Cytologie 2 Aleš Hampl 2019 • Mitochondrie • Lyzosomy + Peroxisomy • Buněčné inkluze • Cytoskelet • Úprava buněčného povrchu • Buněčný cyklus, dělení buňky a diferenciace buněk organely inkluze cytoplazma cytoskelet základní cytoplazma buňka karyoplazma (jádro) Mitochondrie 1 • ve všech buňkách vyjma erytrocytů • dvojmembrána • průměr cca 0,5 mm • délka až 20 mm • oxidativní metabolismus (glukóza – ATP + CO2 + H20) • cytochrom c – aktivace apoptické dráhy • původ ve vajíčku • mtDNA (cirkulární) • hnědá tuková tkáň – produkce tepla • obě membrány s nízkou fluiditou • obě membrány osazeny mnoha proteiny • růst a dělení mitochondrií Mezimembránový prostor Mitochondrie 2 Mitochondrie 3 s kristami s tubuly (v endokrinních steroidy produkujících buňkách) mitochondrie mikrotubuly Mitochondrie 4 Lyzosomy 1 endozomo-lyzosomový systém • ve všech buňkách vyjma erytrocytů • váčky cca 0,05 – 0,5 mm • obdány membránou • uvnitř kyselé prostředí (cca pH 5) • uvnitř enzymy (min. 50 typů) • označení manózo-6-fosfátem Lyzosomy 2 primární x sekundární • primární • sekundární (fagolyzosomy a autofagické vakuoly) • reziduální tělíska (lipofuscin) sekundární lyzosomy Lyzosomy 3 Peroxisomy • strukturně podobné lyzozomům • průměr cca 1 mm • funkčně příbuzné mitochondriím • „jádro“ = nukleoid • odbourávání mastných kyselin (H202, H2O, 02) • detoxifikace (doplňují funkce SER) • vznik: pučení z ER nebo dělení peroxisom lyzosom nukleoid Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 1 • sekreční granula • zásobní látky: cukry (glykogen), tuky • krystaly (bílkoviny) • pigmenty: endogenní (autogenní a hematogenní) + exogenní Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 2 Sekreční granula Sekreční granula Golgiho aparát Drsné ER Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 3 Lipidové inkluze Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 4 Glykogen β-granula (epitel) α-granula (játra) Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 5 Glykogen Glykogen v buňkách jater (světelný mikroskop; periodic acid-Schiff reakce) Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 6 Krystaly Bílkovinné inkluze v Leydigových buňkách Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 7 Pigmenty (barevné inkluze): Exogenní x Endogenní • Autogenní Specifické funkce – melanin • Hematogenní Rozklad hemoglobinu – hemosiderin, biliverdin, bilirubin Pigment z opotřebování lipofuscin - akumulace residuálních tělísek v dlouhožijících buňkách (neurony, kardiomyocyty) Cytoskelet 1 Mikrotubuly Intermediární filamenta Mikrofilamenta (aktinová) 25 nm 10 nm 7 nm mikrotubuly mikrofilamenta - aktin Cytoskelet 2 Mikrofilamenta (aktinová) G-aktin (globulární) F-aktin (fibrilární) • různé izoformy aktinu (a, b, g) • rychlá polymerizace a depolymerizace • polarizace (+ a – konce) • stabilizace asociovanými proteiny (tropomyosin – myofibrily) • síťování asociovanými proteiny (fimbrin, filamin, …) • ukotvení do membrány (vinculin, tallin, …) • kortikální aktin – membránový skelet Cytoskelet 3 Mikrotubuly • duté válce • a-tubulin + b-tubulin – dimery • rychlá polymerizace a depolymerizace • polarizace (+ a – konce) • MAP (proteiny asociované s mikrotubuly) • MTOC – mikrotubuly organizující centrum (centrozom; g-tubulin) • mechanická podpora • transport uvnitř buňky • dělící vřeténko • řasinky a bičíky • mitotické jedy (kolchicin, taxol, …) a-tubulin b-tubulin Cytoskelet 4 Mikrotubuly - motory Kinesiny • pohyb k „plus“ konci mikrotubulů • transport směrem