•© 2018 ZPRACOVÁNÍ KLINICKÝCH DAT ANEB STATISTIKA V PRAXI Doc. MVDr. Eva Bártová, Ph.D. bartovae@vfu.cz https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSsZh_qbLc7Jb5pCAo2zzAdHsX0FlQa90Dezc5HKfRapLn sqfzt7Q Parazitární onemocnění TOXOPLAZMÓZA NEOSPORÓZA ENCEFALITOZOONÓZA https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT0GfObWCegxE6QK45B3XP8xSIswPKQBK0TbHb3H29WruF hiRQFHA •Kolik lidí se s infekcí setkalo? •Zdroje infekce pro člověka? •Diagnostika? •Prevence? •Lidi §75% bez příznaků §25% klinické příznaky - rizikové skupiny Toxoplazmóza - zoonóza http://classconnection.s3.amazonaws.com/271/flashcards/912271/png/toxoplasmosis1358640082797.png Toxoplazmóza - zoonóza §uzlinová forma §oční forma §vrozená toxoplazmóza §mozková, plicní, srdeční, svalová •MUDr. Markéta Geleneky, Klinika infekčních nemocí 3.LFUK a Nemocnice Na Bulovce, Praha •www.toxoplasmoza.cz •www.tehotenstvi-infekce.cz Toxoplasma gondii - historie Systematické zařazení (Volf et al., 2007): Doména: Eukaryota Říše: Chromalveolata Skupina: Alveolata Kmen: Apicomplexa (Výtrusovci) Třída: Coccidea (Kokcidie) Řád: Eimeriida Čeleď: Toxoplasmatidae Rod: Toxoplasma Druh: Toxoplasma gondii •Gundi saharský (Ctenodactylus gundii) (Nicolle a Manceaux, 1908) •Gundi - severoafrický (Maroko, severní Alžírsko, Tunisko a Libye) hlodavec velikosti morčete, žije v koloniích. • •ČR - koncem roku 2008 import 10 kusů, první odchov v ČR v Zoo Praha v září 2009. Toxoplasma gondii – infekční stádia •Sporozoiti 2 x 6 - 8 μm, uvnitř oocyst (více rhoptrií a mikronem než tachyzoit) •oocysta 11 x 13 μm •uvnitř dvě sporocysty, každá po čtyřech sporozoitech •Bradyzoiti (cystozoiti) 5 - 8,5 x 1-3 μm, nachází se uvnitř cyst •tkáňová cysta (5 – 100 μm) ve vnitřních orgánech a tkáních (CNS, svaly, oko, srdce..) •chronická fáze infekce •Definitivní hostitel? •Mezihostitelé? •Infekční stádia? •Tachyzoiti (endozoiti, trofozoiti) 2 x 6 μm, dělí se uvnitř jaderných buněk endodyogonií •akutní fáze infekce životní cyklus - T •Toxoplasma gondii – životní cyklus •Prepatentní perioda (doba od infekce po vylučování oocyst): 3 - 10 dnů po infekci TC, > 18 dnů po infekci oocystami. •Vylučování oocyst 1–3 týdny až 150 milionů oocyst • •(Bártová et al., 2003) – experiment, vylučování za 3-5 dnů po infekci TC, vylučování 7-18 dnů, max. 5-6 den, celkem 1-47 miliónů oocyst. •Klinika u koček? •Opakované vylučování? https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0d/Jaroslav_Flegr_-_portrait.jpg §Prof. RNDr. Jaroslav Flegr, CSc., Přírodovědecká fakulta, Karlova univerzita, dílo Zamrzlá evoluce §Ig Nobel (za výzkum, které přinutí k zasmání a poté k zamyšlení) §http://pokusnikralici.cz/ •Manipulační teorie Toxoplasma gondii •Infikovaní: Ø2,7x vyšší riziko dopravních nehod Øméně vadí pach kočky Øvliv na vzhled, chování, povahu, reakční časy, pohlaví plodu, rizikové chování, sexuální preference … Øzvýšení rizika výskytu cca 70 onemocnění včetně schizofrenie, deprese, infarktu myokardu, nádorových, psychiatrických, imunitních a neurodegenerativních. •Založeno pouze na statistickém vyhodnocení Toxoplasma gondii – cesty šíření •Tkáňové cysty, oocysty - perorální infekce Toxoplasma gondii – cesty šíření •Tachyzoiti - transplacentární infekce, transfuze, transplantace, kozí mléko… Zvířata §bez kliniky x klinika §domácí, volně žijící, zoo zvířata §ovce, kozy - aborty, ekon. ztráty §mořské vydry, antilopy, manul - úhyny http://www.zivapriroda.sk/wp-content/uploads/2015/03/manul.jpg