• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, 3D – homolog v PDB?)
• Interakce (IntAct, BioGRID)
• evoluce
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
• Konkrétní nová data – článek
• V PyMolu připravit 3D movie (např. TinyTake – Mango Apps)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
PhD studenti anglicky
- frekvence mutací DNA je +/- stejná, ale různé proteiny jsou
různě změněné – (např. 6 ze 7 změn v cytochromu C jej
poškodí; kvasinkový a lidský ubikvitin se liší třemi AMK)
- takto konzervované proteiny jsou lehce identifikovatelné v
různých organismech a mají „homologní“ (ortologní) funkci
- srovnání genomů/proteomů
ukazuje (podobně jako morfologie)
na změnu („evoluci“) proteinů v čase
- divergence druhů koreluje do
značné míry s konzervací/divergencí
DNA/proteinových sekvencí
- DNA je replikována s relativně
vysokou přesností (1 změna na 109
nukleotidů – cca4000 TNR12 písmen
na A4 stranu – 8000 TNR12 na list –
500listů/balík – cca 250 balíků)
- poškození DNA dalšími vlivy …
Prof. Lehmann
Dr. Šebesta – poškození DNA
- velmi příbuzné sekvence DNA/proteinů mezi člověkem a
šimpanzem (nejbližší člověku) díky „krátké“ době, po kterou
mohlo k mutacím docházet – jsou zachovány i nukleotidy ve 3.
pozici synonymních kodonů (kodony specifikující stejnou
AMK) – není dáno selekcí, ale krátkou dobou
- přesný fylogenetický vztah (strom) mezi člověkem a primáty
bylo možné určit až dle sekvenací (ne podle morfologických
znaků apod.)
- přesný fylogenetický vztah (strom) mezi člověkem a primáty
bylo možné určit až dle sekvenací - velmi příbuzné sekvence
DNA/proteinů mezi člověkem a primáty díky „krátké“ době, po
kterou mohlo k mutacím docházet (jsou zachovány i
nukleotidy ve 3. pozici synonymních kodonů - odhad 1/400AMK
protein za 200,000 let)
- druhovou rozdílnost nezpůsobuje mnoho mutací v
proteinech (nemohlo jich tolik vzniknout) – ale jiná regulace
Figure 4-76 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
- pro vzdálenější organismy (člověk a myš) je sekvence
odlišnější (DNA je odlišnější než proteiny – pro 1AMK více
kodonů; regulační sekvence … intron je odlišnější než kódující
exon – intr. nekóduje protein) zde již působil selekční tlak
- odlišnost druhů je tedy dána spíše rozdílnou regulací
(nekódujícími sekvencemi) tj. rozdílem v expresi proteinů než
rozdílem v sekvenci proteinů (tj. rozdílnou funkcí proteinů)
- rozdílná exprese tj. rozdílné proteomy v buňkách podmiňují
odlišnost buněk v organismu (svaly, játra …) i odlišnost buněk
v čase a prostoru (morfogeneze – odlišný vzhled … mozek =>
menší problém když se modifikuje/zmutuje program
morfogeneze než když zmutuje protein => vliv na funkci)
Figure 4-78 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
- čím důležitější funkce proteinu pro organismus (od
nejzákladnějších po specializované) tím více je konzervovaná
sekvence proteinu respektive jeho domén (velká podobnost i
mezi odlišnými organismy – např. některé lidské proteiny
funkčně zastoupily zmutované kvasinkové proteiny = Y2H
cytotrap)
- konzervace je důsledkem „purifikační selekce“ (eliminace
buněk/jedinců s mutacemi v esenciálních/důležitých funkcích
– většinou proteinech)
- mutace u pacientů s různými syndromy …
Figure 4-78 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
van Crabben et al, J Clin Invest, 2016
- nejpomaleji se mění proteiny, které
jsou zapojeny do nejvíce interakcí s
dalšími proteiny (limitována, jak
struktura, tak povrch)
- není příliš prostoru pro změny např.
ubikvitin, DNA polymerásy,
histony, ribosomální proteiny, …
(„drží“ základní systém)
- konzervované proteiny jsou stabilní,
optimální pro svoji funkci (enzymatickou
aktivitu, pro interakce s partnery …
ko-evolvují celé komplexy)
- selekční tlak na stabilitu a funkci - nutnost zachování funkce
neposkytuje příliš prostoru pro evoluci/rozvoj nových vlastností
(ale neznamená ani selekci na „nejstabilnější“ či „nejaktivnější“ =
určitá volnost)
O
B
R
A
T.
