Antropologie a moderní trendy v biologii Jaroslav PETR petr@vuzv.cz VÚŽV v.v.i. SmallCrazyScientist pharmcorn Biotechnologie n„Jakákoliv technologie využívající za specifickým účelem biologické systémy, živé organismy a jejich produkty k tvorbě nebo proměně produktů či procesů.“ n nOSN Smlouva o biodiversitě n CabbageFarmer File:Kiszona kapusta.JPG Pěstování zelí a jeho kysání – biotechnologie? Biotechnologie biotechnology nTěží z mnoha vědních oborů nGenetika nMolekulární biologie nBuněčná biologie nMikrobiologie nBiochemie nEmbryologie n aj. Biotechnologie n Dolly_Sheep GFP%20mice stem-cell-3 Genetické modifikace Klonování ESC a buněčné terapie Přinášejí biotechnologie zásadní zvrat? nOtvíráme Pandořinu skříňku? pandora Before%20these%20crowded%20streets%202 Člověk mění svět cc-fileds rainforestinthenight clovekvzprimeny global-common-330x220-ents-snapshots-disk06-127-man-in-black-suit-intent orellana la_br_amazon_461 tp_01 tp_04 Panenské pralesy? Francisco de Orellana 1500 – 1549 1541-2 - splutí Amazonky deníky Gaspara de Carvajal Změna rostlin a zvířat domestikací n Maize-teosinte cattle, Bos spp. (Artiodactyla: Bovidae) auroch270 Schopenhauer%20photograph n„Všechny zásadní objevy procházejí třemi etapami. Nejprve jsou zesměšňovány, následně zuřivě popírány, aby byly nakonec přijaty jako naprostá samozřejmost.“ n Arthur Schopenhauer n knife_sheath5 112cromagnon Lascaux__rotsschild_oerossen_prof_Sacx 06_lightning_rod Benjamin Franklin gm_Ben_Franklin_03_10 [USEMAP] strana_03_Prokop_Divis nČerven 1752 Edward Jenner - 1798 n history_7 Edward_Jenner_book Od poklidných protestů… n greenpeace_gm_rice_protest_rotterdam_harbour … přes politické a právní kroky … n JudgeLamberth stemcellImage2 … po násilí n luddisti 7875 1789 1999 ALF-W 2004 article-1204747-05F5E51B000005DC-468_634x467 2009 Snahy omezit nebo zakázat biotechnologie n n n nZvláště silné v EU nGenetické modifikace nKlonování savců nEmbryonální kmenové buňky Dolly_Sheep Lidé poměřují rizika a přínosy n balance_scale SWNS_CAR_CRASH_070013039 Významný přínos vyváží i velká rizika nČR 2017 n103 821 dopravních nehod n502 lidí usmrceno n2339 lidí zraněno těžce n24740 lidí zraněno lehce nHmotné škody 6,3 mld. Kč couch-potato Pro pohodlí se vystavujeme smrtelným rizikům nVšichni vědí o negativním vlivu pasivního životního stylu na lidské zdraví a přesto roste počet obézních a následně i počet lidí s cukrovkou druhého typu, rakovinou a kardiovaskulárními chorobami. Významný přínos vyváží i neznámou míru rizika nUžívání mobilních telefonů se bouřlivě rozvíjelo i v době, kdy Světová zdravotnická organizace nebyla s to dát jednoznačnou záruku, že záření nemá negativní vliv na lidské zdraví. cell_phone mutant_morgan dae-nevada_bomb Technologie mohou být snadno odmítnuty nNení zjevný přínos pro konkrétního spotřebitele nJejich princip je komplikovaný nV povědomí lidí jsou spojovány s negativními fenomény spy super_market Veřejnost nSnadno podléhá emocím nJe přístupná jednoduchým „příběhům“, které jsou nabízeny všemi informačními kanály nNáchylná uvěřit ve „spiknutí“ nVyžaduje důkazy „neexistence rizika“ poland-gmo-protest-poster Zájmové skupiny nNevládní organizace nPolitické strany nObchodní řetězce nVýrobci n scientist Odborníci nOdmítají se bavit s laiky nKdyž už se baví, tak odmítají přizpůsobit komunikaci veřejnosti nVysvětlení principu technologie je n složité n nezáživné nNemohou dokázat „neexistenci“ dialysis_machine_large Vzniká černobílé vidění - nepodložené fakty nPřírodní vs. Umělé nPřírodní je „dobré“ nUmělé je „špatné“ nALE nPřírodní katastrofa nUmělá ledvina 96829 Ekologické zemědělství chrání přírodu L1 nEkologičtí zemědělci vyselektovali n ekologickým postřikem obaleče jablečného rezistentního n k bakulovirům AppleOrchard rg83a codling-moth-larva codling_moth Ekologické zemědělství poškozuje přírodu 6%20Furrow%20Plough Konvenční zemědělství ničí přírodu n Haymaking_near_Hebden_8_July_00 stork Konvenční zemědělství chrání přírodu nV EU vynaloženy velké prostředky n na ekologické hospodaření nVědecká pozorování prokázala n - ptáci upřednostňují intenzivně obhospodařované území n - počty i druhová pestrost jsou vyšší n Co přinášejí a čím hrozí genetické modifikace? pine-forest-t Specifika genomů vyšších rostlin nRostliny mají v genomu i 25 Gbp (např. některé borovice) nGeny mají v průměru 4 kbp nPromotory 1 kbp nStrukturní geny 3 kbp nPočet genů může být vyšší než u obratlovců (pšenice asi 80 000 genů – pseudogeny) Huseníček Thalův (Arabidopsis thaliana) arabidopsis arabidopsis Jeden z nejmenších genomů mezi vyššími rostlinami. Kompletně „přečten“ - 25 498 genů callus Nediferencované rostlinné pletivo - kalus Lze pěstovat na živných půdách Vyžadují auxiny (např. kys. b indolylmáselná) cytokininy (např. kinetin) Polyploidie, aneuploidie Amplifikace i