Toxoplasma gondii Diagnostika - průkaz T. gondii 1 Nepřímé metody: §serologie (detekce protilátek, organismus se setkal s infekcí, titry) §LAT, IFAT, ELISA §sérum, masová šťáva Průkaz T. gondii – nepřímé metody •Latex aglutinační test (LAT, MAT) •- rychlý orientační test •Sada PASTOREX TOXO §kapka latexové suspenze (antigen T. gondii) + kapka ředícího roztoku + 15 μl krevního séra, smíchat tyčinkou, otáčet aglutinační kartu, po 5 až 7 min - aglutinace Průkaz T. gondii – nepřímé metody •Nepřímý imunofluorescenční test (NIFR, IFAT) §sklíčka s antigenem T. gondii + ředěné sérum (1:40, 1:50..) - vazba antigen-protilátka §vazba konjugátu (Ab s s fluoresceinem) na protilátky §immunofluorescenční mikroskop • •pozitivní •negativní Průkaz T. gondii – nepřímé metody •Enzymová imunoanalýza (ELISA) §Destičky s antigen T + ředěné sérum – vazba antigen-protilátka §vazba konjugátu (protilátka IgG konjugovaná křenovou peroxidázou) §spektrofotometr - detekce peroxidázové aktivity na substrátu = barevný produkt •pozitivní •negativní P8040018 Průkaz T. gondii – přímé metody Flotace §založena na vyšší specifické váze flotačního roztoku (cukerný roztok) než parazitárních útvarů §po centrifugaci vyplavou parazitární útvary ve zkumavce na hladinu Průkaz T. gondii – přímé metody Mikroskopie §barvené otiskové preparáty §histopatologie •Otiskový preparát – mozeček •Otiskový preparát – slezina Průkaz T. gondii – přímé metody Experiment, izolace §biologický pokus (Balb myši) §buněčné kultury (Vero) •T. gondii oblast TGR1 E •1 - velikostní standard, 2 - pozitivní kontrola (194 pb), 3 - pozitivní vzorek, 4 - negativní kontrola IMG_1434[2421]111 •1 - 100 bp velikostní standard, 2 - virulentní kontrola (kmen P-CZ), 3 - avirulentní kontrola, 4 -izolát K24 Molekulární metody §PCR, PCR/RFLP, genotypizace •T. gondii oblast TGR1 E •1 - velikostní standard, 2 - pozitivní kontrola (194 pb), 3 - pozitivní vzorek, 4 - negativní kontrola Ducks_and_poultry Ø kozy 66 % (n = 251) Bartova a Sedlak 2013 Ø ovce 59 % (n = 547) Bartova et al. 2010 Ø kočky 44 % (n = 286) Sedlak a Bartova 2006 Ø prasata 36 % (n = 551) Bartova a Sedlak 2011 Ø psi 26 % (n = 413) Sedlak a Bartova 2006 Ø pštrosi 25% (n = 298) Bartova et al. non published Ø koně 23 % (n = 552) Bartova et al. 2010 Ø drůbež 12 % (n = 1108) Bartova et al. 2009 Ø skot 10 % (n = 546) Bartova et al. 2015 Ø králíci 5,5 % (n = 902) Neumayerova et al. 2014 Protilátky u domácích zvířat v ČR (2006-2015) jelen_lesni_Cervus elaphus2 Protilátky u volně žijících zvířat v ČR (2006-2016) fallow 2211 lw2 Ølišky 100 % (n = 80) Bartova et al., 2016 Øprase divoké 40 % (n = 656) Racka et al., 2015 • 26 % (n = 565) Bartova et al. 2006 Øpřežvýkavci 32 % (n = 720) Bartova et al., 2007 Øexot přežv. 31 % (n = 184) Bartova et al., 2017 Øzajíci 20 % (n = 333) Bartova et al. 2010 Ødrobní savci 3 % (n = 240) Machacova et al. 2016 •Zajíci vysoce vnímaví k infekci – úhyny po exper. infekci !! Léčba a prevence T. gondii •Lidi §zabezpečit dětské hřiště §dodržovat hygienu (kočičí záchodky, ovoce, zelenina, prkýnka v kuchyni při práci se syrovým masem…) §konzumovat tepelně opracované masné výrobky !! • tepelné opracování masa (min 67 °C 10 min / -12 °C 48 h) • nasolení (> 2% soli 1 den) •Prevence • •Zvířata §zamezit přístup koček (hlodavců, ptáků) do chovu §podestýlka, krmivo, voda, pastva – bez oocyst §krmit masem bez TC (labor. myši, hovězí) • Neospora caninum •nonsporulated oocyst •sporulated •oocyst •Intermediate host •infected fetus •contaminated food and wated •trasfer of tachyzoites through placent •definitive •host •tissue cysts •Infection with tissue cysts Neosporóza – u zvířat §není zoonóza, ale protilátky byly zjištěny i u lidí Zvířata §domácí, volně žijící, zoo zvířata §skot – aborty §psi - oční a nervová forma §léčba, prevence http://www.aspenvetservice.com/fastfacts/image002.jpg Encephalitozoon cuniculi Encephalitozoonoza – u zvířat •Králíci - postižení nervového systému s poruchami rovnováhy a vychýlením hlavy na jednu stranu • •jedná se o zoonózu! http://teddyhome.nl/wp-content/uploads/2015/02/max-003.jpg •Možnosti spolupráce se statistiky? Statistika Vzorkování (sampling) §předem vypočítat počty odebíraných vzorků (dle celkového počtu zvířat, využití statistik ministerstva zemědělství..) §problém spolupráce s chovateli, myslivci… §nedostatečné údaje pro statistické zpracování Data pro statistické zpracování §celkový počet a počet pozitivních zvířat ØJaká je prevalence? ØStatisticky významné rozdíly v prevalenci dle různých faktorů? ØZávislosti, korelace, modely? Statistika Ověřování hypotéz – toxo/neo/encef pozitivita (ne)záleží na: Øvěk (různé věkové kategorie) Øpohlaví (samec x samice x kastrát) Ørůzné státy, kraje, lokality, farmy, velikost farem Øroky a roční období Øplemeno, velikost plemen (např. psů) Øvyužití (pet, jatečné, práce..) Østáj x pastva Øpřítomnost definit. hostitelů, domácích zvířat Øtyp krmiva, co loví (masožravci/býložravci) Øklinické příznaky x bez příznaků…. Statistika – toxo, neo u skotu,ČR Kraj Počet vzorků N. caninum (cELISA) T. gondii (ELISA) Pozitivní (%) % I Pozitivní (%) p-value OR 95%CI Střední Čechy 185 2 (1.1%) 78 and 85 19 (10%) 0.774 1.091 0.604; 1.971 Plzeň 147 1 (0.7%) 47 12 (8%) 0.444 0.770 0.392; 1.509 Ústí nad Labem 125 0 (0%) – 18 (14%) 0.046 1.841 1.003; 3.380 Liberec 43 0 (0%) – 4 (9%) 0.916 0.944 0.324; 2.753 Hradec Králové 30 0 (0%) – 0 (0%) 0.064 0 – Praha 11 0 (0%) – 0 (0%) 0.270 0 – Karlovy Vary 5 0 (0%) – 0 (0%) 0.460 0 – Celkem 546 3 (0.5%) 47 – 85 53 (9.7%) •STATISTICA Cz 10, OR – odds ratio, 95% CI (confidence interval) Pohlaví Počty koní IFAT (%) cELISA (%) Chi-square test, df, p-valuea Samice 315 5 (1.6 %) 32 (10.2 %) IFAT (1.67, df = 3, p = 0.434, cELISA (13.28, df = 2, p = 0.0013) Samec 182 5 (2.8 %) 11 (6 %) Kastrát 146 5 (3.4 %) 27 (18.5 %) Věk (roky) IFAT (2.64, df = 3, p = 0.4507), cELISA (1.30, df = 3, p = 0.7281) < 1 – 4 105 3 (2.9 %) 10 (9.5 %) ≥ 4 – 9.5 196 3 (1.5 %) 27 (13.8 %) ≥ 9.5 – 15 178 4 (2.3 %) 20 (11.3 %) ≥ 15 – 34 111 5 (4.5 %) 13 (11.7 %) neznámo 53 0 0 Plemeno IFAT (7.76, df = 7, p = 0.3541), cELISA (23.40, df = 7, p = 0.0015) Appaloosa 34 1 (2.9 %) 5 (14.7 %) Ponny 59 3 (5.1 %) 6 (10 %) Quarter horse 62 2 (3.2 %) 12 (19.4 %) Salernitano 30 0 0 Sella Italiana 92 2 (2.2 %) 3 (3.3 %) Trrotters 71 0 2 (2.8 %) kříženci 60 0 7 (11.7 %) další plemena 111 5 (4.5 %) 18 (16.2 %) neznámo 124 2 (1.6 %) 17 (13.7 %) Statistika – toxo, neo u koní v Itálii Statistika – toxo u oslů v Itálii Coefficient Std Error z P -1.98 0 0.9998 Pohlaví (samec) -17.0 -0.002 0.9980 Věk (roky) -0.709 -2.011 0.0443 0.01 Plemeno kříženci -1.37 -2.277 0.0228 0.01 Sicilian-Grey 1.15 1.569 0.1167 Martina-Franca -381 -0.667 0.5047 Amiata -18.0 -0.004 0.9964 Ragusano 0.176 0.192 0.8479 Sardinian -18.5 -0.005 0.9963 Využití Mléko 1.19 -0.004 0.9999 Pet 1.58 -0.002 0.9998 Chov 17.9 -0.007 0.9944 Přítomnost psů -0.28 1.05 0.1750 Přítomnost přežvýkavců -0.31 1.21 0.0980