CG030 – Struktura (architektura) a
funkce proteinových komplexů
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant)
UKB A2, 214
laboratoř Strukturních proteinů eukaryotních chromosomů
Osnova kurzu
• úvod – metody analýzy proteinových
komplexů, strukturní biologie
• funkce proteinů (chaperony, PTM, PPI,
signální dráhy …) a komplexů (proteasom)
největší proteinový komplex = chromosom
• DNA-vazebné komplexy
• Komplexy v transkripci
• Komplexy v replikaci
• Komplexy opravující poškozenou DNA
• Komplexy chromatinu
• Evoluce proteinů a komplexů
obecnéchromatin
závěrečná
Informační zdroje
Alberts a spol: Molecular biology of the Cell
Liljas a spol: Structural biology (2009) …
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS …
Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do,
http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/
08.03.201811-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček Úvod, metody, skládání komplexů
15.03.201711-12.50hod A2-2.11 Dr. Muller Chaperony
22.03.201811-12.50hod A2-2.11 Mgr. Adamus Ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom
29.03.201711-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy
05.04.201711-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy
12.04.201711-12.50hod A2-2.11 Mgr. Balkoová replikace DNA
19.04.201711-12.50hod A2-2.11 Dr. Blažek Cyclin/CDK komplexy v buněčném cyklu a transkripci
26.04.201711-12.50hod A2-2.11 Dr. Kolesár Oprava DNA, homologní rekombinace
03.05.201711-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček Chromatinové komplexy
10.05.201711-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček Evoluce proteinových komplexů
17.05.20179-12hod A2-2.11 doc. Paleček Zkouška - test
Program přednášek 2017
- Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z
hlediska proteomiky a především z hlediska proteinových komplexů
- výběr komplexů majících vztah k tématům studovaným v laboratořích
„chromatinových molekulárních komplexů“, NCBR a dalších skupin z MU
chromatin
obecné
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041, prof.
J. Fajkus), Metody GenPro (CG080) …
obecné
Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
Primárním zdrojem strukturních informací = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatin
proteasom
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF TFIIH
TBP
TFIIA
Příklady komplexů o kterých uslyšíte v tomto kurzu
chaperon
RNA polymeráza
nukleosom
RNA polymeráza + TFII…
obecné
chromatin
Molekula měsíce (PDB 101)
enhanceosom
~800 komplexů v kvasince Saccharomyces cerevisiae
Bertero et al, Cell, 2010
Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím
protein-proteinových interakcí
• Polypeptidový řetězec má tendenci vytvářet sekundární
struktury -> terciární struktury -> kvarterní tj. komplexy (stejné
typy nekovalentních vazeb, kritérium minimální energie)
(šroubovice a listy se k sobě skládají podobným způsobem)
• iontové, vodíkové, hydrofobní síly (kovalentní vazby disulfidické
můstky především u extracelularních proteinů)
• vodíkové můstky především u β-listů
Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím
hydrofobních protein-proteinových interakcí
- hydrofobní zbytky jsou tlačeny dovnitř proteinu (nikoli do
solventu) nebo do interakce (nejčastější způsob vazby)
– součet hydrofobních sil je značný (převažuje u většiny
interakcí)
– hydrofobní povrchy se podílí na vytváření coiled-coil
vláken
fa d
e
b
f
c
g
ad
c
g
f
e
b
Coiled-coil doména je
častým dimerizačním
modulem proteinů
- Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně:
proteiny musí mít komplementární tvar i charakter
- Variabilita je velká – nelze je jednoduše definovat obtížná
predikce (modelovat lze komplexy pro něž
existují již vyřešené struktury – KBDock, cvičení CG031)
Typy protein-proteinových interakcí
doména-motif doména-doména
Dva příklady „vyřešených“ komplexů
Baderetal,FEBSLett,2008
- Interakční plocha/oblast 500-10000A2 (vs pro ligandy 100-600A2)
- regulace PTM - vazba na fosfo-, acetyl …
- stabilní/komplexy
~350A2
- přechodné interakce
SH3 domény váží prolin-rich peptidy PDB: 4RTV
- z analýzy protein-proteinových interakcí lze usuzovat na
potenciální stabilní komplexy vs přechodné interakce
- variabilita interakčních povrchů je velká => variabilita
PPI (nelze je jednoduše definovat)
S jakými partnery a jak silně interagují vaše proteiny?