od centrozomu Dyneiny • pohyb k „mínus“ konci mikrotubulů • transport směrem k centrozomu • transport axonem na dlouhé vzdálenosti Cytoskelet 5 Intermediární filamenta • „chemicky“ velmi heterogenní skupina • stejná stavba (tetramery) tvořící “lanko“ • stabilnější než aktinová a tubulinová vlákna • specifické pro buněčné typy: Cytokeratin (epitely) Vimentin (buňky mezenchymového původu) Desmin (svalové buňky) Neurofilamenta (neurony) Gliový fibrilární kyselý protein (neuroglie) Laminy (jaderný obal) Cytokeratinová intermediární filamenta ve stratum basale epidermis Buněčné povrchy 1 volný povrch laterální povrch bazální povrch Volný • mikroklky (nepravidelné, pravidelné – žíhaná kutikula, kartáčový lem) • cilie (řasinky) Laterální mezibuněčná spojení: • těsná=okluzní: zonula occludens • adhezní: zonula adherens, desmosom • komunikační: nexus Bazální • fokální adheze • hemidesmosomy • bazální labyrint Buněčné povrchy 2 Volný povrch lidských embryonálních kmenových buněk rostoucích v in vitro kultuře Mikroklky Buněčné povrchy 3 Mikroklky (microvilli) Pravidelně uspořádané mikroklky = žíhaná kutikula = kartáčový lem Aktinová filamenta v mikroklcích • 20 v mikroklcích epitelových buněk • několik set ve stereociliích vláskových buněk Tloušťka cca 0,1 mm Délka 1-6 mm Buněčné povrchy 4 Mikroklky (microvilli) žíhaná kutikula (apex enterocytů) kartáčový lem (proximální kanálky ledviny) Gluten - Celiakie Buněčné povrchy 5 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky Tloušťka cca 0,25 mm Délka 7-10 mm Osové vlákno – Axonema 20 mikrotubulů (9x2 + 2) Dyneinová raménka (pohyb) Buněčné povrchy 6 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky Bazální tělísko Centriol 9 x 3 Buněčné povrchy 7 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky ve světelném mikroskopu v elektronovém mikroskopu Buněčné povrchy 8 Kinocilie = Řasinky vejcovod Mikroklky sekrečních buněk Řasinky řasinkových buněk Mezibuněčné spoje 1 laterální povrch bazální povrch Adhezní Těsnící Komunikační • Macula adherens (desmosom) • Zonula adherens • Hemidesmosom • Fokální adheze • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) • Gap junction (nexus) Spojovací komplex Mezibuněčné spoje 2 Adhezní • Macula adherens (desmosom) • Zonula adherens • Hemidesmosom • Fokální adheze ECM plic v oblasti alveolů Jednotná stavba • Transmembránové proteiny (cadheriny+ integriny) • Adaptorové (plakové) proteiny • Vlákna cytoskeletu buňka-buňkabuňka-ECM Mezibuněčné spoje 3 Adhezní • Macula adherens (desmosom) Průměr cca 0,3 mm Mezera mezi membránami cca 20-40 nm Mezibuněčné spoje 4 Adhezní • Hemidesmosom • Fokální adheze Epidermolysis bullosa Mezibuněčné spoje 5 • Fokální adheze bazální lamina Mezibuněčné spoje 6 Bazální labyrint Mezibuněčné spoje 7 Těsnící • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) Poškození: Clostridium perfringens Helicobacter pylori (ZO-1) Mezibuněčné spoje 8 Těsnící • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) Mezibuněčné spoje 9 Komunikační • Gap junction (nexus) Průměr cca 0,3 mm Mezera mezi membránami cca 3 nm Otvor spojovacího kanálku cca 2 nm Mezibuněčné spoje 10 Komunikační • Gap junction (nexus) Životní projevy buněk • Pohyb – intracelulární, amoeboidní, řasinky, bičíky • Metabolismus – příjem, zpracování, výdej • Dráždivost • Růst • Diferenciace • Rozmnožování (dělení) Zygota Mnohobuněčné embryo Dynamický mnohobuněčný organismus Dělení buněk & Specializace buněk Dělení buněk & Specializace buněk