Histologie a Embryologie Přednášející: Doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc., přednosta ústavu RNDr. Petr Vaňhara, Ph.D. Brno, 2019 Lecture 1 Úvod • Předmět a význam histologie, její členění. • Hraniční oblasti histologie. • Historie, současnost a budoucnost histologie. Cytologie • Buňka: definice, obecná stavba, kompartmentalizace. • Buněčné jádro: ultrastruktura a funkční význam, chromosomy, jadérko. • Endoplasmatické retikulum • Golgiho aparát • Centrosom Histologie Mikroskopická a submikroskopická struktura těla (buňky, mezibuněčná hmota, tekutiny) Mikroskopická anatomie Složení a struktura orgánových systémů & individuálních orgánů Jaké typy tkání a jak jsou organizovány? Jaké speciální buněčné typy? Které speciální struktury? (např. tubuly) Jak to celé funguje? Cytologie Struktura buňky a její vztah k funkci. Obecná histologie Jaké jsou základní typy tkání? Jaké jsou jejich funkce? Jakými buněčnými typy jsou tvořeny? Toto vše je odrazem hierarchické struktury mnohobuněčných organismů Histologie není statickou disciplínou, která se zabývá výhradně strukturou !!! Histologie Buněčná biologie Fyziologie Patologie Biochemie Molekulární biologie Anatomie Embryologie Spojme si histologii s akcí a pohybem Mysleme „histologicky“ Studium histologie se poprvé stalo povinným v roce 1893 na John’s Hopkins Medical School ! Mnoho velkých histologů byli Němci, protože vyráběli kvalitní mikroskopy. Eponymously theirs….. Marcello Malpighi 1628 - 1694 Italský lékař Zakladatel mikroskopické anatomie a první histolog • Popsal chuťové pohárky • Popsal krevní kapiláry • Možná první, kdo viděl v mikroskopu červené krvinky Malpigiho vrstva kůže Stratum basale a stratum spinosum epidermis kůže Malpigiho tělíska v ledvinách a slezině Hlavním přispěním k histologii bylo popsání Lieberkuhnových krypt se žlázami v tenkém a tlustém střevě Johan Nathanael Lieberkuhn 1711 - 1756 Německý anatom a lékař Jan Evangelista Purkyně 1787 - 1869 Český fyziolog • Pionýr histologických technik Poprvé použil přístroj podobný současnému mikrotomu • Zavedl termín plasma • Popsal Purkyňova vlákna v srdci • Popsal Purkyňovy buňky v kůře mozečku Schwann + Schleiden – 1839 – buněčná teorie “Once the development was ended, the founts of growth and regeneration of the axons and dendrites dried up irrevocably. In the adult centers, the nerve paths are something fixed, ended, and immutable. Everything may die, nothing may be regenerated. It is for the science of the future to change, if possible, this harsh decree.” Santiago Ramón Y Cajal 1852 - 1934 Španělský lékař a anatom Poprvé popsal neuron jako primární strukturální a funkční jednotku nervové tkáně. Nobelova cena v roce 1906 Neočekávané objevy Existence multipotentních sebeobnovujících se progenitorů v postnatálním a dospělém nervovém systému • Subventrikulární zána laterálních komor mozku • Subgranulární zóna v gyrus dentaus hipokampu BEZPOCHYBY V: • Kůra koncového mozku ? • Amygdala ? MOŽNÁ V: (od časných 90-tých let) Náš pohled na organizaci centrálního nervového sytému se dramaticky změnil !!! Mnoho otázek o kmenových buňkách v CNS stále zůstává k zodpovězení Je nutná kombinace přístupů vývojové biologie, histologie, buněčné biologie a molekulární biologie. • přesná pozice ve tkáni ? • proliferační a migrační aktivita ? • vývojový potenciál ? • participace na vzniku chorob CNS ? • další Gleason et al., Neuroscience, 2008. Má tento objev nějaké praktické užití ? (1) Pomoc mozku regenerovat po infarktu Podpořit endogenní neurogenezu a zlepšit tak histologickou stavbu a funkci Jin et al., Brain Research, 2011. • experiment na krysách • infarkt mozku vyvolán uzavřením mozkové arterie • do místa infarktu transplantovány lidské neurální progenitory • histologicky analyzováno Možnosti: • chemická léčiva • růstové faktory • implantace buněk Jin et al., Brain Research, 2011. 