J. Vondráček Stavba živočišné buňky Náplň předmětu STAVBA ŽIVOČIŠNÉ BUŇKY (základní přehled strukturních prvků živočišných buněk; variabilita živočišných buněk; přehled specializovaných buněčných organel živočišných buněk významných z pohledu fyziologických regulací – lysozómy, peroxizómy) – J. Vondráček Náplň předmětu BUNĚČNÉ JÁDRO A JEHO DYNAMIKA (opakování přehled struktury buněčného jádra a chromatinu; komunikace mezi složkami buněčného jádra a ostatními buněčnými organelami; variabilita buněčného jádra v živočišných buňkách) – J. Vondráček Náplň předmětu ŽIVOTNÍ CYKLUS PROTEINŮ (základní principy životního cyklu proteinů a mechanismů regulujících dynamiku těchto procesů; post-translační modifikace proteinů; procesy syntézy, transportu a degradace proteinů) – J. Vondráček Náplň předmětu BUNĚČNÝ METABOLISMUS (základní dráhy energetického metabolismu buňky a dynamická podstata jejich regulací – glykolýza, citrátový cyklus a oxidativní fosforylace, pentózový cyklus, glukoneogeneze, syntéza a degradace glykogenu, syntéza a degradace mastných kyselin v kontextu živočišné buňky; mitochondriální metabolismus a jeho regulace na úrovni buňky a mitochondrií; struktura a dynamika mitochondrií) – J. Vondráček Architektura živočišné buňky Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 5th ed., New York, Garland Science, 2008 Množství buněk v těle lidské tělo – cca 3,7 ± 0.8 × 1013 buněk (plus podobné množství bakterií) – zahrnují cca 200 různých buněčných typů; liší se svojí velikostí i v rámci uniformní buněčné populace; Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 distribuce velikostí buněk L1210 (myší lymfoblastom) Základní architektura – různé velikosti a tvary (A) prvok Giardia lamblia, (B) rostlinná buňka, (C) pučící kvasinka, (D) červená krvinka, (E) fibroblast, (F) nervová buňka (G), tyčinka (sítnice) Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 Velikosti buněčných organel Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 pro stanovení velikosti organel není důležitý jen jejich objem, ale také jejich povrch Velikost, tvar a množství buněčných organel se dynamicky mění během buněčného cyklu a dělení Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Velikost, tvar a množství buněčných organel se dynamicky mění během buněčného cyklu a dělení Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 dynamika změn endoplazmatického retikula v průběhu dělení Velikost, tvar a množství buněčných organel se dynamicky mění vlivem vnějšího prostředí (např. parciální tlak O2, množství živin), onemocnění, ve speciálních typech buněk apod. – např. kompaktní vs. retikulární (vláknité) mitochondrie: Milo et al., Cell Biology by the Numbers, New York, Garland Science, 2016 J. Comp. Neurology, 2005, 492:50 – 65 část dendritu nervové buňky potkana Membrány oddělují buněčné kompartmenty s různými funkcemi…. membrány uvnitř buňky mají dvojí význam – 1) jsou nezbytné pro aktivitu řady proteinů, které jsou na ně navázané a díky své velké ploše umožňují průběh řady biochemických reakcí, a 2) zároveň vytvářejí uzavřené kompartmenty oddělené od cytosolu, ve kterých mohou být zachovány specifické podmínky pro optimalizaci biochemických reakcí (zakoncentrování proteinů, iontů a reaktantů); jednotlivé organely obsahují transportní systémy pro import a export metabolitů, i pro transport a inkorporaci proteinů unikátních pro danou organelu; za oddělené kompartmenty jsou považovány: jádro, cytosol, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, mitochondrie, lysozómy, endozómy a peroxizómy Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. …ale buněčné organely vytvářejí funkční celek! protože membrány oddělují cytosol a organely (i vzájemně), existují mechanismy umožňující transport proteinů přes membrány – vezikulární transport (mezi topologicky ekvivalentními kompartmenty), translokace proteinů (např. do mitochondrií a ER) a tzv. „gated“ transport (RNA, proteinů přes jaderné póry) Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Endoplazmatické retikulum (ER) je přítomné ve všech eukaryotických buňkách, kde vytváří síť vzájemně propojených cisteren a válců; vnitřní prostor (kompartment) ER je zároveň napojen na jadernou membránu (je tedy propojen s prostorem mezi vnitřní a vnější jadernou membránou; ER