deamplifikace DNA embryo01a Z buněk vypěstované rostliny změnou přídavku růstových faktorů embryo04a jedle image6 Somatoklonální variabilita V důsledku genetických změn při kultivaci mají tyto rostliny jiné vlastnosti než původní rostlina. Dochází k selekci nejživotaschopnějších buněk. Metody genetické modifikace darkside pathprofile3a 80 mm Agrobacterium tumefaciens nPůdní bakterie nProniká do rostlin nVyvolává tvorbu nádorů nNádory rostou v kultuře bez auxinů a cytokininů bi150 Nádor produkuje: nAuxiny nCytokininy n růst nádoru nOpiny nvýživa agrobakterií n File:Mannopine.svg manopin art agrobacterium Dědičná informace A. tumefacines nBakteriální chromozom nPlasmid webfig1 Agro3 Agrobacterium tumefaciens přenáší do jaderného genomu rostliny část plasmidu The_Trojan_Horse_Mastercopy Geneticky modifikované A. tumefaciens nFunguje jako „trojský kůň“ n n„Pašuje“ námi „podvržené“ geny do genomu rostlin tsai3 Pro selekci „povedených“ bakterií nSelekční gen pro rezistenci k antibiotikům ATsystem Brightfield illuminated micrografted plant regenerated from selected GFP positive ebryoid/p-calli. Pro selekci úspěšně transformovaných rostlinných buněk nSelekční geny pro odolnost k antibiotikům nSelekční geny pro odolnost k herbicidům nMarkerové geny – např. GFP 4monmggfpuv gene_gun image17 Genové dělo http://islamicvoice.com/islamicvoice/wp-content/uploads/2014/06/virus.jpg Geneticky modifikované organismy n Organismus – samostatně se rozmnožující subjekt včetně virů s výjimkou člověka Modifikace – cílený zásah do dědičné informace, který nemůže nastat přirozenou cestou (nad 20 bp?) Geneticky modifikované organismy? http://www.republica-dominicana-live.com/upload/batata-republica-dominicana-02.jpg Pairedmoths.jpg nV zemích EU – výčet technik pro genetické modifikace n nPovijnice batátová Bourec morušový nPřenos genů z A. tumefaciens Přenos genů viry z lumčíků 1222080806_200809220172_EURMMM_1 Nové techniky nPřibývá neustále nových technik pro cílené zásahy do dědičné informace nPříslušné orgány EU nestačí rozhodovat o nových technikách n Rozhodování n Neřídí se výsledným fenotypem n Hlavní kritérium je reálná detekce n Verdikt expertů nemusí respektovat politici Verdikt Evropského soudního dvora o mutagenezi - 2018 nMutageneze je genetická modifikace nZ legislativy pro GMO je vyňata „klasická“ mutageneze – chemická, radiační nPod GMO legislativu patří „nové techniky“ včetně CRISPR-Cas9 nVe světě je mutageneze pomocí CRISPR-Cas9 považována za non-GMO n nDetekce GMO při importu do EU? Mutageneze a GMO legislativa n n n n GMO GMO non-GMO https://images.theconversation.com/files/239543/original/file-20181005-72100-8199mg.jpg?ixlib=rb-1. 1.0&q=45&auto=format&w=754&fit=clip cotton K čemu jsou genetické modifikace rostlin? nDnes pomáhají především pěstitelům nSpotřebiteli nepřinášejí přímý efekt nGM rostliny dalších generací n – přínos spotřebiteli 2192 Odolnost rostlin k herbicidům glyphosate Totální herbicid Roundup Derivát glycinu glyph2D Člověku neškodí ani dávka z 0,5 ha Ničí spolehlivě všechny vyšší rostliny 1402083 Gen pro enzym rozkládající glyfosát enzym, který mu odolá glyphc ss3 Usnadňuje pěstování – boj s plevelem IR4-2 Riziko vzniku rezistentních plevelů GResistRyegrass3 soybeans soy_field_4 Sója odolná vůči herbicidům Více než 60% ploch na světě 90% v USA oseto RR sójou U nás povolena pro dovoz a zpracování Rr_soya_ Rostliny odolné proti škůdcům poly_lar bt3 Bacillus thuringiensis bt crystal cry3a_top d - endotoxin nzásadité prostředí nodštěpení obou konců nvazba na receptor nagregace nperforace střeva Specifický účinek na danou čeleď hmyzu. budworm_6 AGcat Obaleč Choristoneura fumiferana Kanada na balzámové jedli Používá se jako ekologický insekticid obvykle směs delta toxinů fig2big maize fig1big KUKUŘICE - rozmach škůdců Zavíječ kukuřičný v roce 1990 zavijec Poškození hmyzími škůdci vyvolává napadení plísněmi ndalší škody nmykotoxiny fig4big fig5big Bt- kukuřice odolná vůči hmyzím škůdcům fig11big Je povolena k pěstování v EU. Po vstupu do EU se může pěstovat i v ČR. V roce 2008 se jí zaselo 8000 ha V roce 2012 se jí zaselo 3 050 ha It-pole-Bt-vpravo Polní pokusy - Itálie n n n n n nVýnos vyšší až o 43% nHladiny fumonisinů nižší 130krát Bt- kukuřice Konvenční kukuřice http://www.the-scientist.com/images/News/March2017/640corn.jpg Kukuřice bez aflatoxinů nProdukce siRNA pro inaktivaci genů plísní Aspergilus – potlačí produkci aflatoxinů bollworm Rizika vzniku rezistentních škůdců nRezistence je dědičná nZaložena recesivně nMusí se udržovat refugia, kde nebudou škůdci vystaveni selekčnímu tlaku nKřížením vzniknou heterozygoti, kteří jsou na Bt citliví Rezistence vzniká na všechny pesticidy T_ni JV2366a-14-300%20Plutella%20xylostella Rezistence na Bt-toxin nNa polích u Bt-plodin – byla zjištěna výjimečně u zastaralých