DIFERENCIACEBUNĚK MNOŽENÍBUNĚK Množení x Diferenciace buněk 1 Zygota Mnohobuněčné embryo Dynamický mnohobuněčný organismus STABILNÍ GENOM Genomická ekvivalence (= stejné množství DNA a stejná nukleotidová sekvence ve všech buňkách organismu – klonování) VARIABILNÍ TRANSKRiPTOM Regulátory transkripce X Množení x Diferenciace buněk 2 + další regulace: • translace • posttranslační modifikace Množení x Diferenciace buněk 3 Kmenové buňky • pomalé dělení (obvykle) • multipotentní Progenitorové buňky • „transit amplifying cells“ • rychle se dělí • multipotentní Terminálně diferencované buňky • nedělí se Obnova a regenerace tkání Oligodendrocyt Astrocyt Neuron „Široká nabídka“ kmenových buněk Kmenové buňky generují a regenerují naše tělo 1. Nediferencovaný růst 2. Diferenciace Schopnost vytvářet diferenciované/funkčně specializované buňky Pluri-/Multi-potence Schopnost vytvářet identické kopie Sebeobnova Odlišné vlastnosti Fetální Orgánové Tkáňové Embryonální kmenové buňky „Dospělé“ kmenové buňky Indukované pluripotentní kmenové buňky Nádorové kmenové buňky Kmenové buňky lze nalézt, vyjmout z tkáně a zkoumat 1 Collect lung Chop lung Enzymatic digestion Differential centrifugation Lung epithelial organoids Mesenchymal cells Single-celled lungepithelialcells Culture in non-adherent conditions Enzymatic digestion Primary spheres Secondary spheres Enzymatic digestion Culture in 3D Matrigel / collagen Culture in 3D Matrigel Kmenové buňky lze nalézt, vyjmout z tkáně a zkoumat 2 KB plic po izolaci Rostoucí sféroid z KB plic „lungosféra“ Základní koncept 1 MITÓZA a CYTOKINEZE produkují dvě geneticky identické buňky Dělení buněk 1 STABILNÍ (NEMĚNNÝ) GENOM Udržuje se prostřednictvím semikonzervativní duplikace DNA Kondenzovaný duplikovaný chromozom chromatida centromera telomera telomera Dělení buněk 2 ho homologní páry chromozomů duplikace duplikace nesesterské chromatidy sesterské chromatidy sesterské chromatidy chromozom s jednou chromatidou chromozom s jednou chromatidou otcovský chromozom mateřský chromozom Metabolismus chromozomů – Homologní chromozomy Dělení buněk 3 Páry homologních chromozomů (2N) organizované do podoby „KARYOTYPU“ Dělení buněk 4 Základní koncept 2 MITÓZA a CYTOKINEZE jsou částí buněčného cyklu Buněčný cyklus • má semi-modulární charakter • je vybaven kontrolními body • mezi buňkami je koordinován růstovými faktory G1 START M S kontrolní bod DNA replikace kontrolní bod poškození DNA G2 kontrolní bod metafáze (SAC) G0 Dělení buněk 5 Interfáze začíná v dceřinné buňce G1 S G2 Chromozómy kondenzují, začíná se tvořit dělící vřeténko Chromozomy se seřazují v metafázní (ekvatoriální) rovině Chromatidy se přesunují k protilehlým pólům vřeténka Formují se nová jádra a chomozomy začínají dekondenzovat Dělí se cytoplazma a vznikají dvě nové buňky Dělení buněk 6 centrozóm kinetochorové mikrotubuly kinetochora chromatida astrální mikrotubuly polární mikrotubuly Mitotické vřeténko „mrak“ proteinů centrioly aster Mitotické vřeténko Dělení buněk 7 Separace centrozomů Duplikace centrozomů Zrání centrozomů Segregagce centrozomů Metabolismus centrozomů Semikonzervativní duplikaceDělení buněk 8 Průměr – 0.2 mm Délka - 0.5 mm 1 2 3 4 56 7 8 9 Dělení buněk 9 Struktura centrozomů Modifikováno z katalogu firmy Santa Cruz Biomedicals, USA Dělení buněk 10 Regulace – Cyklin-Dependentní Kinázy (CDK) + Cykliny Periodicita exprese cyklinů Dělení buněk 11 Dělení buněk 12 profáze metafáze Dělení buněk 13 anafáze -telofáze telofáze Děkuji za pozornost !