hraje zásadní roli zejména v syntéze lipidů a proteinů, a zároveň slouží jako skladovací prostor pro ionty Ca2+ (využívané pro vnitrobuněčnou signalizaci); Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. v ER vznikají všechny transmembránové proteiny a lipidy pro většinu buň. organel – ER, Golgiho aparát, lysozómy, endozómy, sekreční vezikuly a plazmatickou membránu; vzniká v něm také většina lipidů pro mitochondrie a peroxizómy; je do něj transportována většina exkretovaných proteinů (+ ty, které jsou určeny pro ER, Golgiho aparát a lysozómy; Endoplazmatické retikulum (ER) základní funkce ER jsou podobné ve většině buněk, avšak v rámci ER rozlišujeme specializované oblasti plnící rozdílné funkce: - drsné ER s navázanými ribozómy – většinou ještě před dokončením translace dochází k translokaci proteinu do ER (kotranslační proces); - oblasti ER bez ribozómů – hladké ER – jeho podíl závisí na typu buněk; - přechodné (transitional) ER – tvorba vezikulí transportujících proteiny a lipidy do Golgiho aparátu Drsné ER cytosolové ribozómy vs. ribozómy navázané na ER Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. drsné ER v exokrinní buňce pankreatu a polyribozómy připojené k ER Hladké ER je abundantní ve specializovaných buněčných typech – např. v buňkách, kde probíhá intenzívní metabolismus lipidů (vč. např. syntéza steroidů), tvorba lipoproteinů, detoxifikační reakce – na membráně ER jsou lokalizovány biotransformační enzymy, jako cytochromy P450; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Leydigova buňka ve varlatech tvořící testosteron ER v hepatocytu Hladké ER enzymy v hladkém ER nejsou lokalizovány náhodně – jsou distribuovány podle stavby membrány a složení fosfolipidů – některé enzymy jsou lokalizovány v lipidových raftech (obohacené o cholesterol a sfingomyeliny) – příklad – cytochromy P450; Drug Metab Dispos 44:1859–1866, 2016 enzymy lokalizované v ER hrají klíčovou roli v syntéze mastných kyselin – elongace, desaturace; ER a skladování Ca2+ rychlé uvolňování iontů Ca2+ z ER hraje významnou roli v rychlé odpovědi buněk na extracelulární signály – vápníkové ionty jsou skladovány ve specializovaných oblastech ER; svalové buňky obsahují specializovaný typ ER – sarkoplazmatické retikulum; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Golgiho aparát (GA) systém cisteren a váčků zodpovědný za syntézu sacharidů (např. glykosaminoglykany pro extracelulární matrix), sorting a transport proteinů (včetně některých typů post-translačních modifikací, zejména glykosylace); Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. rekonstrukce GA – cis strana je část GA nejbližší ER Golgiho aparát (GA) cisterny GA jsou uspořádané do funkčně odlišných vrstev (obvykle 4 – 6, výjimkou jsou někteří prvoci – až 20) – ty jsou propojené kanálky (tubules); v živočišné buňce je obvykle GA blízko buněčného jádra a centrozómu; během průchodu GA prochází transportované molekuly (proteiny) sérií kovalentních modifikací – vstupují přes cis Golgi síť a z trans Golgi sítě jsou odesílány dále; mezi důležité procesy patří především glykosylace proteinů, tvorba proteoglykanů, apod. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Golgiho aparát (GA) GA hraje zásadní roli také v exocytóze –transportu materiálu ven z buňky; konstitutivní (ve všech buňkách) vs. regulovaná sekreční dráha (hormony, neurotransmitery, enzymy – ve specializovaných buňkách) – v ní jsou nejprve produkované látky uloženy v sekrečních vezikulích, které jsou uvolněny na základě signálu; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Lysozómy trans Golgi síť – sorting proteinů – transport do konečné destinace; jednou z významných destinací jsou lysozómy; lysozómy představují buněčné organely ohraničené jednoduchou membránou, obsahující rozpustné hydrolytické enzymy schopné degradovat makromolekuly; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. jsou to kyselé hydrolázy – buňky jsou proti jejich působení chráněny jednak membránou lysozómu, jednak tím, že i v případě úniku nejsou tyto enzymy při normálním pH aktivní; složení lysozomální membrány je unikátní – obsahuje vysoce glykosylované proteiny – chráněny před působením proteáz, a transportní proteiny přenášející finální produkty (aminokyseliny, cukry a nukelotidy) do