Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganismů, technika křížového roztěru, očkování do tekutého media a na pevné medium, kultivace a její podmínky. Základní pojmy •Bakteriální druh •jasně vymezená skupina navzájem přibuzných kmenů, zahrnujících typový kmen •sdílí 70% a vyšší DNA-DNA homologii komplementárních párů bází (DNA reasociace) •vykazuje, až na výjimky, shodné fenotypové znaky a současně má některé odlišné znaky od jiných skupin Kultura •mikroorganizmy kultivované v laboratorních podmínkách na živných médiích •Čistá (jeden druh) x smíšená (několik druhů) x technická (výskum, provoz) •Přeočkovávaní – přenos kultury na čerstvé médium (oživení, izolace, odečet vlastností, diagnostika) •Bakteriální kolonie = klon jedné buňky https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/refphoto/g60_tsa_ecoli_25922_hugo.jpg Izolace bakteriálního kmene •= získání čisté kultury •Mohou se využít selektivní média – vyroste jen daný taxon •Metoda izolace = Křížový roztěr opostupné zřeďování původní kultury za účelem zisku jednotlivých kolonií (klony jedné buňky). V místě hádku – rostou už jen jednotlivé kolonie (kmeny), které pak hodnotíme http://www.crackling.com.au/wp-content/uploads/2013/07/E_-coli-6.jpg Na jaká média kultury očkovat? •Ve cvičení pracujeme s čistými kulturami získanými z České sbírky mikroorganismů, kultivujeme podle jejich podmínek •Kmeny z prostředí - snažíme se dodržet pro ně přirozené podmínky (koncentrace soli, živiny, teplota) •Zvažujeme aspekty růstu kultury (pracujeme s čistou či smíšenou kulturou?), zvažujeme limit živin, kyslíku, typ kultivace (stacionární, kontinuální), homogenitu růstu; odlišně bude probíhat růst v tekutém médiu a na agaru (jiná distribuce živin, kyslíku) • Kultivace •Kultivace - předstupeň izolace, identifikace, stanovení citlivosti na ATB... •Typy kultivace – pro kultury v tekutém médiu: oKontinuálně •chemostat - růstová rychlost kultury je v něm řízena koncentrací limitující živiny, která je přítokem nového média dodávána oStaticky •Submerzní kultivace - třepaná nebo vzdušněná (promícháváním se zvětšuje plocha fázového rozhraní a může probíhat efektivnější výměna plynů) o Nároky na teplotu •termofilní – optimum cca nad 55 °C; extremní termofily rostou kolem 100°C •mezofilní mikroorganizmy o optimum růstu 20 - 40 °C o většina bakteriálních druhů; parazitické mikroorganizmy o Pseudomonas (ale některé její druhy mohou růst i při nízkých teplotách v lednici (4°C)! •psychrofilní mikroorganizmy ooptimum růstu méně než 20 °C ooceány, jeskyně; mohou růst i v ledničce! – např. pseudomonády, aeromonády, listerie •Nároky na tlak – barofilní, barotolerantní •Nároky na živiny ozdroj uhlíku • heterotrof – organické látky • autotrof – CO2 ozdroj energie • fototrof –světelná energie • organotrof – organické látky • litotrof – anorganické látky •Nároky na redoxpotenciál, pH • Vztah MO ke kyslíku •Aerobní •Fakultativne anaerobní (aerobně je to pro ně výhodnější energeticky ale nevadí jim anaerobné prostředí) •Anaerobní oStriktně – obligátně anaerobní (kyslík je zabíjí) oAerotolerantní (přežijí nízke koncentrace, ale O2 NENÍ akceptor elektronů) •Mikroaerofilní – třeba určité % O2, je akceptor • FAN – nevadí im anaerobne prostredie, ale kde je prítomný kyslík, zapnú si energeticky výhodnejší aerobný metabolizmus AN – kyslík ich zabíja Aerotol – vedia rásř v nízkych konc. Kyslíka, ale O2 není ich konečný akceptor elektrónov Mikroaer – Třeba im určité percento kyslíka, je akceptor Růstová křivka •grafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace •(1) Lag fáze •(2) Fáze zrychleného růstu – fáze fyziologického mládí •(3) Log fáze – logaritmická – exponenciální •(4) Fáze zpomaleného růstu •(5) Fáze stacionární •(6) Fáze odumírání Diauxie •postupné využití substrátu • (např. nejdříve využije • jednoduchý zdroj – glukóza • → první vrchol; • potom teprve nastartuje metabolizmus k využití složitějšího substrátu – laktóza • →druhý vrchol) Uchovávání bakterií •je nutné zajištění životaschopnosti •na Petriho misce při 4 °C (krátkodobě, nutno přeočkovávat) •ve zkumavce v agaru ve vpichu – měsíce •na šikmém agaru v lednici při +4 °C – týdny •na porézních materiálech - želatinových discích, kuličkách •lyofilizované – lyofilizace = vymražení vody ve vakuu sublimací vody •zmražené na – 70 °C po malých objemech v hlubokomrazicím boxu (měsíce, roky) •boxy s pevným CO2 – suchý led (- 78 °C) •Kryoprezervace - reverzibilní anabióza, neprobíhají biochemické procesy •zamražení kultur v tekutém dusíku (až - 196°C) nebo v jiných plynech (He, Cr, H), uchovávání neomezeně dlouho Postup •Všechny zkumavky i Petriho misky popíšeme fixou (druh, kmen, datum, své iniciály). • •Aseptická práce!! Žíhat hrdla a kličky!!! Misky otevírat co nejméně!!! • •Každý pracuje sám – 3 misky, 1 šikmý agar, 1 tekuté médium. • •Do dvojice 6 zkumavek s 5 ml bujonu, každá zkumavka různé pH 4–9. • •Do dvojice 5 zkumavek s 5 ml bujonu, každá zkumavka různým podílem soli (g/L, NaCl): 1, 3, 5 (základní medium), 7, 9. • • Tekuté půdy •Popsat sklo •Zapnout kahan, ožíhat kličku, nechat zchládnout •Nabrat kulturu – tak ¼ kličky •Malíčkem otevřít vršek, ožíhat zkumavku •Kličku těsně nad okraj hladiny, na stěnu zkumavky, postupně vmíchat do média •https://www.youtube.com/watch?v=NV0TlN0DpPw (od 0:30) • • • Šikmý agar: •Popsat sklo •Vyžíhat kličku a nechat zchládnout •Nabrat ¼ kličky •Malíčkem vršek, ožíhat zkumavku • „hádek“ na šikmý agar odspodu • Petriho misky •1. křížový roztěr - čistá kultura •https://www.youtube.com/watch?v=AaG3Pt3nwLQ •2. křížový roztěr směsná kulura G+ a G- •3. misku rozdělit na čtvrtiny a hádek od okraje ke středu Křížový roztěr http://photos1.blogger.com/blogger/3757/4063/1600/M_BI_ES_19.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/38/Chocolate_agar_1.jpg http://i.ytimg.com/vi/_1KP9zOtjXk/maxresdefault.jpg Kultury •G- o• Escherichia coli CCM 3954 (fakultativně anaerobní) o• Pseudomonas fluorescens (aerobní) o•Serratia marcescens CCM 303 (fakultativně anaerobní) •G+ o• Kocuria rosea CCM 839 (aerobní) o• Micrococcus luteus CCM 169 (aerobní) o• Bacillus cereus CCM 2010 (fakultativně anaerobní) o• Staphylococcus aureus SA 812 (fakultativně anaerobní) •kvasinky o• Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní)