fúzní partnerFúzní partner VelikostVelikost UmístěníUmístění VyužitíVyužití
His-tag 6, 8, or 10 aa N-, C-, internal purifikace
thioredoxin 109 aa (11.7 kDa) N-,C- purifikace, zvýšení solubility
proteinu
His-patch thioredoxin 109 aa (11.7 kDa) N-,Cpurifikace,
zvýšení solubility
proteinu
chloramfenikol acetyltransferasa 24 kDa N- sekrece, purifikace, detekce
avidin/streptavidin Strep-tag purifikace, sekrece
glutathion-S-transferasa-GST 26 kDa N- purifikace
maltosu vázající protein (MBP) 40 kDa N-, C- purifikace, sekrece
zeleně fluoreskující protein (GFP) 220 aa N-, C- detekce, purifikace
Odstranění fúzního partnera (tagu) – proteolytické
štěpení
Kotva (tag) Typ chromatografie Princip separační techniky
poly [His] afinitní vazba na kov
IgG vazná doména afinitní vazba na protilátku
Poly [Asp] iontoměničová vazba na anion vázající matrici
Poly [Phe] hydrofóbní vazba na hydrofóbní matrici
Strep-tag afinitní vazba na streptavidin
Poly [Arg] iontoměničová vazba na kation vázající matrici
Fúzní kotvy (tagy) využívající se k purifikaci
Kapacita
Rozlišení
Rychlost
Výtěžek
Separační techniky charakteristické
rovnováhou všech parametrů.
Metalochelatační afinitní chromatografieMetalochelatační afinitní chromatografie
• R.1975- uveřejnil Porath a kol. metodu frakcionace sérových proteinů.
• Konstrukce umělých oligohistidinových domén (poly [His]) fúzovaných k Nnebo
C- konci proteinu metodami molekulární biologie.
• Nyní jeden ze základních purifikačních postupů rekombinantních
proteinů.
•Interakce proteinu s matricí je zprostředkovaná neobsazenými d-orbitaly iontů
přechodných kovů, které vážou volné elektronové páry převážně z dusíkového
atomu imidazolových skupin histidinových zbytků v proteinu.
Podpůrná matrice
(agarosa)
„oddělovací
raménko“
Funkční/reaktivní
skupina
Ligand
(Ni2+
)
Protein s histidinovou
kotvou
Matrice proMatrice pro metalochelatační afinitní chromatografiimetalochelatační afinitní chromatografii
Zn2+
Ni2+
Co2+
Cu2+
Síla vazby: Cu2+
> Ni2+
> Zn2+
~ Co2+
Efekt kovového iontu navázaného na matriciEfekt kovového iontu navázaného na matrici
Podpůrná matrice
(agarosa)
„oddělovací
raménko“
Funkční/reaktivní
skupina
Ligand
(Ni2+
)
Protein s histidinovou
kotvou
(IMAC)
Metalochelatační afinitní chromatografieMetalochelatační afinitní chromatografie
Purifikace za nativních podmínek
Protokol nativní IMAC konkrétního proteinu je zčásti nepřenosný na jiné proteiny!
Obecně lze navrhnout:
Pufry o pH 7-8 pro vazbu rek. proteinu s kovovým iontem
Pufry s vysokou koncentrací solí (např. 0,5-1 mol/l NaCl)
Nižší koncentrace imidazolu nebo snížení pH pro odstranění
balastních proteinů
Eluce použitím gradientu imidazolu (0-1 mol/l),
výrazným snížením pH nebo využitím EDTA
Metalochelatační afinitní chromatografieMetalochelatační afinitní chromatografie
Purifikace za denaturačních podmínek
Denaturační IMAC – purifikace proteinů v inkluzních tělíscích
Purifikace za vysokých koncentrací močoviny nebo
guanidinium chloridu
čistý protein, ale porušení kvartérní struktury
(postačí však např. na imunizace)
Zisk nativního konformeru: - Nutné pro měření enzymové kinetiky, rtg analýza,…
- Eluce proteinu z kolony a jeho renaturace dialýzou
nebo výrazným zředěním v renaturačních pufrech
- Renaturace enzymu vázaného na matrici:
Gradient z denaturačních do renaturačních pufrů
Pulzní renaturace
Metalochelatační afinitní chromatografie
Gelová filtrace Anion výměnná chromatografie
4L bakteriální kultury
15% SDS PAGE 15 % SDS PAGE10% NATIVE PAGE
10% NATIVE PAGE
66 kDa
45 kDa
36 kDa
29 kDa
24 kDa
20 kDa
14 kDa
Pufr: 20 mM Tris pH 7.9, 250 mM NaCl
Isocratická eluce
Pufr: 20 mM Tris pH 7.9
Gradientová eluce: 0 - 1M NaCl
Puer: 50 mM Tris pH 7.9, 300 mM
NaCl, 10 % glycerol, 20 mM
imidazol, 3.9 mM mercaptoethanol
Gradientová eluce: 20 -500 mM
imidazol
Purifikace proteinuPurifikace proteinu AHP2AHP2 (Arabidopsis histidin phosphotransfer protein 2)(Arabidopsis histidin phosphotransfer protein 2)
One-step purification of maize b-glucosidase
Ø Perfusion matrix: POROS MC/M
Ø Functional group: iminodiacetate, metal ion Zn2+
Ø Removing contaminated proteins: linear gradient of imidazole (0–50 mM) and pH (pH 6.1–7)
Ø Protein elution: 0.1 M EDTA
Ø 80% recovery, 95 fold purification
Ø Common production and isolation of wild type protein and soluble mutant form for enzymatic
measurements and crystallization.
His-tagged protein and IMAC under native conditions
(Zouhar et al., 1999)
Doporučená literatura
Makrides SV (1996) Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in
Escherichia coli. Microb.Review 60, (512-538).
Simpson RJ; Adams PD; Golemis E
Basic methods in protein purification and analysis: a laboratory manual,
Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009,
436 s., ISBN 978-0-87969-868-3