3 měsíce 24 měsíců Transplantované lidské buňky v místě infarktu HuN – jádra lidských buněk DCX – doublecortin (marker časné neuronální linie) HuNHuN Neurogeneza v SVZ krysího mozku je stimulována DCX DCX Bez transplantace Transplantované buňky Neocytogeneza probíhá před 60-tým dnem po transplantaci Pulzní značení BrdU ve dni 60 po transplantaci Má tento objev nějaké praktické užití ? (2) Transplantace buněk & tkání Badell et al., J. Clin. Invest., 2010 Neexistuje trvalá léčba – Transplantace ? - Imunosuprese Diabetes Deregulace metabolismu glukózy Poškození b buněk ostrůvků slinivky břišní Přežívající ostrůvky Rejekované / poškozené ostrůvky IHC Insulin - hnědá Glukagon - modrá Haematoxylin & Eosin Lymphocyte function–associated antigen 1 (LFA-1) Krátkodobé ošetření protilátkou proti LFA-1 Princip náhrady tkání a orgánů není nový, současné medicíně se však nabízí nové postupy postavené na pochopení struktury a funkce tkání Egyptská mumie Tkáňové inženýrství 1 První zpráva o vytvoření 3D vaskularizované srdeční tkáně, která může být použita ke studiu vývoje a funkce srdce a také (snad v budoucnu) k transplantační léčbě Caspi et al., Tissue Engineering of Vascularized Cardiac Muscle From Human Embryonic Stem Cells, Circulation Research, 2007 (group of Shulamit Levenberg, Israel) (zůstaňme u infarktu) Histologická a funkční analýza Endoteliální buňky Lidské kmenové buňky diferencované in vitro do kardiomyocytární linie 3-rozměrný polymerní nosič (lešení) Fibroblasty Zkombinovány dohromady Kardiomyocyty Kardiomyocyty + Endotelie Kardiomyocyty + Endotelie + Fibroblasty Troponin I Sarkomerický aktinin CD 31 Markery srdeční svaloviny Markery endotelu cév Caspi et al., Circulation Research, 2007 Tkáňové inženýrství 2 Caspi et al., Circulation Research, 2007 Myofibrily Z proužky T tubuly Sarkoplasmatické retikulum Gap junctions Conexin – Gap junctions Troponin - cardiomyocyty Ultrastrukturální charakteristiky uměle vytvořené tkáně srdce Vedení impulzů 1-Heptanol Uměle vytvořená tkáň srdce má schopnost vést impulzy Ca2+ Laserová skenovací konfokální mikroskopie (Rozpojuje Gap junctions) Tkáňové inženýrství 3 Histologické metody studia buněk a tkání 1 Učinit pozorovatelným Stabilizovat struktury Fixace Učinit objekty menšími – prostupnými pro světlo Zalití + Příprava řezů Zviditelnit struktury „Barvení“ Zvětšit Použití mikroskopů Světelné (optické) mikroskopy (interakce fotonů s hmotou) Rozlišení 0.1 mm • Pouze s viditelným světlem • S fluorescenčním světlem • Konfokální laserový skenovací mikr. Elektronové mikroskopy (interakce elektronů s hmotou) Rolišení až 0.1 nm (v praxi 1 nm) • Transmisní • Skenovací Fixace (denaturace) • Organická rozpouštědla (etanol, metanol, aceton,…) • Aldehydy (form-, paraform-, glutar-aldehyd, …) • Organické kyseliny (octová, pikrová, …) • Soli těžkých kovů (rtuť, chrom, osmium, …) Zalití + Krájení (řezy) • Parafinový vosk • Celloidin (=nitrát celulózy) • Durcupan (syntetický polymer) • LR White (syntetický polymer) • jiné „Barvení“ Chemická přehledná barviva (H+E, Azan, van Gieson, …) Histochemické reakce (průkaz proteinů/enzymů, lipidů, cukrů, …) Imunochemické reakce (značené protilátky) Ťěžké kovy (pro TEM – soli uranu, olova, wolframu, …) Histologické metody studia buněk a tkání 2 Pochopení komplexních systémů musí stát na pochopení struktury a funkce jejich součástí Tkáně Buňky Buňky Buňky Tekutiny Extracelulární matrix Vše je produktem buněk ! Tekutiny • Intersticiální tekutina • Plazma (krev) • Lymfa (v lymfatických cévách) • Cerebrospinální mok • Intracelulární tekutina (cytosol) Živé organismy jsou tvořeny buňkami Dlouhá cesta k tomuto odhalení: Robert Hooke 1665 Poprvé viděl buňky korku - cell Antonie van Leeuwenhoek 1678 Poprvé uviděl mikroskopické organismy (bakterie, prvoky) Rudolph Virchow 1855 Buňka může vzniknout pouze z již existující buňky „Omnis cellula e cellula“ Matthias Schleiden Theodor Schwann Všechny organismy jsou tvořeny jednou nebo více buňkami 1839 Současná buněčná teorie – 6 principů na kterých stojí • Buňka je nejmenší strukturní a funkční jednotka schopná životních procesů • Funkce každé buňky je dána její specifickou strukturou • Buňky jsou stavební jednotky všech mnohobuněčných organismů, všechny funkce v organismu jsou plněny buňkami • Struktura a funkce všech organizmů je závislá na strukturálních a funkčních vlastnostech buněk, kterými jsou tvořeny • Všechny nové buňky vznikají z buněk již existujících • Díky kontinuitě života na zemi jsou buňky všech organizmů principiálně stejné (univerzální genetický kód a jeho exprese) Svalové vlákno Neuron Nervosvalové spojení Anafáze Telofáze Přes jednotné organizační schéma, je typickou vlastností eukaryontních buněk jejich strukturální a funkční diverzita Také buňky člověka jsou strukturálně a funkčně extrémně rozmanité Vajíčko Spermie Neuron v mozku Tuková buňka Buňka sliznice střeva Buňky krve Buňka svalu Buňka kosti Tato různorodost je předpokladem pro schopnost buněk plnit v organismu člověka specializované funkce Žádná buňka není zcela stejná jako buňky ostatní, všechny buňky ale mají společné strukturální a funkční znaky. Ne všechny buňky obsahují všechny komponenty, o kterých budeme mluvit ! Buňky mají 3 hlavní součásti: 1. Plazmatickou membránu 2. Cytoplazmu 3. Jádro (eukaryontní b.) 1 2 3 Organizace buňky je postavena na KOMPARTMENTALIZACI Specializované funkce se mohou plnit v různých sektorech buňky Membrány tvoří hranice mezi jednotlivými kompartmenty Unikátní proteinové a lipidové komponenty a unikátní funkce Unikátní kontrola pohybu molekul Unikátní složení obklopeného prostoru Kompartmenty & Membrány Mnoho malých kompartmentů je lepší Více plochy pro: • regulaci • výměnu živin • odstranění odpadních látek Větší plocha membrány na obklopený objem Plocha povrchu je proporcionální se čtvercem poloměru (r2). Objem je proporcionální se třetí mocninou poloměru (r3). Zmnožení X Redukce vybraných kompartmentů Diferenciace buněk Specializace buněk pro různé funkce Drsné ER v sekrečních buňkách Mitochondrie v buňkách srdeční svaloviny Struktura biologické membrány 1 ~2.5 nm ~2.5 nm 7-10 nm ~2.5 nm Elektron denzní Elektron opakní Elektron denzní Membránová jednotka společná všem membránám Buněčné membrány viděné elektronovým mikroskopem (pseudokolorováno) Fluidní mosaika – Dvojvrstva lipidů s mobilními globulárními proteiny Polární fosfolipidové zbytky Cholesterol Nepolární fosfolipidové zbytky Hydrofilní segment Hydrofobní segment Struktura biologické membrány 2 Membránové lipidy Představují 90-99% molekul v membráně (v počtech). • Fosfolipidy - 75% • Cholesterol - 20% • Glykolipidy - 5% - pouze cytoplazmatická membrána - GLYCOCALYX Membránové proteiny Představují 1-10% všech molekul, ale 50% hmotnosti díky jejich velikosti. Přenos signálůTransport Identita buněk Adheze buněk Enzymatická aktivita PeriferníIntegrální + Struktura biologické membrány 3 Organely Ohraničené membránou • Endoplasmatické retikulum • Golgiho aparát • Lyzosomy • Endosomy • Peroxisomy • Mitochondrie Specializované vnitřní struktury se specializovanými funkcemi Bez membrány • Ribosomy • Centrosomy • Centrioly • Bazální tělíska Vztah mezi strukturou buňky a její specifickou funkcí Např.: potřeba hodně energie  hojnost