linií bavlníku nOpakovaně vznikla po ekologických postřicích toxiny z B. thuringiensis n zápředníček polní n kovolesklec cizokrajný Cydia Rezistence obaleče na bakuloviry 1236184 1236186 7030046 bv2 nEkologičtí zemědělci nRezistence je dominantní %7B9994E638-E09E-46D5-BB31-3E8B6FEAC5B4%7DPicture Brambor Amflora n2010 - schválen pro pěstování v EU nAntisense DNA ke genu GBSS nNarušení syntézy amylózy nZměna složení škrobu nAmylóza ve stopových množstvích nVětšinu škrobu tvoří amylopektin n2012 – ukončeno pěstování v Evropě 1458725 Typical-Fatty-Acid-Composition-sized http://www2.dupont.com/Media_Center/en_US/assets/images/releases/nr_photo_high_oleic_soyoil.jpg http://4.bp.blogspot.com/-dtN_hXQNPLk/UPXZZ4VYrbI/AAAAAAAACl4/7Qm1HVb9paI/s1600/217+sorghum+bread.j pg Pro spotřebitele nPšenice E82 n bez glutenu pro celiaky n nSoja Plenish n zvýšený obsah n kyseliny olejové _1138390_rice150a plums peaches Další genetické modifikace nOdolnost k virům nZměna kvality produktů změna v obsahu a kvalitě tuků zvýšení obsahu vitamínů, AA produkce enzymů – fytáza nProdukce medikamentů nFytoremediace půdy nJedlé vakcíny n n edible_vaccines_cover Jedlé vakcíny nRočně umírají 3 miliony dětí nna choroby, před kterými nspolehlivě chrání očkování nKaždoročně se rodí 30 milionů dětí, které nemají ani základní očkování nZa 17 $ lze zajistit očkování nobrna, záškrt, TBC, černý kašel, spalničky, tetanus image18976 Mountain%20forest%20valley Jedlé vakcíny nNa některá místa nelze vakcíny dopravit nPěstování GM plodin s expresí antigenů nMístní zdroj pro vakcinaci FAO/12124/T. Feynes Boj s hladem a chudobou n1,2 miliardy lidí vydělává n méně než 1 dolar denně n800 milionů trpí hladem n6 milionů dětí do 5 let umírá n= předškolní populace Japonska Příjem energie cal/den Map7 Denní porce 1 100 milionů chronicky hladovějících lidí hlad-denniporce Dětská podvýživa Map13 afganistan-refugee-camp-family Hlavní příčiny hladu nOzbrojené konflikty nKlimatické změny nAIDS n n peshawal-kai-dr-nakamura-thinking Růst populace nNezpomalil se nDenně se rodí 250 000 dětí nPři tomto tempu přibude 1 miliarda lidí za deset let nZ toho n rozvinuté země 56 milionů n nejchudší země světa 900 milionů n ethiopia_famine052 Čerpání přírodních zdrojů - ničení biotopů 300px-Bolivia-Deforestation-EO 9 newmannedwolf Cerrado Mapa%20desmat%20Cerrado Cerrado Starving child AP Důvody hladu v Africe nAfričané potřebují k přežití výnos alespoň 1 tunu z hektaru. nPotenciál afrických polí je n 3 tuny na hektar. nTento potenciál n se nedaří naplnit. nVýnosy často klesají n pod 1 tunu z hektaru Nedostatek živin v půdě fertilizer Hnojiva jsou mnohonásobně dražší než v Evropě. Katine-farmer-woman barley-powdery-mildew Plevele, choroby, škůdci witchweed,-striga insec3 drought drought Sucho Voda je v některých oblastech stejně drahá jako umělé hnojivo Vlivy na výnosy t/ha 3 2 1 Nedostatek živin Plevele, choroby, škůdci Sucho HRANICE PŘEŽITÍ Možnost boje s hladem t/ha 3 2 1 Nedostatek živin Plevele, choroby,škůdci Sucho HRANICE PROSPERITY Místní hnojiva Nezávadná osiva a sadba Odolné odrůdy 22 rattunda-sorghum2 Nové odrůdy nKlasické šlechtění n pomalé n dostává se na hranice možností nGenetické modifikace n rychlé n zatím nejsou jasné jeho limity fig1 papaya 1998 - GM papája odolná k viru pěstuje se na Havaji a v JV Asii Rezistence k suchu nZvýšení exprese fytohormonu cytokininu brání shazování listů za sucha nRostliny snášejí dlouhodobě sucho nVystačí s 30% vody při 12% redukci výnosu nVyvíjejí se k suchu rezistentní linie –rajčata –rýže –pšenice n New transgenic tobacco (left) can survive weeks of drought. Rezistence k zasolení půd nŘepka - exprese genu AtNHX1 z huseníčku n Transport Na iontů do vakuol až do 6% sušiny nVyloučí Na z cytoplasmy nUdrží osmotický tlak n pro příjem vody nVýnos semen je n ovlivněn jen nepatrně n GOLDEN_RICE2 Boj s podvýživou „zlatá rýže“ nAvitaminóza A n- 250 milionů lidí nRočně n200 tisíc dětí oslepne n2,5 milionu lidí zemře n40 gramů „zlaté rýže“ denně pokryje potřebu nStravu obohatit o tuky nJe k dispozici 10 let nStále se nepěstuje cassava3-l Maniok nZáklad výživy - 600 mil. lidí nV Africe -250 milionů lidí (40% obyvatel) nOdolnost k virům n ročně ztráty 45 milionů tun nGen pro metabolismus škrobu z E. coli n 2,5krát větší kořeny n 2krát více kořenů - cassava GM plodiny v Africe n news509_GMmap-lg-i0 _38150237_africa_150map AFRIKA - SUCHO OD ROKU 2001 drought Opakovaná katastrofální neúroda lisutuagdeadfarmfield A malnourished child at an Ethiopian feeding station HLAD OHROZIL NA ŽIVOTĚ 20 – 40 MILIONŮ LIDÍ mothersmlchild _38339899_baby150[1] Woman in burnt down village Miliony lidí oslabených hladem zemřou na infekční choroby nNejvíce jsou ohroženy nDěti nMatky nStaří lidé The civil Zimbabwean woman sits by relief food in the Nhwali area Dovezená potravinová