ESC3 Buněčné terapie a tkáňové inženýrství Jaroslav PETR VÚŽV Uhříněves petr@vuzv.cz A injured person arrives at The Royal Free hospital in Whitechape in east London Buněčné terapie nPři onemocnění nebo poranění je zničena, poškozena nebo správně nefunguje řada buněk, tkání či orgánů. nBuněčná terapie snaží buňky nahradit n Buněčné terapie nTransfuze krve nTransplantace kostní dřeně n transfusion caso8f4 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c3/Blood_Donation_12-07-06_1.JPG Zdroje buněk pro terapii nEmbryo nPlod nNovorozenec nDospělý dárce http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6b/Embryo%2C_8_cells.jpg Terminálně diferencované buňky dospělého dárce heart_metabolism transfusion nMá svá omezení n- transfuze krve n- transplantace buněk kosterního svalu do srdce n n caso8f4 Kmenové buňky dospělého dárce nTzv. orgánové kmenové buňky (dospělé kmenové buňky n – adult stem cells) se nacházejí prakticky ve všech tkáních nZajišťují regeneraci tkání nVyskytují se i v tkáních s minimální regenerační kapacitou nPodílejí se na nádorových onemocněních Dospělé (orgánové) kmenové buňky nAsymetrické buněčné dělení n nKmenovost jim dává nika nOpuštění niky – diferenciace n nVyskytují se v různých tkáních n např. mozek, tuk, kostní dřeň … Dospělé kmenové buňky tnestinfitc3-hres adipocyty n nMají schopnost rediferenciace nMigrují na postižené místo Osud ASC byl sledován pomocí exprese GFP cells_160 cells2_160 „Nové“ buňky v postiženém místě vznikají i fúzí. Jsou tetraplodiní. Myogenní buňky v mozku nBez fúze n n n nS fúzí nMyogenní buňky vnesené do mozku novorozených myší n nV mozku diferencují n na „neurony“ n n nExprese markerů zralých neuronů v buňkách myogenního původu Degenerace sítnice léčba -potkan nPotkanům s degenerativním onemocněním sítnice byly do ocasní žíly injikovány mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně (MSC) nZákrok byl proveden před nástupem degenerace světločivných buněk nZabudování buněk do sítnice MSC MSC sítnice Degenerace sítnice léčba -potkan nNeošetřená zvířata ndegenerace nabnormální cévy npřednostně v okolí nervů n n nOšetřená zvířata nbez degenerace Degenerace sítnice léčba -potkan n n n n n n nMSC zabrání redukci vrstvy světločivných buněk v sítnici Ošetřené zvíře Neošetřené zvíře Degenerace sítnice léčba -potkan nMSC zvýší produkci trofických faktorů v sítnici Ošetřené zvíře Neošetřené zvíře Léčba poškozené rohovky nPoškození rohovky včetně kmenových buněk rohovky nOdběr kmenových buněk ze zdravého oka nKultivace kmenových buněk na fibrinu nTransplantace kultivovaných buněk na poraněné oko (Rama et al.: NEJM, 2010) pupik1 Buňky novorozence nPupečníková krev nDarování veřejné bance nUskladnění v soukromé bance pro vlastní potřebu za 20-40 tis. Kč a roční poplatky pupik3 Proč darovat pupečníkovou krev? nPupečníková krev je náhrada za kostní dřeň nPacient jí lépe přijme – není nutná tak velká shoda jako u kostní dřeně nŠance využití vlastní „odložené“ krve je 1:200 tisícům nOdebere se max. 1 dl stačí jen dítěti (vyvíjí se metoda expanze kmenových buněk stimulací Notch receptoru) nExistuje mezinárodní síť pupik2 Soukromé banky nVerbují klienty v citlivém životním údobí - těhotenství nSlibují využití léčby, která ještě neexistuje (Parkinsonismus apod.) nCo bude s krví n zkrachovalých n