KVASINKY … určitá volnost v obsazení AMK
Guerineau et al, PLoS One, 2012
- selekční tlak na strukturu,
na povrch = interakce
- mutace, které neruší jsou
neutrální (protein je
částečně modifikován)
- modifikace je
kompenzována
(i později) mutací partnera
- změní se v čase a v
budoucnu může přinést
novou vlastnost
S
A
V
C
I
…RYBY, OBOJŽIVELNÍCI, PTÁCI …
- mutace specifické AMK na Ala zruší
Nse3-Nse4 interakci
- „mutace“/změny těchto AMK na
podobné (hydrofobní) AMK tyto
interakce neruší
Hudsonetal,PLoSOne,2011
Silná konzervace v
blízkých organismech
Nse3
O
B
R
A
T.
KVASINKY … určitá volnost v obsazení AMK
Guerineau et al, PLoS One, 2012
- „mutace“/změny těchto AMK na
odlišné (polární Thr nebo posun
motivu o 1AMK na konci)
- interakční partner se ovšem také
„mění“
- „mutace“/změny zřejmě koevolvují
Slabší konzervace ve
vzdálených organismech
O
B
R
A
T
k
v
a
s
O
B
R
A
T.
KVASINKY … určitá volnost v obsazení AMK
Guerineau et al, PLoS One, 2012
- „mutace“/změny těchto AMK na
odlišné (polární Thr nebo posun
motivu o 1AMK na konci)
- interakční partner se ovšem také
„mění“
- „mutace“/změny zřejmě koevolvují
- teorie kompenzačních mutací …
Slabší konzervace ve
vzdálených organismech
Vazební partneři ko-evolvují
Madaoui et al, PNAS, 2007 Aakre et al, Cell, 2016
- nutnost zachování funkce nesvědčí o „compensatory mutation“
(mutace v jednom z proteinů přímo kompenzována mutací v
partnerském proteinu) – „kompenzace“ přichází postupně přes
„promiscuous intermediate“ mutace
Vazební partneři ko-evolvují
Aakre et al, Cell, 2016; Akiva a Babbit, Cell, 2015
- „promiscuous intermediate“
mutace jednoho proteinu
mohou být doprovázeny
„promiscuous“ mutacemi
druhého proteinu
(nedochází ke ztrátě PPI)
Vazební partneři ko-evolvují
Aakre et al, Cell, 2016; Akiva a Babbit, Cell, 2015
- u „promiscuous intermediate“ mutací nedochází ke ztrátě PPI
- „promiscuous intermediate“ může interagovat i s duplikovaným
proteinem (např. tkáňově specifickým – specifický komplex)
- později se může „oddělit“ a vytvořit nový komplex (paralelní koevoluce
= drift)
Tori
Tnew
Aori
- selekční tlak na stabilitu a funkci - nutnost zachování funkce
neposkytuje příliš prostoru pro evoluci/rozvoj nových vlastností
- pro rozvoj nových vlastností, nových druhů - spíše než
druhově specifické mutace proteinů lze vidět expanzi různých
genových/proteinových rodin v různých živočišných druzích
(příklad superrodiny jaderných hormonálních receptorů)
Figure 4-85 Molecular Biology of the Cell (2008)
Vznik proteinových rodin
- duplikace a divergence jsou hlavními tahouny evolučních
procesů (všechny geny/proteiny jsou „potomky“ několika
ancestrálních genů/proteinů (foldů), které existovaly v
nejčasnějších živých formách (nyní cca 1000 foldů na >100000
struktur v PDB, odhad je cca 2000 foldů))
- po duplikaci jsou oba proteiny stejné a vytváří stejný
homomerní komplex – později jeden protein diverguje (mutace)
a vzniká heteromer
Marsh et al, ARB, 2015
prokaryota eukaryota
homo
hetero
cca 30% genomu S.c. vzniklo duplikacemi => došlo k
celogenomové duplikaci (WGD) => a poté došlo k
přeskupování a redukci segmentů (i chromosomů) – polyploidie
u kytek …
Celogenomová duplikace u kvasinek
Ancestrální
chromosom
-následují mutace – inaktivující tj. pseudogeny (ustaví hladinu proteinu zpět na
původní) nebo nefunkční (zatěžují expresní-chaperonový aparát – snaha odstranit)
-duplikace ALE … – na počátku stejné sekvence = stejné
funkce - vyšší hladina proteinu/ů může být toxická
(aneuploidie – kvasinky s 1 chromosomem navíc, nádorové buňky)
- nadbytek proteinů (např. transkripčních faktorů) nebo
nerovnováha podjednotek komplexů znamená disregulaci