pomoc obsahuje GM kukuřici Zambian President Levy Mwanawasa Zambijský president Mwanawasa: „GM food is poison!" Fingerprinting at an aid centre Distribuce potravinové pomoci zastavena Workers at Port of Djibouti Důvody odmítání GM kukuřice: nFarmáři vysejí zrno z potravinové pomoci nZačne pěstování GM plodin nKontaminace exportních produktů „geny“ nKontaminace medu pylem nEU přestane dovážet nOdvolání na stanovisko BMA Monarch Vliv GM rostlin na životní prostředí ho_monarch_caterpillar_n Bt kukuřice vs. monarch stěhovavý nV laboratoři krmeny housenky monarcha klejichou poprášenou pylem z Bt kukuřice nHousenky masově hynuly Vyhubí Bt kukuřice motýla? monarch_160 Výsledky experimentů nebyly potvrzeny nHousenky se vyhýbají plevelům poprášeným pylem nŠlo o odrůdu s vysokým množstvím Bt v pylu nTato odrůda se nikdy nepěstovala na polích. Bt kukuřice mu svědčí – klesá spotřeba insekticidů. Ohrožuje ho kácení lesů v Mexiku. Trichoptera_caddisfly_1 Caddisfly-larva Bt plodiny a chrostíci nBt-kukuřice nZ polí se uvolňuje Bt-toxin do potoků nV laboratoři se ve vodě s Bt-toxinem nedaří larvám chrostíků nZnamená to, že v okolí polí s Bt-kukuřicí vymírají chrostíci? nJsou chrostíci v potocích u kukuřičných polí? waxmot4 bee Bt-plodiny a včely nPovinně se testuje, zda nektar či pyl Bt-plodin neškodí včelám nNebyl prokázán negativní vliv nBt-proteiny nejsou cíleny na blanokřídlý hmyz nPozitivní vliv na potlačení zavíječe voskového 3944037-lg bracon1 Bt-plodiny vs. parasitoidi a predátoři nParasitoidů a hmyzích predátorů může být v porostech Bt-plodin méně, protože je tam méně hmyzích škůdců nNení však přímý vliv na četnost a druhovou pestrost parasitoidů a hmyzích predátorů 199812-054-Soil-Bacteria Bt-plodiny vs. půdní mikroorganismy nMikroorganismy nTěžké posoudit – neznáme je nMění se v závislosti na mnoha faktorech n Půda, počasí, plodina, odrůda, agrotechnika, sezóna aj. nTyto výkyvy jsou větší než změny vyvolané pěstováním Bt-plodiny Worm-land-Lumbricus%20terrestris springtails-on-leaf-2-small Bt-plodiny vs. půdní makroorganismy nMakroorganismy nNapř. hlístice, stinky, chvostoskoci, roztoči, kroužkovci nJejich četnost a druhové složení se s pěstováním Bt-plodin mění nJiné faktory ale způsobují ještě větší změny – např. osevní postupy, změny odrůdového složení aj. Britské studie biodiverzity 13growing4 maize http://lachlan.bluehaze.com.au/summer2000/11july2000/11jul039.jpg Vliv pěstebních postupů GM plodin odolných k herbicidům na biodiverzitů polí. 13growing4 GM řepa nMéně plevelů nMéně včel nMéně semen nMéně semenožravých brouků nMéně ptactva nVíce chvostoskoků a jejich predátorů http://lachlan.bluehaze.com.au/summer2000/11july2000/11jul039.jpg GM řepka nMéně plevelů nMéně včel nMéně motýlů nMéně semen plevelů nMéně semenožravých brouků nMéně ptactva nVíce chvostoskoků a jejich predátorů maize GM kukuřice nVe všem lepší než tradiční kukuřice nTradiční kukuřice postihuje biodiverzitu mnohem více než jakákoli jiná plodina nPlatí i po zákazu atrazinu 13growing4 GM řepa nS jinou agrotechnikou a jinou organizací porostů. nVýrazně vyšší biodiverzita rostlin i živočichů na poli a v okolí než u porostů konvenční řepy. Klasické plodiny už vytlačily planě rostoucí druhy nVojtěška – Švýcarsko nRýže - Tajwan 0108116 Medicago falcata wild%20rice05 Oryza rufipogon 0108116 Medicago falcata wild%20rice05 F264Medicago_sativa Klasické plodiny už vytlačily planě rostoucí druhy Medicago sativa 12 nVojtěška – Švýcarsko nRýže - Tajwan Oryza sativa smpigwd Laskavec Amaranthus hybridus railroad Vznikají spontánně např. železniční náspy ATRAZIN Riziko vzniku rezistence proti herbicidům u plevelů Vznik mezidruhových hybridů Figure 1: Waterhemp (left) generally lacks hairs on stem and leaf surfaces. Hybrid plants (center) typically possess characteristics of each parent and can be difficult to identify under field conditions. Smooth pigweed (right) has hairs on both stem and leaf surfaces. Laskavce Vznikají spontánně Je to přirozený mechanismus vzniku nových druhů. Řepka a planá brukev http://lachlan.bluehaze.com.au/summer2000/11july2000/11jul039.jpg ruebsen Výskyt hybridů ve Velké Británii Celkem 50 000 hybridů Wild turnip on river bank University of Reading Rape field and wild turnip University of Reading Brukev hojná u řek Často v těsném sousedství polí s řepkou bee_pollen_macro pollen Hybridizace a introgrese nDochází k přenosu pylu? nDochází ke křížení? nVznikají životaschopné hybridy? nVytváří hybrid stabilní populaci? nKříží se hybridy s původním druhem? nKříží se opakovaně? nPřináší nový gen selekční výhodu? 