Jaké domény obsahují?
Baderetal,FEBSLett,2008
interaktom
Protein-proteinové interakce modulují velmi často GTP/GDP,
ATP/ADP … G-proteiny spolu interagují s 1000x vyšší afinitou za
přítomnosti GDP než pokud je na Gα navázané GTP (viz Ras)
– dochází ke konformační změně (doc. Marek) – „přenáší“ signál
Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005
GTP
Post-translační modifikace značně mění povrch (tvar, náboj) –
vytváří specifický nový povrch – mohou interagovat specifické
vazebné domény - např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa
(fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu)
Modifikace AMK zbytek interakční doména
Fosforylace tyrosin SH2, PTB
serin/threonin 14-3-3, WD40, WW, BRCT…
acetylace lysin bromodoména
metylace lysin chromodoména
hydroxylace prolin VHL β
ubiquitinace lysin UIM, UBA, CUE
SUMOylace lysin SIM
Bottomley, EMBO Rep., 2004
Modifikace histonů ovlivňují složení a přístupnost chromatinu – bromodoména
GCN5 (HAT) navázaná na acetylovaný H4 lysin – PDB: 1E6I
Např. BRCT doména váže fosforylovaný histon – fosforylace v
místě poškození DNA – PDB: 3141
Např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa
(fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) – PDB:
2PLD
SH2 (a jiné) domény jsou často (jako moduly) součástí
proteinů rozmanitých funkcí – provazují proteiny mezi sebou
(přechodně, kondicionálně – regulace buněčných procesů)
Golemis a Adams
Signální Ras dráha – EGF váže EGFR (aktivuje
cytoplasmatickou kinasovou doménu = autofosforylace) – SH2
v GRB2 interaguje s EGFR - SH3 domény GRB2 dimerizují s
prolin-rich doménou SOS – EGFR-GRB2-SOS je aktivní (SOS
= guanin nukleotid exchange faktor) a odstraní GDP z Ras –
Ras může navázat GTP (podobný Gα, ale monomer) a
interagovat s RAF kinasou - aktivuje se MAPK dráha
rakovina – Ras mutace stabilizující vazbu GTP mají za
následek konstitutivní aktivaci (aktivace i bez EGF stimulu)
Ivanov et al, TiPS, 2013
Ras dráha -
aktivace
- PPI předají
Komplexy
(degradace
supresoru)
některé viry využívají buněčné PPI moduly k invazi do buněk (přesměrování
ve prospěch viru – vazba HPV-E6 na p53)
některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů (permanentní PPI)
Problémy inhibice (vývoje léků) …
- interakční plocha 1150-10000A2 (větší než kapsy enzymů pro
malé ligandy)
- ploché bez hlubokých kapes (jako pro ligandy)
- hydrofobní charakter PPI (nerozpustnost léku)
- nelze vycházet z přirozených ligandů (jako u enzymů)
… ale
- interakce „peptid ve žlábku“ jsou relativně malé
- lze inhibovat interakci i relativně malou molekulou (hot-spot)
- vhodné je cílení na interakce regulované post-translační
modifikací (viz fosfopeptidy)
- mimikování peptidů (α, β)
Inhibice PPI
Ivanov et al, TiPS, 2013
Whitby a Boger, ACR, 2012
Inhibice PPI: p53-MDM2
Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009
HP-E6
ubiquitinace
MDM2-p53 (dimer, PDB: 1YCQ)
MDM2-nutlin (PDB: 4HG7)
- Inhibice interakce MDM2 stabilizuje p53 –
podpora nádorové suprese
jeden z prvních
Inhibice PPI: p53-MDM2
Ivanovetal,TiPS,2013
větší komplexy jsou stabilizovány více
interakcemi, ale může se rozpadnout i celý komplex
nová peptidomimetika
peptidomimetika
peptidomimetika
fosfopeptidová vazba
acetyl-peptidová vazba
kapsa pro ATP
Jak se komplexy sestavují - homomery?
nejjednodušší (běžné) je sestavování homooligomerů
(homodimerů), ke kterému dochází (většinou) při translaci
tento toxin je
spíš vyjímka
Polypeptidový řetězec má tendenci vytvářet sekundární struktury
-> terciární struktury -> kvarterní tj. komplexy (šroubovice a listy
se k sobě skládají podobným způsobem)
Wellsaspol,BST,2015
Jak se komplexy sestavují - heteromery?