cytosolu; Lysozómy lysozómy představují velmi heterogenní skupinu organel – liší se tvarem i velikostí – identifikovány pomocí specifických protilátek či na základě přítomnosti specifických enzymatických aktivit; heterogenita je dána různými funkcemi, které plní (odbourávání debris, destrukce fagocytovaných mikroorganismů, tvorba živin pro buňku) i důsledkem jejich vzniku; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. fúzováním s pozdními endozómy dochází ke vzniku endolysozómu, z nějž po rozkladu většiny pohlceného materiálu opět vzniká lysozóm – proces maturace lysozómů (cyklus); u některých typů buněk může probíhat i lysozomální exkrece (např. melanocyty takto uvolňují pigmenty z tzv. melanozómů); tvorba exozómů? Lysozómy materiál pro degradaci je do lysozómů „dopravován“ několika způsoby: - endocytóza (příjem extracelulárních makromolekul) - fagocytóza (specializované buňky – neutrofily, makrofágy – velké částice, mikroorganismy) - makropinocytóza – nespecifický příjem tekutin, částí membrány či částic spojených s membránou - autofagie – degradace proteinů a organel přímo z cytoplazmy Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Lysozómy pro funkci lysozómů je klíčová doprava lysozomálních hydroláz z trans Golgi sítě do lysozómů (prostřednictvím endozómů); poruchy – lysozomální onemocnění (lysosomal storage disease – cca 70) – skupina vzácných dědičných metabolických poruch – akumulace nerozložených substrátů v lysozómech; nejzávažnější je I-cell disease – v důsledku absence téměř všech hydrolytických enzymů; Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002. Propojení ER, GA a lysozómů přímé – prostřednictvím vezikulárního transportu i přímým propojením membrán; zároveň ale jeden kompartment může být zdrojem pro vznik dalších organel, nebo napomáhat při jejich proliferaci – např. ER může být zdrojem peroxizómů, nebo se podílet na proliferaci dalších organel (např. mitochondrií); Mikrotělíska - peroxizómy velmi malé organely ohraničené pouze jednou membránou; neobsahují DNA ani ribozómy (na rozdíl od mitochondrií); mají velmi různorodé složení enzymů – souvisí s plněním různých funkcí v různých typech buněk The Cell. Fawcett D.W. Philadelphia: W. B. Saunders Company; 1981 nemají výrazné strukturní rysy, ale (zejména v játrech některých živočichů ) mohou obsahovat tzv. nukleoid – enzym urikázu (přeměna kys. močové na alantoin) Úloha peroxizómů v buněčném metabolismu peroxizómy obsahují enzymy, které využívají kyslík k odebrání atomů vodíku za současné tvorby H2O2; RH2 + O2 → R + H2O2 díky tomu obsahují také velké množství katalázy – enzymu, který umožňuje účinné odstraňování H2O2 – buď za spotřeby dvou molekul peroxidu, nebo katalyzováním reakce s dalšími substráty – kys. mravenčí, formaldehyd, etanol apod. (zejména v játrech a ledvinách); 2 H2O2 → 2 H2O + O2 H2O2 + H2R → 2H2O + R hlavní funkce peroxizómů – katabolismus mastných kyselin – beta oxidace mastných kyselin za tvorby acetyl CoA (u živočichů tato reakce probíhá také v mitochondriích); Úloha peroxizómů v buněčném metabolismu vedle -oxidace probíhají v peroxizómech také další důležité reakce: - syntéza fosfolipidu plazmalogenu – zásadní pro tvorbu myelinu a tedy pro izolaci neuronových vláken; - anabolické funkce – syntéza žlučových kyselin, kys. dokosahexaenová (DHA); - tvorba a odbourávání kyslíkových radikálů – redoxní metabolismus; Úloha peroxizómů v buněčném metabolismu Hlavní metabolické dráhy v peroxizómech The main enzymes involved in the peroxisomal fatty acid beta-oxidation pathway are indicated in light orange. The peroxisomal fatty acid betaoxidation pathway can handle different substrates (indicatedby distinct colors), including very long chain fatty acids (sVLCFA, unVLCFA (green)), dicarboxylic acids (DCA (blue)), the bile intermediates DHCA and THCA (dark red), and pristanic acid (magenta), which are imported into peroxisomes by the different ABCD transporters as indicated. The peroxisomal enzymes involved in alpha-oxidation of phytanic acid (purple) are indicated in yellow. The peroxisomal enzymes involved in plasmalogen synthesis (black) are indicated in purple. The peroxisomal enzymes involved in bile acid synthesis (dark red) are indicated in bright and light orange. The peroxisomal enzyme involved in glyoxylate