060115_glowing_pig_02a Genetické modifikace živočichů n danielkeyes 77310-004-22D51DC0 algernon Od Algernon … (1959) Daniel Keyes mouse …k Doogie (1999) n n n n n n n Zvýšení skóre v myších „IQ testech“ 5x n tsien2 Joe Tsien hobbie-j Hobbie-J (2009) Pamatuje si 3x déle nČinnost genu NR2B n v mozku s věkem slábne nZásah do dědičné informace - posílením funkce genu NR2B v mozku nOmlazení mozku 1321064 Metody tvorby geneticky modifkovaných savců microinjection 37 Brinster palmiter Mikroinjekce do prvojádra zygoty retrovirus retroviruslarg Retroviry oocytes greennails Andi ORPRC link MT-metaspindle Mikroinjekce retrovirového vektoru do zralého oocytu Mikroinjekce retrovirového vektoru do embrya nKosman bělovousý (2009) n Model pro lidské choroby nVýhody oproti makakům n vyšší reprodukce n kratší generační interval Lentivirové vektory nHraboš prérijní zinc finger Zinc finger nukleázy zif268dna Zinc finger nukleázy n„Zinkové prsty“ - zhruba 30 AA držených zinkovým iontem nObjeveny v roce 1986 nSoučást transkripčních faktorů nUrčují místo vazby na DNA n – tři báze v DNA na jeden „prst“ nKombinace tří „zinkových prstů“ stačí na určení specifického místa v genomu nNavedou na něj nukleázu nTa dimeruje a štípne DNA nNastartují reparační procesy nHomologní rekombinací se zabuduje dodaná sekvence – frekvence homologní rekombinace roste na 1:1000 Zinc finger - nukleázy n zinc-finger-editing Zinc finger - nukleázy nMikroinjekce do embrya nLze provést cílený knockout nLze dosáhnout homologní rekombinace glowing_ratties 320px-Xanthomonas_leaf_spot xanthan2 TALEN nBakterie Xanthomonas ovládá geny hostitelské rostliny speciálními bílkovinami -transkripčními aktivátory. Ty se vážou na zcela určité sekvence v genomu hostitelské rostliny. TALEN nPro určení specifické sekvence v modifikovaném organismu se vytváří speciální protein n transcription-activator like (TAL) efector protein konstruovaný podle proteinů (transkripčních aktivátorů) bakterie Xanthomonas TALENy nPro štěpení DNA se na Tal efektorový protein naváže nukleáza Fok1 n n n n nPři injekci mRNA do cytoplasmy zygoty účinnost knockoutu kolem 75 % Systém CRISPR-Cas RGN CRISPR/Cas9 nProkaryotní „imunitní systém“ n40 % bakterií n90 % archeí Systém CRISPR-Cas nSynteticky připravené crRNA nCílí na specifické místo genomu RGN CRISPR/Cas9 http://speakingofresearch.files.wordpress.com/2011/02/zebrafish.jpg http://www.infiniteunknown.net/wp-content/uploads/2010/12/GM-Mouse.jpg Systém CRISPR-Cas nKO i homologní rekombinace nRNA – snazší příprava a nižší cena nLze připravit crRNA pro libovolné sekvence nVysoce specifické – n rozliší rozdíl i v jediné bazi nVysoce účinné – 90 % n na obou chromozomech n několik zásahů najednou Systém CRISPR-Cas PIIS0092867414000798 image nSimultánní vyblokování n2 genů ni homozygotně 2013 - makak F3.large CRISPR-Cas aktivace a suprese genů nNefunkční Cas9 – neštípe DNA, ale slouží jako nosič pro represor ncrRNA nasměruje represor do blízkosti cílové sekvence DNA F3.large CRISPR-Cas aktivace a suprese genů nNefunkční Cas9 – neštípe DNA, ale slouží jako nosič pro aktivátor ncrRNA nasměruje aktivátor do blízkosti cílové sekvence DNA – zahájí transkripci mRNA n CRISPR-Cas base editing n nNefunkční Cas9 - nosič cytidin deaminázy (C mění na U) ncrRNA nasměruje deaminázu na cílový C nDNA repair – opraví komplementární bázi nPři replikaci DNA se U nahradí za T n 09417-notw1-scheme Nature 2016 Base editing nModifikovaný Cas9 (Dead Cas) nikáza https://www.abmgood.com/Enzymes/images/Cas9-D10A-Nickase-01.jpg IMAGE Modifikovaný TadA gRNA Modifikovaný Cas9 - nikáza Base editing nPřepis A na G nNení přírodní enzym – modifikovaný TadA nPřepíše adenin na inosin (čte se jako G) nNick nastartuje mismatch-repair n http://www.sciencemag.org/sites/default/files/styles/inline__450w__no_aspect/public/1027NID_BaseEdi ting_Final_Drupal700p.png?itok=rGgfBct7 Base editing nBase editing na RNA http://www.sciencemag.org/sites/default/files/styles/inline__450w__no_aspect/public/1027NID_BaseEdi ting_Final_Drupal700p.png?itok=rGgfBct7 Mutagenní řetězová reakce MCR nVyblokování druhé alely z 97 % Ethan Bier Ethan Bier UC San Diego Valentino Gantz Valentino Gantz Science -2015 Mutagenní řetězová reakce MCR nPři křížení s nemutovanými homozygoty mají kříženci vyblokované oba geny n (nad 95 %) nPokud je nositelem mutace 1% jedinců, převládnou nositelé mutace v populaci za 10 generací nOtázka biologické bezpečnosti Allelic drive nEditace na 2 místech genomu (2x gRNA) n1. přenos gene drive n2. vyřazení škodlivé alely a její náhrada prospěšnou alelou (CRISPR-rezistentní) n https://media.eurekalert.org/multimedia_prod/pub/web/197955_web.jpg Nature Commun. 