podjednotky se exprimují „nezávisle“ a pak se musí „potkat“
(trans-assembly model) – problém s nespecifickými
interakcemi, proteasami, chaotické prostředí buňky …
… samostatně by se proteiny neposkládaly, byly by nestabilní
(degradace), toxické nebo by agregovaly (proteiny s
hydrofobními povrchy – interakce je skryje před solventem)
Jak se komplexy sestavují - heteromery?
podjednotky se exprimují „nezávisle“ a pak se musí „potkat“ trans-assembly
model …
transkripce genů u prokaryot je regulována operony: funkčně
vztažené geny/proteiny (komplexy) se transkribují z jednoho
operonu (tandemově uspořádané) – polycistronic mRNA –
ko-translace a ko-skládání (koordinované v prostoru i čase)
Podjednotky komplexů koexprimovány (ko-translace)
Podobně u eukaryot – mRNA podjednotek komplexů ko-precipitovaly
(ikdyž nejsou na jedné mRNA – ale jsou ko-translatovány)
Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe)
= Arp4
NSE2
SMC6 SMC5
L264F
P209L
WT
WT
NSE3
NSE3
TaylorE.M.etal.,MCB,2008
Stabilní proteinové komplexy jsou složené z jednotlivých
proteinů/podjednotek které spolu interagují - pokud schází
podjednotka, tak nefunguje celý komplex – komplex se
nesestaví nebo rozpadá (nestabilní – degradace …)
Deplece kterékoli podjednotky
lidského komplexu má za
následek pokles hladiny
ostatních proteinů
mutace podjednotky držící
pohromadě komplex (narušila
Nse3-Nse4 i Nse3-Smc6) může
mít podobný efekt ale …
vanderCrabbenetal.,JCI,2016
… přerušení protein-proteinové
interakce je relativně snadné u
slabých dimerů – větší
komplexy jsou většinou
stabilizovány více interakcemi a
je tedy obtížnější je narušit
(mutací či inhibitorem)
N
SE1
Nse3
M
AG
EG
1
NSE4
NSE2
SMC6 SMC5
… Stabilita komplexu je zpravidla větší než
pouhý součet jednotlivých protein-proteinových
interakcí mezi podjednotkami (větší povrch,
efekt přiblížení a zorientování partnera …)
Nse4
Pull-down
kvasinkový
2-hybridní systém
wt
mut
Nse3
Proteinový
komplex
Nse4
Nse1
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně
krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší
je méně stabilní a hůře se skládá)
– menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen
=> méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám –
odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší
podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury)
– komplexy mohou být dynamičtější (flexibilnější)
– evoluční výhoda modulů
(nový komplex vzniká
záměnou podjednotek)
bakteriální toxin
porin v mitochondrii
Figure 3-79 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Některé komplexy jsou modulární – např.
SCF (Skp-cullin-Fbox)
různé cullin (scafold) nebo Fbox (adaptor)
molekuly
- různé komplexy rozeznávají různé
substráty (ubikvitinace)
- delece jednoho F-box proteinu/genu
eliminuje pouze subset substrátů
- delece jednoho cullin proteinu/genu
eliminuje větší spektrum substratů
- delece jednoho RBX (RING-finger)
proteinu/genu eliminuje většinu substratů
(je i více RBX podjednotek)
Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005
Network/interaktom SCF komplexů a jejich substrátů
Figure 3-82 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Závěry
• Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet
jednotlivých protein-proteinových interakcí
• funkce celého komplexu je závislá na každé podjednotce
(komplex se nesestaví nebo rozpadne bez všech
podjednotek)
• některé podjednotky mohou plnit funkci adaptérů či
lešení (scafold)
• proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi
doménami – interakce mohou být modulovány
posttranslačními modifikacemi (dynamické komplexy)
NoorenaThornton,JMB,2003
• některé podjednotky mohou plnit funkci adaptérů či
lešení (scafold)
• proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi
doménami – interakce mohou být modulovány
posttranslačními modifikacemi (dynamické komplexy)
Nejčastější postup charakterizace
proteinových komplexů
Nový gen/protein – charakterizace funkce a funkčního kontextu =>
1. - identifikace partnerů tzn. PPI, respektive izolace komplexu
2. - charakterizace komplexu
- vzájemné PPI podjednotek - architektura/struktura komplexu
- funkce podjednotek (genetická analýza, lokalizace v buňce …)
3. - rekonstituce a analýza aktivit celého komplexu in vitro
Prolínají se analytické a izolační:
- ultracentrifugace, gelová filtrace
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- crosslink MS, (cryo) elektronová mikroskopie …
(Prolínají se i metody pro komplexy a PPI - viz MGP – 17.4.2018)
… visualizační metody
Metody izolace a analýzy
proteinových komplexů
viz MGP – 17.4.2018
Metody analýzy a izolace PKxů
Ultracentrifugace – analytická (preparativní – malé objemy)
Cukerný/hustotní gradient
Čím hustší je roztok tím více „brzdí“ částice => těžší („hustější“) částice projdou dál
přesně vyvážit!
- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)
- Za nativních podmínek (komplexy zůstávají pohromadě)
Lze poznat zda proteiny tvoří oligomery, agregáty
Metody izolace a analýzy PKxů
Ko-purifikace
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
AU
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0% Buffer B
60.00 120.00
Rack Pos.:
Tube #:2
A
4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1
B
3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41
15
25
35
40
55
70
input
29A
30A
31A
32A
33A
34A
35A
36A
37A
38A
39A
40A
41A
42A
1B
2B
3B
4B
5B
6B
7B
8B
9B
10B
11B
12B
Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1
Nse1,-3,-4
Nse1,-3
Nse1
3. Gelová filtrace – lze ještě dočistit subpopulace komplexů
Nse3
Nse1
Nse4
agregáty
- TAP-tag („Tandem-affinity purification“,
jiné tagy a protilátky)
Tandem-affinity purification
(vícestupňové – vyšší čistota)
1. Protein A (váže IgG beads)
2. TEV-proteasové místo (tobacco
etch virus) – uvolnění z matrice
3. calmodulin-binding
(CBP) – eluce EDTA
Zaintegrované v genomu (přirozená
hladina proteinu, přirozený výskyt
partnerů/komplexu …)
Protein CBP A
Puig et al, Methods, 2001
I jiné kombinace
(HBH – His-biotin-His)
Metody izolace a analýzy PKxů
známe jeden protein – hledáme další
podjednotky
Gavin et al., Nature, 2006
Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
Lambertetal,JProt,2015
Různé přístupy charakterizace komplexů
Biotinylace na
vzdálenost
<20nm
MS identifikace
biotinylovaných
proteinů
klasický alternativní
Roux, CMLS, 2013
Sinz, MS Reviews, 2006
Identifikace
podjednotek
komplexu
Mapování
interakcí
podjednotek
Mapování komplexů - crosslinking
crosslink propojí podjednotky - stabilizuje komplex
Po crosslinku komplexu lze provádět purifikaci za denaturačních podmínek (tag-ligand
interakce musí být odolná vůči denaturačnímu činidlu – např. 6xHis-tag váže Ni-kuličky
i v 8M močovině)
- estery reagují s Lys (ε-amin) a aminokoncem
(homofunkční - spojí proteiny
dohromady v jednom kroku;
heterofunkčních - postupná aktivace)
- s tagem – přečistit (vzorek není tak
komplexní pro MS analýzu)
Leitner et al., Trends in BS, 2015
Mapování interakcí mezi podjednotkami
pomocí crosslinking
Veld et al., Science, 2014
Příklad jednoduchého komplexu
Nguyen et al., Cell, 2013
příklad velkého komplexu
(zjednodušené schéma – jak
jsou podjednotky
„prosíťovány“ – jak jsou v
prostoru blízko sebe)
Integrace dalších dat:
- krystalové struktury
- cryoEM data
Analýza architektury komplexů (SWR = remodelovací)
- (ko-)purifikované komplexy lze dále analyzovat pomocí elektronové
mikroskopie (cryoEM)
- srovnat tvar různých komplexů (bez spec. podjednotky nebo s protilátkou
proti specifické podjednotce) Nguyen et al., Cell, 2013
Uchihashi et al, Nat Prot, 2012
AFM
atomic
forcemicroscopy
Speranzini et al, EMBO J, 2016
Analýza proteinových komplexů
více Metody GP
více C7230 doc. Hofr