detoxification (brown) is indicated in red and catalase required for H2O2 degradation in green. Abbreviations: ACAA1= 3-ketoacyl-CoA thiolase, ACOX1=Acyl-CoA oxidase 1, ACOX2=acyl-CoA oxidase 2, ABCD1=ABC transporter D1, ABCD2=ABC transporter D2, ABCD3=ABC transporter D3, AGPS=alkyl-dihydroxyacetonephosphate synthase, AGT = alanine-glyoxylate aminotransferase, AMACR = 2-methylacyl-CoA racemace, BAAT = bile acid–CoA:amino acid N-acyltransferase, brAcyl= branched-acyl, CA= cholic acid, CAT = catalase, CDCA= chenodeoxycholic acid, DBP = D-bifunctional protein, DCA = dicarboxylic acids, DHAP= dihydroxyacetone phosphate, DHCA=dihydroxycholestanoic acid, FAR1=fatty acyl reductase 1, GNPAT=dihydroxyacetonephosphate acyltransferase, HACL1=2hydroxyphytanoyl-CoA lyase, LBP=L-bifunctional protein, PHYH=phytanoyl-CoA 2-hydoxylase, PrDH=pristanal dehydrogenase, SCPx=SCPx, sVLCFA=saturated very long chain fatty acids, THCA=trihydroxycholestanoic acid, unVLCFA = unsaturated very long chain fatty acids. H.R.Waterham et al. BBA 2016, 1863: 922–933 Původ a tvorba peroxizómů otázka původu a vzniku peroxizómů není dosud zodpovězena zcela přesvědčivě; vedle mitochondrií představují hlavní buněčné organely, kde je spotřebováván kyslík – původně snižovaly vnitrobuněčnou koncentraci kyslíku? – jejich funkci převzaly mitochondrie, ve kterých je kyslík spotřebováván v souvislosti s tvorbou ATP oxidativní fosforylací – peroxizómy tak vykonávají především metabolické funkce, které neprobíhají v mitochondriích; Tvorba peroxizómů peroxizómy vznikají zejména růstem a dělením existujících peroxizómů; jinou možností je jejich tvorba de novo z prekurzorů peroxizómů vznikajících ze specializovaných částí ER – ty se postupně vyvinou ve zralé, metabolicky aktivní peroxizómy díky importu peroxizomálních proteinů z cytoplasmy; BBA 2016, 1863: 922–933 Transfer peroxizómů v průběhu buněčného dělení v průběhu rozdělení buněk dochází také k dělení peroxizómů – zprostředkováno jejich vazbou na cytoskelet – obě dceřinné buňky získávají část původních peroxizómů a není tak nutná jejich syntéza de novo; Curr. Opin. Cell Biol. 2016, 41: 73–80 Peroxizómy v organismu živočichů množství peroxizómů v jednotlivých typech buněk se liší – velké množství se nachází zejména v buňkách, které jsou vysoce metabolicky aktivní nebo se podílejí na odbourávání škodlivin – např. hepatocyty; u některých druhů živočichů se navíc množství peroxizómů dynamicky mění s tím, jak potřebují využívat např. katabolismus mastných kyselin: např. u některých hlodavců může dojít k rychlé indukci proliferace peroxizómů působením ligandů receptorů pro peroxizómové proliferátory (PPAR) – ty jsou aktivovány např. nenasycenými mastnými kyselinami; Am. J. Pathol., 2004, 164: 2305–232 játra kontrolní myši játra myši po aplikaci ligandu PPAR – Wy-14,643 Poruchy peroxizómů a vrozená onemocnění peroxizómy hrají klíčovou roli v metabolismu a jsou nezbytné pro normální fungování organismu; defekty genů kódujících peroxizomální proteiny mají za následek vrozené poruchy, rozdělované na poruchy peroxizomálních enzymů a poruchy tvorby peroxizómů – značná část vrozených metabolických poruch (kombinovaná incidence 1:5000); X-vázaná adrenoleukodystrofie (porucha oxidace nevětvených mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (C25:0 a C26:0, VLFCA) v důsledku nedostatečnosti peroxizomálního enzymu lignoceroyl-CoA ligázy); Zellwegerův syndrom – mutace v genech pro peroxiny (PEX1 – 12) - snížená funkce či úplný deficit peroxizomů v buňkách mozku, játer a ledvin (postižení jedinci umírají do 1. roku); K zamyšlení živočišné buňky jsou rozrůzněny do stovek buněčných typů – dynamická proměna; stejně tak organely mohou mít velmi rozdílnou morfologii na základě toho jakou plní funkci a jak se mění okolí buňky; velikost vs. povrch organel; struktura a funkce endoplazmatického retikula; Golgiho aparát – „poštovní“ systém; lysozómy; peroxizómy jako příklad mikrotělísek – zanedbávaná energetická organela; Příští přednáška: Buněčné jádro BUNĚČNÉ JÁDRO A JEHO DYNAMIKA opakování - přehled struktury buněčného jádra a chromatinu; specializované struktury buněčného jádra; jadrná membrána; komunikace mezi složkami buněčného jádra a ostatními buněčnými organelami; variabilita buněčného jádra v živočišných buňkách