1 PROTEINOVÉ KOMPLEXY V REPLIKACI DNA 2 Replikácia DNA polymeráza I - E.coli (Kornberg, 1957) Semikonzervatívna (Meselson a Stahl, 1958) Replikačná vidlica - E.coli (Cairns, 1963) Okazakiho fragmenty (1968) Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -> 3' Presnosť: 1/106 Rýchlosť: • E. coli- 50 000 bp/min S. cerevisiae - 3 600 bp/min • Myš - 2 200 bp/min Three postulated methods of DNA Replication Semi-Conservative Conservative* Dispersive1 Newly, synthesized strand Original template strand " not found to be biologically significant 3 Replikácia • Semikonzervatívna Obojsmerná Paramecium Parlor ©AmoebaSisters Smer syntézy DNA: 5' -> 3' • Vedúci reťazec Oneskorujúci sa (opžďujúci se) Presnosť: 1/10 6 • Rýchlosť: E. co//-50 000 bp/min S. cerevisiae-3 600 bp/min Myš - 2 200 bp/min 3 fáze replikácie: Iniciácia rozpletenie dvojšróbovice DNA, vznik replikačnej vidlice a naviazanie enzymatického komplexu • Elongácia pridávanie nukleotidov a postup replikačnej vidlice Terminácia ukončenie replikácie Proteinové komplexy v replikácii Prereplikačný komplex CMG helikáza RPA Primáza DNA polymerázy PCNA DNA ligáza Topoizomerázy I a II Histon remodelačné komplexy PCNA Lagging strand Leading strand Pol 6 RPA CMG complťM PCNA (Boehm et. al., 2016) 5 Iniciácia w^^^^vvx/^ • Bakterie majú len 1 replikačný počiatok • Eukaryota - väčší zložitejší génom - viac počiatkov replikácie • Zostavenie prereplikačného komplexu v G1 • „replication licencing" • Fosforylácia MCM helikázy pomocou CDK a DDK kináz • Aktivácia replikačnej helikázy (CMG helikáza) v S • K MCM helikáze sa pripoja ďalšie proteiny 1. ORC komplex 2. MCM helikáza -> preRC 3. MCM dvojitý hexamer 4. MCM dvojitý hexamer -> CMG helikáza • 0RC1 • 0RC2 • 0RC3 CDC6 ORC Origin of recognition complex Objavené u S. cerevisiae Podjednotky Ord, Orc2, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6 (+CDC6) Asociované s chromatinom - väzba na ARS • Autonomously replicating sequences Väzba k DNA závislá na ATP Funkcia: zostavenie prereplikačného komplexu (preRC) v G1 • Transkripčné umlčenie, heterochromatinizácia, kondenzácia a kohézia chromosómov, cytokinéza omcm2-7 preRC: Cdc6, Cdt1, Mcm2-7, ORC MCM helikázový komplex sa aktivuje až v S fázi (pomocou kináz) x>0O0O0 Nie všetky replikačné počiatky sa aktivujú Meier-Grolinov syndróm (AR-ORC, Cdc6), E B V, nádory • Cdt1 ARS Autonomously replicating sequences Sem sa viaže preRC ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov Konsezus sekvencia u S. cerevisiae: B3 • ORC naviazaný počas celého bunečného cyklu • A-element vysoko konzervovaný ■-■ 5'- T/A T T T A Y R T T T T/A -3 20bP Okrem S. cerevisiae a jej blízko príbuzných kvasiniek sa u žiadneho ďalšieho organizmu nepodarilo nájsť uniformnú konsenzuálnu sekvenciu pre väzbu ORC AT-bohatá sekvence u S. pombe • ORC naviazaný počas celého bunečného cyklu B2 BI A Origin recognition sequence http://glossomics.blogspot.cz/ 8 ARS Autonomously replicating sequences Sem sa viaže preRC ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov Vyššie eukaryota: • Asymetrické AT bohaté sekvencie, rozhoduje epigenetika • G-kvadruplexy, počiatky transkripcie, Dnáza hypersenzitivné oblasti • Early replicating regions: • H3K4me1/2/3, H3K9ac, H3K18ac, H3K36me3, a H3K27ac • Euchromatin • Late replicating regions: • H3 a H4 hypoacetylácia, a H3K9 a H3K27 metylácia • Často tkáňovo specifické • V ľudských buňkách Ord sa počas S fáze uvoľní z komplexu a spät sa naviaže na konci mitózy • ARS: Kvasinky po 40kb, savci každých 200-300kb • Ľudská buňka asi 50 000 ARS 9 Podjednotky ORC ORC1 : • Interakcia so Sir1 (S.c), HP1 (D.m.) • transkripčná represia • BAH doména sa viaže na H4K20me2 • esenciálna interakcia pre asociáciu s chormatinom ORC2: • Lokalizácia aj pri centromerách • delécia -> mitotické defekty • AT hook: väzba k DNA ORC4: ona • Asociácia s membránami neurónov, úloha v dendritickom rastu ORC6: • Štruktúrne odlišná od ostatných ORC podjednotiek 0ra> • Medzidruhovo velmi málo konzervovaná • Lokalizácia u kinetochóroch, úloha v cytokynéze (H.s., D.m.) WH doména a AT hook - väzba k DNA AAA+ doména - ATPázová doména BAH doména - protein-proteinové interakcie AAA- Orcl Ona BAH ORC/Cdc6 WA WB Si S2 AAA + WH I I ~| I QRC/OJG6 AT hook AAA+ WA