2019 http://media.npr.org/assets/img/2016/01/19/img_4086-2a3a5f0f573a8760561ef08e1d5b466b49acfe5d-s900-c 85.jpeg Potenciální využití n n n nZměny u přenašečů infekcí n Komár Aedes aegypti n Rezistence k zimničce n Snížená plodnost samic n Potenciální využití nZvrácení rezistence nu škůdců (Bt plodiny) n Global status of field-evolved resistance to Bt crops. Planting of Bt crops globally and field-evolved resistance. Potenciální využití nSnížení životaschopnosti invazních druhů n http://www.fws.gov/midwest/endangered/images/mussels/ZebraMusselsLakePepinByMNDNR.jpg Potenciální využití nZvýšení odolnosti užitečného hmyzu k negativním vlivům n (opylovači a insekticidy) n http://www.pollinator.ca/bestpractices/images/bees%20in%20hive%20shutterstock_5466952.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/84/Imidacloprid.png Imidacloprid Potenciální využití nLaboratorní modely nPro získání organismů s žádoucím genotypem - bude třeba n méně jedinců n https://www.sciencenews.org/sites/default/files/sn-2015/121215_CRISPR_mosquito_NEW.png Rizika gene drive nPotenciál zásahu celé populace nNavozuje ireverzibilní změny nNechtěné vytvoření gene drive https://www.sciencenews.org/sites/default/files/sn-2015/121215_CRISPR_mendel_NEW.png Gene drive Mendelistická vloha http://cdn.defenseone.com/media/img/upload/2013/07/24/072413bioweapons/defense-large.jpg Rizika gene drive nZneužití pro bioterorismus nVnesení genů pro toxin do populace členovců sajících krev lidí či zvířat https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT8Q3GxTWnN-MyZpjiflahDPBRP_QMn1bUSjdhKDuToMfW peYEgwQ https://www.rsb.org.uk/images/SB/2013-05-07_20-27-26_606.jpg Rizika gene drive n n nDIY biology nMají k dispozici CRISPR-Cas9 nDistribuce ve formě kitů n Úmyslné vytvoření gene drive n Nechtěný vznik gene drive plate1 Spermie jako vektor ivf mouse sperm_egg_summit2 IVF spermatem s bakteriální kontaminací n nExperimentálně u myší prokázána přítomnost bakteriálních sekvencí v genomu klon1 klon2 Enukleace oocytu Přenos somatické buňky pod zonu cytoplastu Přenos jader Nuclear transfer embryo about to be activated Fusion ACT Clones Science Ian Wilmut BBC Dolly Ian Wilmut Roslin Institute Skotsko Ovce Dolly Klony domácích zvířat Cloned kitten named Cc Dolly the sheep BBC Clone, Nature Biotech Clone AP [ image: Dairy cows were a primary focus for cloning] [ image: Goats have been cloned but only females] Xena AP 1996 1998 1998 1998 2000 2001 2002 Immunohistochemistry (Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections) - GFP antibody (ab290) K čemu jsou GM živočichové? GFP%20mice 060115_glowing_pig_02a nPouhý „kapric“ biologů? Poznání funkce genů n knockout Clones lung x-rays Klony s genem pro lidský antitrypsin léčba rozedmy plic Živé bioreaktory 73_306 Polly and her sisters Srážlivý faktor VIII a IX léčba hemofilie Živé bioreaktory První lék z „živých bioreaktorů“ nAtryn n GTC Biotherapeutics nPovolen v EU 2006 n v USA 2009 nAntitrombin n Potlačení nežádoucí srážlivosti krve, n např. při operacích atyrn Spider's web RMIT BioSteel Nexia Bioscience Kanada Nové materiály Goat Nexis Silk, Nexia Biotechnologies GM kids Nexia Resilin fesem_vlo_zoom resilin Genetický knokaut prplamb brain tissue _37966750_sheep300 Genový knokaut – boj s prionovými chorobami bse-prion brain tissue Cow being burned Precautionary slaughters Donnamarie McGivern prion KO byci Skot rezistentní k BSE nHematech – USA nRIKEN – Japonsko nTexas A&M University n8 holštýnských býků nGenový KO genu pro prionový protein Zvířecí modely lidských dědičných chorob CF-pig nKO genu pro CFTR nModel pro cystickou fibrózu pig u1200b02 37 Brinster palmiter Beltsvillská prasata grchbull Knokaut genu pro myostatin Blok myostatinu a zvýšená exprese follistatinu se doplňují 4956_web 4956_web 4956_web GM pstruh duhový nBlok genu pro myostatin nFunguje i u dalších obratlovců transgenic-trout-3 grchbull Změna složení mléka prasnic piglets herman Herman – Pharming (NL) Prase s „omega-3“ ve svalech nDo genomu prasete vnesen gen fat-1 z hlístice Caenorhabditis elegans nEnzym konvertuje omega-6 polynenasycené mastné kyseliny na „omega-3“ nSe stejným genem byly modifikován i kur a ryby 57577-2 57211252 Jing Kang Harvard Medical School Hypoalergenní mléko nChybí alergenní beta-laktoglobulin n baby_drinking_bottle Daisy Daisy AgResearch NZ 01-pig3 EnviropigTM Xenotransplantace zvířecí orgány lidem nNení dost orgánů pro transplantace Surgeons remove a liver during a normal transplant operation (Image: AURORA/KATZ) pigs Pro Proti nPrasat je dost nJejich orgány mají vhodnou velikost nLze získat prasata bez patogenů nImunitní bariéra n nHyperakutní rejekce – rychlé zničení orgánu nEndogenní retroviry – riziko „děděných“ virů n n n Prasata pro xenotransplantace nVyblokování prasečích genů (alfa-GAL) nVnesení lidských genů (hDAF, CD46) PPL created genetically altered ostrich Ptáci Plate 1. A fertile egg Problémy – zvláštnosti reprodukce ptáků Za 24 hodin po ovulaci – 60 000 buněk 1320049 Metody tvorby geneticky modifikovaných ptáků Img0011L Transplantace PGC Transplantace spermatogonií Eda1 Eda Eda-spermie Img0011L Plate 1. A fertile egg retroviruslarg Retrovirové vektory 