mitochondrií Jádro 1 obalem ohraničená struktura Jádro jaterní buňky Nejčastěji: • Sférické (5-10 mm) (lobulární, prohnuté, diskovité,…) • Uloženo centrálně • Jedno v buňce (osteoklast více, erytrocyt žádné) Jádro Perinukleární cisterna Lamina Membránová jednotka 20-50 nm 80-100 nm Vnější j. membrána Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka Jádro 2 Jaderný obal - pokračování Laminy: • Intermediární filamenta - proteiny (A, B, C) • Tvoří síť na vnitřní straně vnitřní jad. membrány, pronikají i do nukleoplazmy • Udržují pevnost a architekturu jádra • Ukotvují chromatin • Regulují replikaci DNA a tranksripci rRNA • Účastní se regulace apoptózy Laminopatie • Lidské choroby (nejméně 13 známých) • Mutace v genech pro laminy (popsáno asi 200 mutací) • Deregulace exprese genů • Předčasné stárnutí Hutchinson-Gilford progerie Vzácná - 1-4 na 8 milionů porodů Missense mutace v laminu typu A Perinukleární cisterna Lamina Membránová jednotka 20-50 nm 80-100 nm Vnější jaderná membrána Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka Jádro 4 Chromatin Heterochromatin Feulgen positivní – tmavé ve světelném mikr. Tmavé/denzní granula v TEM Transkripčně inaktivní Euchromatin Světlejší ve světelném mikroskopu Relaxované chromosomy Transkripčně aktivní Interfázové jádro 2 nm Dvojšroubovice DNA 30 nm Vlákno chromatinu – seskládané nukleosomy Jádro 3 Komplex jaderného póru Průměr ~ 100 – 125 nm Tři kruhy (každý 8 podjednotek) Vnitřní vláknitý košík Distální kruh Jaderný kruh Cytoplazm. kruh Transport jadernými póry (Nukleocytoplazmatický přesun) • Proteiny, RNA, podjednotky ribosomů • Oboustranný • Vyžaduje jaderné lokalizační/exportní signály • Podporován importiny/exportiny • Regulován Ran GTPázami Jádro 5 Jadérko jadérkojaderná membrána nucleoplazma cytoplazma Není ohraničeno membránou Hlavní funkce Syntéza RNA Skládání ribosomů Pars fibrosa Primární transkripty rRNA Pars granulosa Skládání ribosomů NOR – nukleolární organizátor (na DNA) V lidských buňkách na 5-ti chomosomech (chr. 13, 14, 15, 21, 22) Endoplasmatické retikulum 1 „uvnitř buňky“ „síť“ Většina membrán uvnitř buňky. Vzájemně propojené kanálky a váčky Cisterny Hladké ER Drsné ER Ribosomy Jaderná membrána Velká podjednotka ribosomu Malá podjednotka ribosomu Endoplasmatické retikulum 1 Bez ribosomů  Nemá proteosyntetickou funkci ! Syntetizuje fosfolipidy a cholesterol • Játra – metabolismus lipidů a cholesterolu, degradace glykogenu, detoxifikace (spolu s ledvinami) • Varlata – syntéza steroidních hormonů (testosteron) • Buňky střeva – absorbce, syntéza, a transport lipidů • Kosterní a srdeční svalovina – ukládání a uvolňování vápníku (sarkoplasmatické retikulum) Drsné ERHladké ER 200 nm • Syntéza všech sekretovaných proteinů • Syntéza integrálních proteinů membrán • Modifikace proteinů Cytosol Ribosomy Cisterny endoplasmatického retikula Ribosomy Endoplasmatické retikulum Volné ribosomy Vázané ribosomy Ribosomy Schéma ribosomu Velká podjednotka Malá podjednotka ribosomy mRNA 100 nm POLYRIBOSOM (klastr ribosomů překládající určitý úsek mRNA) mRNA 5` AUG 3` START kodon 3`UAC 5` Met-tRNA Začátek translace mRNA 5` UAG 3` Konec translace mRNA 5` UAA 3` mRNA 5` UGA 3` STOP kodony váží „uvolňující faktor“E P A 5` 3` směr čtení mRNA = směr pohybu ribosomů po mRNA kodony Aminoacyl tRNA Volné tRNA Rostoucí polypeptidový řetězec Ribosomy - Translace Golgiho aparát Cis Trans Centrosom Průměr – 0.2 mm Délka - 0.5 mm 1 2 3 4 56 7 8 9 Děkuji za pozornost ! ahampl@med.muni.cz Budova A1 – 1. patro Přednášky histologie Klíčové prvky mikroskopické stavby tkání a orgánů a jejich vztah k funkci Nejnovější objevy v oblasti struktury a obnovy tkání a jejich vztah ke vzniku a léčbě chorob