bank? Fetální buňky n - neurony pro Parkinsonovu chorobu n fetus q31 Komplikace léčby fetálními buňkami nChlapec s ataxia-telangiectasia nDědičná porucha imunitního systému provázená poruchami koordinace pohybu nLéčen injekcemi nervových buněk plodů do mozku i pod mozkové pleny v 9, 10 a 12 letech ꪠɇꪨɇx 2005 2008 Ve třinácti letech tvorba nádorů v mozku Nádory odvozené z buněk nejméně dvou dárců Typy buněk dle potenciálu diferenciace nTotipotentní – vývoj v celého jedince nPluripotentní – ve všechny typy buněk n např. ICM, ESC nLineage-restricted stem cells n mezodermální, ektodermální, entodermální nCommitted stem cells n – vyvinou se v daný typ buňky nProgenitorové buňky n – dělí se, nejsou kmenové nTerminálně diferencované buňky n – krvinka, neuron Pluripotentní ASC (?) nMezenchymální kmenové buňky kostní dřeně nBuňky získané z amniové tekutiny (AFS buňky n amnionic fluid-derived stem cells) AFS buňky Diferenciace Tuk Kost Sval Neurony Cévy Játra Intezivní množení – zdojnásobení počtu za 36 hod. Stabilita – 250 generací bez zkrácení telomer Množí se bez „feeder layer“ Buňky z AFS jsou funkční nFormování kosti v těle myši na algináto-kolaganovém podkladu nIntegrace do mozku in vivo nProdukce močoviny z hepatocytů AFS buňky nVnesení vzniklých neuromů do hipokampu myši n nVnesení osteogenních buněk na podkladu do těla myši AFS buňky nHojení zlomeniny stehenní kosti kost Scaffold scaffold scaffold + kostní dřeň + AFS buňky Stem cell Geron Embryonální kmenové buňky nBez omezení se množí nDiferenciace na typy buněk –Entoderm –Mezoderm –Ektoderm – Lze je vypěstovat nz embryoblastu blastocysty n blastocyst Lidská blastocysta Blastocysta zbavená ZP ICM Kultivace izolované ICM Kultivace 7 dní Kultivace 10 dní Kolonie ESC 3 dny po první pasáži blastocyst Zdroje blastocyst n„nadbytečná“ embrya z IVF ncíleně tvořená embrya nIVF nklonování 1Artery-vein-heart blastocyst humanembryonicstemcells Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán nXenopus- pluripotentní kmenové buňky nExprese 7 genů typických pro „eye-field“ nPo transplantaci pluripotentních buněk – vznik epitelu nPo transplantaci pluripotentních buněk s expresí 7 genů „eye-field“ n - vznik oka Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán n Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán nPřenos pluripotentních buněk s expresí genů eye-field do slabiny pulce nTvorba struktury podobné oku Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán nNáhrada zničeného oka pulce pluripotentními buňkami s expresí genů eye-field nVznik funkčního oka Diferenciace ESC in vitro nMyší ESC nExtracelulární matrix jako podklad nDiferenciační růstové faktory nDiferenciace buněk na optický váček (optic vesicle) Organogeneze in vitro n n n n Další kultivace nVchlípení stěny nTvorba optického pohárku (optic cup) Jak prověřit ESC? nMarkery – dokážou vyloučit, nikoli potvrdit nZvířecí ESC n Injekce do blastocysty n Injekce do varlat imunodeficitních myší Prověřování lidských ESC nDiferenciace in vitro nInjekce do myší blastocysty nInjekce do zvířecího plodu (ovce) nVznikají chiméry s různým podílem lidských buněk a tkání teartoma tooth nA) Diferenciace není dokonalá nz ESC může vzniknout teratom n n nŘešení: nZdokonalit diferenciaci nSelekce diferencovaných buněk nPotlačení exprese genu