některých procesů
Shelzeretal,Science(2011)
dospělýplod
- duplikace – reverzní transkripcí (u živočichů) a integrací
DNA (pouze individuální geny nebo pouze domény = exony)
nebo replikační chyba s následnou chybnou opravou DSB
- na počátku stejné sekvence = stejné funkce (pod jinými
promotory – jiný lokus tzn. jiné „okolí“ zaintegrované „mRNA“
tzn. jiná regulace exprese – „nové“ buňky)
(např. rozdíl v genomu člověka a šimpanze je především v duplikaci
30Mbp – cca 50kbp segmenty - nikoli v jednotlivých mutacích tj. SNPs)
Příklad: Evoluce globinů
Evoluce rodiny globinů (duplikace)
- červy, hmyz a primitivní ryby mají jeden globin (150AMK)
- vyšší obratlovci mají α- a β-globin (tvoří α2β2 komplex –
účinnější přenos kyslíku) – vyvinul se u vyšších ryb (500Mya)
Figure 4-86 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
homo- na heteromery
Evoluce rodiny globinů (duplikace)
- u savců se dále duplikoval β-globin (paralog) - exprimován
specificky v embryu – má vyšší afinitu ke kyslíku a napomáhá
přenosu kyslíku z krve matky do krve plodu
- dále se duplikoval a specializoval na časná vývojová stádia
α2ε2 a pozdější α2γ2 - k další duplikaci došlo u primátů α2δ2
dospělýplod
- následují mutace – modifikujícící původní protein na novou
variantu (podobná funkce)
Příklad: histony - histon fold (původní „histon“) + odlišné sekvence (odlišně
PTM) odlišné funkce (stále v rámci nukleosomů/chromatinu)
Figure4-41MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)
- histony > NF-Y trankripce (ohyb) > TAF (strukturni TFIID)
- duplikace celého genu nebo pouze domény – většina
domén v proteinech obratlovců pochází/existuje v
bezobratlých – pouze 7% lidských proteinů/domén je
specifických pro obratlovce)
- fůze domén naznačuje funkční příbuznost nebo dokonce
přítomnost v komplexu (v organismu s nefůzovanými
doménami - ChimeraDB)
- duplikace domény (většinou koreluje s exonem)
- hranice domény jsou většinou kódovány introny – bez
intronů by bylo obtížnější přesně vybrat pouze „doménovou“
část sekvence
- duplikací a „shuffling“ domén – poskládají se nové
geny/proteiny – vytváří nová funkční/fyzická provázání
(interakce => nové „prosíťování“ interaktomů)
- duplikací a „shuffling“ domén – poskládají se nové
geny/proteiny
- nová doména (protein) není pod tlakem „funkčním“, ale
zůstává pod tlakem „strukturním“ a „interakčním“
- zůstává hydrofobní profil (hydrofobní AMK jsou uvnitř a drží
strukturu domény) – mění se povrch (můžete hledat „paralogy“ i
podle 3D struktury, sekvence <25% ident. – funkce ? odlišná)
Figure 3-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
HTH – WHD
vazba DNA
vs PPI
přibyla smyčka
Hydrofobní – struktura, bazické – vazba DNAbazické – vazba DNA
- „staré“ proteiny jsou konzervovány „strukturně“ a „funkčně“ –
funkčně znamená většinou „konzervaci“ interakcí (většinou
PPI)
- nová doména (protein) je pod tlakem „strukturním“ („misfold“
= degradace) – je ale i pod tlakem „povrchovým“ tj. tendencí
povrchů interagovat (zvláště hydrofobní povrchy – hydrofobní
povrch je rozeznáván chaperony a bez interakčního partnera
degradován)
- z toho plyne tendence duplikovaných proteinů vytvářet
podobné komplexy
(podobné interakce)
(viz ko-evoluce)
Příklady evoluce kompexů
Evoluce SMC komplexů
- bakterie mají po jednom komplexu složeném z homodimeru
SMC/MukB a 2 Nse
- eukaryota mají 3 SMC komplexy – SMC heterodimery + kleisin
(další podjednotky nepříliš konzervované) - (příklad využití
konzervovaného motivu a alterace částí systému/komplexu)
Palecek a Gruber, Structure, 2015
- konzervovaný motiv (kroužek)
- SMC heterodimery + kleisin
- alterace – kohese x kondensace