WB S1 S2 ♦ WH + ORC/Cdce 620 6"6 WA WB S1 S2 ._AAA+ Onc4 ORC/Cdce -.21 WA WB Si S2 AAA+ ORC/CdC6 WA WB S1 S2 AAA+ Cdc6 WH Wh 479 BAH domain Disordered region O RC/Cdc6 domain Motifs ORC/Cdc6 513 WA WB S1 S2 WH (Dunckeret. al., 2009) 10 Struktura ORC AAA+ protuberance body (AAA+ and WH) 2-AAA+ WHD layer • WH O AAA+ lid O AAA+ base O (3-hairpin wing • ism (Belichert et. al., 2015; 11 Štruktúra ORC - 5V8F Štruktúra ORC - 5V8F •organismus: S. cerevisiae • Cryoelektronová mikroskopie - 3,9 Á 13 Evolúcia ORC • Baktérie: DnaA • Archaea: ORC • ORC1 - Cdc6 • ORC1 - Sir3 • N-koncových 214 aa (50%identita, 63% podobnosť) • ORC6-TFIIB • C-koniec Koevolúcia proteinov v replikácii a transkripcii? Ona_Sc Oic4_Sc Ons4_Hs Ormjíl Orc5_Dn Orta.Ha Orc£_Dni Cdc6 (Dunckeret. al., 2009) 14 MCM2-7 complex Minichromosome maintenance 2-7 Podjednotky: 5-3-7-4-6-2 ring Rodina AAA+ATPáz 3-5' helikáza Sama o sebe nemá helikázovú aktivitu • potrebuje cdc45 a GINS Iniciácia (preRC) + elongácia (CMG) Postupuje s replikačnou vidlicou Loading: • Pomocou ORC-CDC6 komplexu • Pred loadingom je MCM komplex SUMOylovaný (až do S fáze) zabráni skorej aktivácii Aktivácia počas S faze • pomocou CDK a DDK protein kináz • MCM už nie je sumoylovaný ale fosforylovaný • Aktivácia nie naraz, nie všetky • Záloha v prípade pozastavených replikačních vidlic • Stochastické AAA* Amino- terminal (Bell and Botchan, 2013) 15 MCM2-7 complex - štruktúra podjednotiek N-koncová doména • interakcia medzi MCM podjednotkami Zinc-binding motif • stabilizácia N-koncov a tím aj komplexu Allosteric communication loop • komunikácia medzi podjednotkami N-koncový (5-hairpin • Interakcia s DNA AAA+ ATPázová doména • Cis-acting: WalkerA, WalkerB a Senzorl motív • Trans acting: argininový prst, Senzor2 motív Degenerovaná Winged Helix Posttranslačné modifikácie na N a C koncoch Zn Zn ACL NBH EXT-HP H2I PS1BH 100 amino adds 1 1 1 1 1 TÍ A B +2 S 1 F F Ú2 Amino-terminal domains AAA* domain wH cřs-residues EXT-HP frans-residues (Bell and Botchan, 2013) 16 MCM2-7 complex - štruktúra podjednotiek N-koncová doména • interakcia medzi MCM podjednotkami Zinc-binding motif • stabilizácia N-koncov a tím aj komplexu Allosteric communication loop • komunikácia medzi podjednotkami N-koncový (5-hairpin • Interakcia s DNA AAA+ ATPázová doména • Cis-acting: WalkerA, WalkerB a Senzorl motív • Trans acting: argininový prst, Senzor2 motív Degenerovaná Winged Helix Posttranslačné modifikácie na N a C koncoch Zn ACL NBH EXT-HP H2I PS1BH Amino-terminal domains AAA* domain 100 amino adds 1 1 1 1 1 TÍ A B +2 S 1 F F Ú2 wH AAA* Amino-tormina! (Bell and Botchan, 2013) 17 18 ATPázová aktivita MCM komplexu 9r#5Sc> AAA+ ATPázy Aktivné miesta medzi podjednotkami • Jedna podjednotka: Walker A a Walker B motívy • Druhá podjednotka: Arginin finger V jednom hexamere MCM 6 aktívnych miest Loading komplexu: 2-6 ATPáza Loading druhého hexameru ^ a tvorba dvojitého hexameru MCM komplexov: 4-7, 6-4, 5-2 a 3-5 ATPázy m7«m3 m2«*-*m6 (Bell and Botchan, 2013, Li et. al. 2015) 19 Mcm - štruktúra dvojitého hexameru Dva hexamery sa spoja až po väzbe na DNA • U archaea sa dva hexamery môžu spojiť už mimo DNA • ORC rekrutuje MCM komplexy po jednom • Dva MCM komplexy sa potom spoja pomocou N-terminálnych domén • Zinkové prsty stabilizujú interakciu medzi dvomi MCM komplexmi • Loading aj dimerizácia MCM komplexov vyžaduje ATP Centrálni pór MCM komplexu • 23A - vojde sa ss aj dsDNA • Pozitívny náboj • Väzba na DNA pomocou bázických AMK v OB fold • KinkDNA M6A kM6' M4' v* (Li et. al., 2015) 20 PCNA-Cfll4-Cdt2 CMG CMG obsahuje: • MCM hexamer • GINS komplex • Cdc45 Zloženie a aktiváciu CMG komplexu iniciujú dve kinázy, CDK a DDK v S-fázi '-Côc<5 C za 10 minút od začiatku replikácie sa dva replikačné vidlice stretnú a dojde k terminácii replikácie • RFB(replication fork barrier): • Špecifické miesta genomu, ktoré dokážu zastaviť replikačnú vidlicu • Pri replikácii rDNA ORC ostáva na DNA • Okrem Ord u H.s. a D.m, ktorý sa na konci S-fáze disociuje z komplexu Odstránenie CMG: • Mcmľ je polyubikvitylovaný na K48. • Cdc48 rozpozná polyubikvitinylovaný CMG komplex a oddelí ho od chromatinu PCNAje z chromozómu odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELGI-Rf-C Ďakujem za pozornosť