survivin – aktivní v embryu a nádorech, inaktivní v diferencovaných tkáních Technické problémy Stem cell Geron Technické problémy nImunitní bariéra nŘešení n- příprava příjemce přenosem kmenových buněk kostní dřeně n- universální ESC n- ESC „na míru“ přenos genů pro MHC n- široký sortiment ESC n- terapeutické klonování - První klinické zkoušky léčby buňkami z hESC n2009 - americká firma Geron nLéčba poraněné míchy progenitorovými buňkami dendrocytů nObnova myelinizace nProdukce růstových faktorů nObnova funkce neuronů První klinické zkoušky léčby buňkami z hESC geron 3 geron 1 Prověrka bezpečnosti léčby buňkami z hESC n geron 4 Myelinizace neuronů poraněné míchy - potkan n geron 2 První zkoušky n geron 5 Produkce prekurzorových buněk nTesty zastaveny 2011 geron 6 Léčba makulární degenerace nKultivace pigmentovaných buněk sítnice z lidských ESC MITF/PAX6 ZO-1 DAPI DAPI DAPI Bestrophin/PAX6 Léčba makulární degenerace nPigmentovné buňky sítnice po transplantaci přežívají, množí se a funkčně se zapojily do sítnice před 1. týden 6. týden 3. měsíc 6. týden Léčba makulární degenerace nPrůkazná obnova zraku operovaného oka The effects of macular degeneration could soon be a thing of the past (Image: Garo/Phanie/Rex Features) 37 59_bb Odběr buněk pokožky Potřebuje srdeční svalovinu Pacient Terapeutické klonování Egg 37 klon1 klon2 Pokožka Oocyt Stem cell Geron Pregnant woman, bbc Embryonic stem cells in laboratory bottles Embryonální kmenové buňky blastocyst Stem cells in a laboratory Stem cells in a laboratory 13 14 49_bb Stem cell Geron chrupavka Sval kosterní Langerhansovy ostrůvky 59_bb Srdeční sval ESC Diferenciace Diferenciace Pacient Makak nejde klonovat. Půjde člověk? _39079237_defprotein_science_203 Not produced by the Dolly technique, but a clone nonetheless Schatten ORPRC Gerald Schatten Korejsko-americký tým Národní universita Soul cibelli_jose Woo Suk Hwang Woo Suk Hwang José Cibelli chondrocyte.jpg (39215 バイト) Únor 2004 klonované blastocysty člověka stem cells z terap klon Květen 2005 – zvýšena účinnost (až 100%) hwang2 klonované blastocysty člověka stem cells z terap klon Listopad 2005 - skandál dárcovství vajíček hwang4 hwang-roh2 Woo Suk Hwang Sung Il Roh National Soul University Klinika MizMedi Show must go on! hwang3 hwang-signwschub hwang-supporters4 Listopad 2001 - ACT human_cloning_01 Pokus o terapeutické klonování Fiasko 2007 – ESC z embrya NTSC - makak n304 oocytů n35 blastocyst n2 linie ESC nVyšší účinnosti dosaženo šetrnějším nakládáním s oocyty a embryi nNebarví se chromatin pro enukleaci oocytu n img Shoukrat Mitalipov Oregon National Primate Research Center ESC z embrya NTSC - člověk nTachibana et al. Cell (2013) img Shoukhrat Mitalipov Oregon National Primate Research Center Somatické buňky Defektní blastocysta získaná tradičním postupem postrádá embryoblast ESC z embrya NTSC - člověk n Kvalitní ESC blastocysta Embryoblast ESC z embrya NTSC - člověk n Markery pluripotence TERATOMY Chrupavka střevo Nerv Sval Cybridy nEmbryo je vytvořeno přenosem jádra lidské somatické buňky do oocytu cizího druhu (myš, králík, skot) nOmezený vývoj embrya n Myš – blok vývoje ve 2 blastomerách n Králík, skot – blok vývoje v 8-16 blast. nVelké poruchy v expresi genů n Výrazné odchylky v expresi 2 – 3 tis. genů n Jen výjimečně exprese nanog, Oct-4, Sox-2 Indukované pluripotentní kmenové buňky n n n n n nNobelova cenu za fyziologii a medicínu 2012 http://gladstoneinstitutes.org/nobel/downloads/Yamanaka_Gurdon_2_Gladstone_24_Oct_2012.jpg Shinya Yamanaka John Gurdon ESC06 Indukované pluripotentní kmenové buňky nIndukovaná exprese vybraných transkripčních faktorů HFLS-OA Fibroblasty indukované pluripotentní buňky Oct3/4 Sox2 c-Myc Klf4 nikoli Nanog ? c-Myc aktivní v řadě typů nádorových buněk ? Simple switch turns cells embryonic nPo vnesení do blastocysty n vytvoří se chiméra niPSC ndiferencují na všechny tkáně nU 20% chimér - nádory npocházející z iPSC Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC) 2007 - zopakováno u lidských somatických buněk nRetrovirové vektory nVneseny geny pro n transkripční faktory n n n image126b Shinya Yamanaka Universita Kjóto Vznik indukovaných pluripotentních buněk iPC Kožní buňky iPC Větší zvětšení Spontánní diferenciace Řízená diferenciace iPC iPC Kožní epitel Dopaminergní neurony Kardiomyocyty Teratomy z lidských iPC ve varleti myši Může pomoci náhrada onkogenu c-Myc za gen Wnt 1195620239 Lidské iPSC nRetrovirové vektory nPřenos transkripčních faktorů n OCT4, SOX2, NANOG a LIN28 n nObešel se bez c-MYC, který indukuje nádorové bujení nPro tvorbu iPC lze použít různé kombinace transkripčních faktorů James Thomson University of Wisconsin Řízená diferenciace iPSC nTkáň tenkého střeva nZajištění exprese genů klíčových pro vývoj střeva v přesně určené sekvenci nIn vitro vznik útvaru s markery a morfologií tenkého střeva organoid Den 0 1 2 3 4 9 13 embryo Mládě dvou samců nTvorba iPSC z fibroblastu samce nSelekce linie buněk, které ztratily Y chromozom (XO) nPřenos XO iPSC do samičí blastocysty Mládě dvou samců nVznik chiméry s dvěma populacemi oocytů nPáření chiméry samcem nPotomci nesou dědičnou informaci dvou samců Chiméra c083 9 Potenciálně využitelné u člověka HFLS-OA ESC06 c083 c083 Scientist researching stem cells fp0265 247 9 Porovnání potenciálu hESC a hiPSC nDiferenciace na buňky, znichž se tvoří cévy a krvinky nRovnocenná u buněk z ESC a iPSC hESC hiIPC Porovnání potenciálu hESC a hiPSC n n nKrvetvorné buňky z iPSC n n n n n n Cévy z iPSC Porovnání potenciálu hESC a hiPSC nBuňky z hiPSC nmnohem náchylnější k apoptóze n n n nAngiogenní marker – nKaspáza 3 + nFragmentace jádra + n Apoptotická buňka Porovnání potenciálu hESC a hiPSC nBuňky z hiPSC n nOmezené dělení nProgresivní stárnutí Porovnání potenciálu hESC a hiPSC nMnožení buněk ndiferencovaných nna erytrocyty Imunologicky univerzální lidské iPSC nVytvoření linie iPSC nnáročné, zdlouhavé, nízká úspěšnost nUniverzální linie nDelece genů nutných pro expresi n MHC 1 a MHC 2 (B2M a CIIT) nLikviduje je imunitní systém - NK cells nZvýšení exprese genu CD47 n – rezistence k NK cells Imunologicky univerzální lidské iPSC nPřenos modifikovaných h iPSC myším s humanizovaným imunitním systémem nBez imunitní reakce. nDiferenciace na kardiomyocyty nPřenos myším s humanizovaným imunitním systémem – bez reakce n Hiromitsu Nakuachi Stanford University Lidské iPSC GM blastocysta prasete Prase bez vlastního pankreatu Spontánně vzniklý lidský pankreas Diabetik iPSC diabetika Orgány z lidsko- prasečí chiméry Potkan PDX1- s IPSC myši n Pankreas Oko z IPSC nBlok gen Pax6 + přenos IPSC potkana WT WT + IPSC Pax6 - + IPSC Exprese rediferenciačních faktorů in vivo nPokud jsou geny Oct4,Sox2, c-Myc, Klf4 aktivovány in vivo (v buňkách v těle zvířete) dochází ke spontánnímu vzniku teratomů n n Exprese rediferenciačních faktorů in vivo nIn vivo dochází k rediferenciaci na totipotentní buňky. nV teratomech se objevují i buňky placenty. Teratomy na tenkém střevu placenta Korigované exprese in vivo - omlazení nKrátkodobá n cyklická exprese nOct4 nSox2 nKlf4 nc-Myc nEpigenetické změny Korigované exprese in vivo - omlazení Myši s dědičnou progerií nZlepšení zdravotního stavu nProdloužení života Progerie Progerie + faktory WT Korigované exprese in vivo - omlazení nMyši s dědičnou progerií nZlepšený stav orgánů WT Progerie Progerie + faktory Rediferenciace buněk in vivo Ostrůvek Beta-buněk Indukované Beta-buňky nAdenovirové vektory nTranskripční faktory n Neurog3 n Pdx1 n Mafa nRediferenciace na beta-buňky nIndukce tvorby inzulínu Rediferenciace buněk in vivo nIndukované buňky n jsou n morfologicky n i fyziologicky n neodlišitelné n normálních n beta-buněk Přímá rediferenciace fibroblastů na neurony nFetální fibroblasty nTransfekce 3 geny n transkripční faktory Ascl1, Brn2, Myt1l nDiferenciace na neurony nNeurony jsou funkční n tvoří synapse Přímá diferenciace fibroblastů srdce na kardiomyocyty nPo infarktu vneseny do fibroblastů srdce myší pomocí retorovirů geny Gata4 n Mef2c n Tbx5 nVznik kardiomyocytů n (2 jádra) frol_09l Tkáňové a orgánové inženýrství a1087i0_bsc nano Základem jsou vhodné polymery microsphere arch1 Figure4 Polymerové vazy a šlachy BRAID1-1 Chrupavky z pacientových chondrocytů terc_03 s-ortho3_b Pěstování chrupavky BIOREACTOR05 BIOREACTOR07 Umělý močový měchýř BLADDER01 BLADDER02 In vitro kultivovaný močový měchýř pacientům se spina bifida n hs1361238_1 imageWX30304032243 Močová trubice nVývojový defekt močovétubice nNahrazena trubicí vypěstovanou na polymerovém scafoldu in vitro [USEMAP] A1B77A182799CBBA672727ECDD9851 Průduška trachea1 nKolaps průdušky následkem TBC nZáklad implantátu - trachea dárce zbavená všech jeho buněk nIn vitro narostly na průdušnici pacientčiny buňky z kmenových buněk kostní dřeně nPacientka žije bez imunosupresiv Průduška nPřed zákrokem n n n nPo zákroku Průduška nPříprava průdušnice dárce n nzačátek n n15 cyklů odmývání ndetergentem n n27 cyklů odmývání ndetergentem Průduška nBioreaktor nKultivace probíhá z poloviny na vzduchu, aby byly buňky schopny existence v dýchacích cestách. Uměle pěstované cévy artery2 nPěstují se na trubicích nVnější vrstva hladké svaloviny nVnitřní vrstva endotelu n n n nDo trubice je přiváděn živný roztok pod tlakem v pulsech Mechanická stimulace buněk 300px-Astronaut nJe důležitá pro správný vývoj tkání a orgánů n nDokládá to např. řídnutí kostí u astronautů pobývajících delší dobu ve stavu beztíže Umělé cévy bez polymeru 1141194568 1141194980 umela ceva Sonografie umělé cévy 1141194776 Integra- vyrobená pokožka - kolageny skin Popáleniny na velké ploše "( Artificial skin offers hope to burn victims Artificial skin offers hope to burn victims Organogenesis – vypěstovaná kůže - živé buňky skin bccmicro-artificial%20skin-tn apligraf Kultivace keratinocytů a fibroblastů na polymerových membránách Dermagraft Ar-Skin Na vředy vyvolané nedokrvením toeapli1 toe%20appli%201wk Umělé náhražky krve