2977005 Využití geneticky modifikovaných ptáků Odolnost k chorobám Mareks_clinical_signs1 Markova choroba hens_egg_1364087c injection_syringe_01 „Zlatá vejce“ 0,1 až 1 gram bílkoviny/ vejce 250 vajec/ rok 50 000 SF / 1 gram bílkoviny Ryby giant%20chinook%20salmon%20battlecreek gata1-GFP gata1gfp egg Mikroinjekce alevin9 Transplantace PGC fishes2 Indukce růstu přenosem genu pro GH „all fish gene“ lachs_wachstum GM losos AquAdvantage 100920-salmon-hmed-3a bounty4 muir_fish William Muir Pardue University nPokusy v laboratoři nPočítačové modely nNaznačují možnost úspěchu GM ryb po úniku do volné přírody medaka GM ryby – gen pro GH nSnížená životnost plůdku nZvýšená odolnost ke kanibalismu nLepší trávení bílkovin nJsou kompetitivnější nRychlost nejasná - menší (1/2) i větší (3x) nDříve pohlavně dospívají nPravděpodobně i úspěšnější při tření nVyšší produkce pohlavních buněk medaka GM ryby vs. divoké 409781aa GM samice – 14,2 kg GM samec – 8,2 kg Divoká samice – 0,171 kg Divoký samec – 0,220 kg U kulturních linií není výrazný efekt GM 409781aa 5 cm Vliv odchovu na růst GM losos kisuča nRůstový potenciál nGM ryb se uplatní jen nv umělých podmínkách ndélka GM ryby 3násobek n nV přírodních podmínkách nGM větší o 20% n type2-big AFP aquaculture ice%20crystals GloFish1 Geneticky modifikované akvarijní ryby GLOFISH GFP – danio pruhované GFP rat1 GFP rat7 GM potkani - GFP n2011 nČIŽP ujistila výskyt GFP+ potkanů v zájmových chovech a jejich export Foto Ing. M. Těhník, ČIŽP Foto Dr. K. Angelis Máme se bát GM živočichů? nDomestikace změnila zvířata n k nepoznání wolf-photo Huny2 ruppy1 ruppy3 Máme se bát GM živočichů? n n n n n nGenetické modifikace - pokračování procesu, který začal před 10 000 roky Chytří psi n tsien2 Guide-Dog2 rescue-dog-training n n n n n n nZatím je to jen scifi, ale jednou … Chytří psi clever-dog gm-mosquito-green-eyes1 Geneticky modifikovaní komáři Postřiky insekticidy nDDT india-dengue-2010-8-28-5-0-0 Silent_Spring_Book-of-the-Month-Club_edition DDT-from-xtal-3D-vdW MosquitoLarvae Eliminace komárů-přenašečů genetickou modifkací nVypuštění sterilních jedinců nVypouštění nositelů dominantní letální vlohy nRozšíření vloh pro rezistenci komárů k původci choroby nNákaza GM symbiontem Aedes-aegypti-larvae Aedes aegypti OX513A nLarvy hynou, pokud nejsou odchovány ve vodě s tetracyklinem nOdchov velkého počtu samců nVypuštění do přírody nPotomstvo zplozené s divokými samicemi hyne v larválním stádiu nExprese červeného fluoreskujícího proteinu markers-and-monitoring Další modifikace nLétající injekce nGM komár by při bodnutí vnesl do těla člověka nebo zvířete vakcínu proti infekční chorobě mosquito_flying_syringe Camargue_fg08 Vliv na necílové organismy n robin-picture Mosquito_on_Flower Komáři jako opylovači nPodle některých odborníků plní komáři významnou roli opylovačů nPokud zmizí, poškodí to flóru n„Zloději nektaru“ ? PlatantheraHookeri25CapStGeorgeBigCoveJuly22006 Fig Vemeník (Platanthera obtusata) n nOpylení nKomár jarní (Ochlerotatus communis) Picture-7 Vypuštění do volné přírody nOxitex nAedes aegypti OX513A n nKajmanské ostrovy nMalajsie nMexiko n n beef-steak-dinner-plate Můžeme to jíst? GMO Těší se špatné pověsti n 2p4nyxs4-1348445958 rat 1348224688 Gilles-Eris Seralini Food and Chemical Toxicology 2012 sainsburys GreyLine Iceland store GreyLine 1998 – obchodní řetězec Iceland (Flintshire) zákaz GMO v prodávaných potravinách 1999 – „samozákazů“ velkých obchodních řetězců Sainsbury´s – UK Carrefour – Francie Migros – Švýcarsko Effelunga – Itálie Superquin – Irsko GMO - free ssfig_cows Ve druhé vlně – „samozákaz“ potravin z produktů zvířat krmených GMO cheese labor safe foods action.jpg not a guinea pig worcester.jpg Není to reakce na obavy zákazníků Jde o obchodní trik. GMO ve světě stále přibývá Hlavní plodiny: kukuřice, sója, bavlník Global%20GM%20map%20(2011) GMO ve světě stále přibývá n guardian_globemap_wheader_x616 Hlavní producenti: USA Kanada Argentina Čína 8031notw4 dna Kolik je DNA v krmivech a potravinách ? 0,005 až 0,02 % sušiny 8031notw4 dna „cizí gen“ 4000 „písmen“ 0,0004% DNA kukuřice GM kukuřice 8031notw4 soyflour Krmná dávka - jen kukuřice Veškerá kukuřice jen GMO broilers Hypotetický příklad: brojler Brojler zkonzumuje za celý výkrm 300 mg kukuřičné DNA + 1 mg „cizího genu“ Proč by měla kuřeti vadit „cizí“ DNA, když mu nevadí DNA kukuřice? broilers Pokud byl zjištěn efekt GM krmiva na brojlery či nosnice, pak je pozitivní fig5big CPA+OcA Neobsahují mykotoxiny Blokáda enzymu mykotoxinem DNA z potravy není jediná rumen rumen-bacteria Malt1 bakterie prvoci buňky sliznice Virus viry bowel Člověk má ve střevu n1014 ks bakterií n 5000 druhů = 1,2 kg n1200 druhů virů n? druhů prvoků n? druhů hub n atd. 816_stomach DNA se rozkládá nKyselým prostředím nEnzymy (DNáza I a DNáza II) n n85 % DNA z potravy je rozloženo nna „písmena“ genetického kódu nještě před vstupem do dvanáctníku. grain Jaká jsou rizika potravin a krmiv z GMO? Toxicita potravin a krmiv z GMO fugu I geneticky nemodifikované potraviny a krmiva obsahují toxiny. Sója – genistein Brambor – solanin GMO – toxikologicky prověřena U GMO lze snížit „přirozenou“ toxicitu. 