(Nse podjednotky, faktory ovlivňující loading = místo, čas …)
Evoluce SMC komplexů
Thomas et al., CRiBMB, 2006
RNA pol II a podobnosti s pol I a III
TBP-všechny 3 pol
Vannini & Cramer, Mol Cell, 2012
Hoffmann et al, Nature, 2015
Pol I = 11 + A49/34.5
Pol II = 11 podjednotek
Pol III = 11 + C37/53 + C82/34/31
11
16
13
RNA polymerasy
Pol I = 11 + A49/34.5
Pol II = 11 podjednotek (Tabulka)
Pol III = 11 + C37/53 + C82/34/31
TFIIF
TBP
TFIIB
TFIIE
Vannini & Cramer, Mol Cell, 2012
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
TFIIB
TBP
TFIIA
TFIIF
- TFIIF se váže na pol II, stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a
pomáhá TFIIB s nastavením startu
- v pol I a III jsou paralogy TFIIF součástí komplexu polymerázy
- TFIIF se váže na pol II, stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a
pomáhá TFIIB s nastavením startu
- v pol I a III jsou paralogy TFIIF součástí komplexu polymerázy
- TFIIB (C-konec) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od
ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (kolem TATA boxu)1VOL
Nikolovetal,Nature,1995
TFIIB
TFIB
TFIIIB
Vannini&Cramer,MolCell,2012
TBP
TFIIB
Vannini & Cramer, Mol Cell, 2012
- Zn-ribbon s dock, Bfinger/reader
RNA tunel, Bcore/CTD1
s wall, Bfinger/reader
s CC clamp
- podobné natolik, že vážou
stejné TBP a mohou být
zaměněny pro kteroukoli
polymerásu – zatímco
reader je specifický pro
určitou polymerásu
reader
„ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor
– „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie).
Molekula měsíce v prosinci 2005
Rastogi & Girvin, Nature, 1999
F0 je protonový motor (uložen v
membráně) poháněný tokem vodíkových
iontů (z dýchacího řetězce) přes
membránu. Tento rotor je spojen s
druhým F1 chemickým motorem
poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP).
Oba motory jsou spojeny statorem.
?
?
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
mitochondriální vakuolární
podobné proteinové komplexy – tzv. AAA ATPasy
jsou součástí jiných komplexů (v jiných
procesech):
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků
- „denaturace“ DNA: helikásy (MCM …)
- v opravě poškozené DNA: Rad51, RecA
- …
vytváří ATP vytváří pH gradient
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- ATPasové pumpy …
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků …
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- … složité komplexy se patrně vyvinuly z RNA
helikásy (RNA svět) přes (RNA, protein)
translokásy, ATPasové pumpy …
Souhrn
Průběh evoluce je ovlivněn mnoha faktory
- Selekční tlaky udržující funkční a stabilní (dříve
vytvořené) komplexy
- Mutace modifikující proteiny/komplexy (drift) jsou
eliminovány u esenciálních proteinů
- Zatímco duplikované mohou podléhat mutacím „volněji“
- Duplikace a neofunkcionalizace (mutace) je hnací silou
vzniku nových komplexů – funkcí – buněk - organismů
Souhrn
Průběh evoluce je ovlivněn mnoha faktory
- Selekční tlaky udržující funkční a stabilní (dříve
vytvořené) komplexy
- Mutace modifikující proteiny/komplexy (drift)
- Duplikace a neofunkcionalizace (mutace) je hnací silou
vzniku nových komplexů – funkcí – buněk - organismů
Praktické implikace (pro zkoušku)
- analýza sekvenční podobnosti (stupeň konzervace)
- napoví o přítomnosti domén (alignment – podobné AMK,
doplnit analýzou sek. a terc. struktury)
- projekce podobnosti do 3D modelu (ConSurf, PatchFinder) konzervovaná
struktura tj. vnitřní AMK držící fold (u
ortologů i paralogů)
- konzervované PPI kontaktní zóny na povrchu proteinu
(povrchové AMK jsou konzervované pouze u ortologů – ne u
paralogů - pokud jsou v alignmentu i paralogy, pak podobnost
neuvidíte)