061120-2 Genetické modifikace pro redukci toxinů nBavlna n na 1 kg vlákna n 1,65 kg semen n vysoký obsah proteinů n – terpenoid gosypol nRNA interference –klíčový enzym pro syntézu nRedukce gosypolu o 98% spacer spacer 061120-2b US_long_grain_rice Toxikologické testy nTestuje se n n 1) GM plodina n n 2) Odpovídají nemodifikovaná linie n n 3) Odpovídající nemodifikovaná linie s přídavkem produktu genetické modifikace US_long_grain_rice Čím vším se liší plodiny? nGM plodina a její nemodifikované kontroly nemohou být pěstovány ve stejných podmínkách P A R A M E T R GM K Statisticky průkazný rozdíl GM K Obvyklá variabilita US_long_grain_rice Čím se liší testovaná zvířata? nDostávají krmivo, které se liší obsahem mnoha látek, přičemž všechny rozdíly nejsou důsledkem modifikace Fyziologický ukazatel Statisticky průkazný rozdíl Fyziologické hodnoty caspi1 caspi1 GM K Alergenita krmiv a potravin z GMO kiwi Alergenní jsou i ostatní potraviny a krmiva. Alergenní potraviny – kiwi, ořechy, ryby atd. Je třeba prověřovat alergenitu krmiv snížit rizika při „zatoulání“ do potravin. „Co se dá sníst, to lidé snědí!“ GM hrách inhibitor alfa-amylázy fazolu 1135040047 Thomas Higgins 1135039118 Zrnokaz hrachový Bruchus pisorum Phaseolus Vývoj ukončen 2006 gid_03_ecoli antibiotics Šance přenosu genu na bakterie v prostředí i ve zvířeti je extrémně nízká 10 -11 až -13 / 1 kontakt vnímavé bakterie s vhodnou DNA Mutace – 1000krát pravděpodobnější Krmení a léčba antibiotiky - o několik řádů vyšší riziko! Zdrojem rezistence jsou i akvakultury ve třetím světě chponds shrimp Při současné míře migrace neexistují proti šíření účinné bariéry. macrophage Přenos genů z GMO potravy na zvíře a na člověka Výjimečně (velké množství DNA, hypometylace apod.) může malé množství zlomků DNA přejít přes střevní stěnu Pohltí je bílé krvinky. cancer%20cell,%20breast Pravděpodobnost zabudování genu do živočišné buňky n n nV genomu živočichů včetně člověka nebyly nalezeny geny vyšších rostlin. nProdukty používaných genů jsou prověřeny (toxikologicky apod.) n creatingphphotos3 Rozklad DNA při zpracování krmiv nMletí – bez efektu nLisování oleje – výrazná degradace nZahřívání – 95oC po dobu 5 minut – degradace nPára i za nízkého tlaku - degradace Nelze od sebe odlišit produkty zvířat krmených GMO od produktů zvířat krmených „GMO-free“ krmivy. milk milk „GMO-free“ krmiva a potraviny… FA_marble … jako chodit jen po bílých dlaždicích nGMO –zatím prospěch jen pěstitelům nVelký potenciál pro spotřebitele nTřetí svět – jedna z možností nVlivy na životní prostředí nKaždá zemědělská výroba ovlivňuje nJe třeba hodnotit vlivy všech technologíí Závěry: GMO pro krmiva a potraviny - testovány a schvalovány Přenos genů z krmiv a potravin na mikroorganismy - nepravděpodobný GMO jako krmiva a potraviny - bezpečné Produkty zvířat krmených GMO - bezpečné cover2 Kdo smí pracovat s GMO? Sin%20t%EDtulo1 brown GMO Ne- GMO soyflour b16-f10 sperm 2cell csoybeans Field_Experiments_Perkins Jakákoli činnost s GMO = nakládání test-tube harrods-department-store-2 nUzavřené nakládání nUvedení do životního prostředí – polní pokusy nUvedení do oběhu u nás RR sója (pro zpracování) kukuřice MON810 (pro pěstování) Zákon 78/2004 Sb. money no nakládání se musí se žádat MŽP ČR nnakládat se smí jen na povolení n n n nwww.env.cz nNeoprávněné nakládání n POKUTA až 5 MILIONŮ Kč ! § microbiology-lab lab%20te3 Co do žádosti? nKdo nakládá? nS jakým organismem? nS jakým genem? nK čemu to bude? nJak je na to vybaven? nJaká jsou rizika? nCo se bude dělat, kdyby byl průšvih? anthrax Hodnocení rizika nJak je rizikový sám organismus? n nJak je rizikový gen? n nJak se změní organismus genem? Oblasti rizik leprosy5 nLidské zdraví nZdraví zvířat a rostlin nŽivotní prostředí nBiologická rozmanitost nBerou se v potaz i ekonomická, demografická n a politická hlediska n(MZe - řepka) m_leprae_200 field Třídy rizika pro uzavřené nakládání 1209_12 nA - žádné nebo jen minimální riziko nB – následky lze snadno odstranit obecně známými prostředky nC - následky lze odstranit jen zvláště náročnými prostředky nD – nechává trvalé následky n Havárie Motorcycle_wreck_small Tiger, BBC Není to každá nehoda na pracovišti s GMO Je to únik GMO mimo prostory určené k nakládání office Co se děje s žádostí? nMŽP – předá MZd a MZe nKaždé ministerstvo má komisi expertů nPosudky, žádosti o doplnění nŽadatel přepracuje, doplní a vrátí na MŽP nDalší kolo hodnocení nStanovisko ČK GMO nRozhodnutí ministra ŽP