bloodcell2 transfusion Podnět – virové nákazy při transfuzi ws_wt-hiv virus hepatitidy HIV- AIDS Perfluorokarbony pfcmouse viren3 Hemoglobiny z402-hemoglobin hemoglobin Problém se stabilitou Poškozují ledviny 09031611294a393dfe901ec Umělé erytrocyty nPolymer kys. mléčné a glykolové – PLGA nBiokompatibilní, biodegradovatelný nSférické „balónky“ po kontaktu s rozpouštědlem kolabují do tvaru krvinky nPotažení proteinem nOdmytí PLGA nVznik nosiče s vlastnostmi erytrocytu nLze jej plnit hemoglobinem ale i léky bone1 Náhrady kostí xrayills „umělé klouby“ main tkrparts Kolenní kloub porous2 cement Upevnění umělého kloubu Umělá kost n80. léta n- syntetický hydroxyapatit n2. generace n -syntetická skla n (kůstky středního ucha, zuby, obratle) n3. generace resorbovatelné pěny uvolňující růstové faktory n n super_gallery2_bone_zoom Kost a chrupavka z kmenových buněk bites-hres chrupavka kost polymer Rekonstrukce zubního alveolu Vyražený řezák Zničený alveol Rekonstrukce alveolu Scafold a buňky Zubní implantát In vitro vytvořený germon zubu (Ikeda, 2009) Vlasový folikul (Toyoshoma 2012) n n n n nBuňky lidské kůže nKultivace in vitro nVznik zárodečného folikulu nPo transplantaci – lidský vlas n 1 Čelist Inkubátor Tomograficky snimek čelisti Tvář před a po zákroku Rekonstrukce lícních kostí nPacient s Treacher-Collinsovým syndromem n - absence lícních kostí n - ohrožení oka při pádu nPoužita n - minerální komponenta n z kosti dárce n - vlastní kmenové buňky n tukové tkáně n - BMP2 brad guileky 1 Srdce nRočně umírá na selhání srdce nebo infarkt 12 milionů lidí nV USA n- infarkt 800 000 lidí ročně n- celkem 8 milionů lidí po infarktu n- 500 000 ročně umírá na selhání srdce nHustá síť cév, které dodávají srdci kyslík a živiny a odvádějí zplodiny látkové výměny n nVelké množství metabolicky vysoce aktivních buněk naměstnaných v malém prostoru n nAkce buněk je vzájemně velmi dobře koordinovaná n n 31 32 33 Srdce - přírodní vs. umělé 4 31 32 33 nA – pumpa pro živný roztok nB – výměník plynů nC – polymerová „kostra“ n nOsazení buňkami srdeční svaloviny n(100 milionů buněk na 1 ml) nTok média 0,1 ml/min nElektrická stimulace buněk 11 6 Polymer Den 0 Den 7 nElektrická stimulace buněk vede ke změně ultrastruktury kultivovaných buněk. Tvorba sarkomer, buněčných spojů. Exprese myosinu (zeleně). 7 Stimulace A rat heart (top) turns ghostly pale when stripped of cells (bottom). Umělé bio-srdce (potkan) nDecelularizace srdce nzbaví se buněk nzbude jen extracelulární matrix Umělé bio-srdce nNapojení na krevní oběh nRecelularizace – buňky srdce plodu a novorozených mláďat Umělé bio-srdce nVýsledek Umělé bio-srdce nLidské srdce nDecelularizovaný scafold n lidský n prasečí nLidské buňky A "decellularised" pig's heart Prasečí „základ“ Plíce narostlé na extracelulární matrix nDecelularizace plic nNasazení 9 typů plicních buněk na extracelulární matrix nPři kultivaci in vitro se obnoví struktura plic i funkce. nPo transplantaci - fungují Lung in rat Končetina http://media.eurekalert.org/multimedia_prod/pub/web/92939_web.jpg n n n n n nInjekce svalových kmenových buněk do decelularizované končetiny potkana ITOP - integrated tissue – organ printer n3D tisk velkých a složitých objektů nScaffold + různé typy buněk nNásledně se vytvářejí n Cévy n Nervy Tissue printer creates lifelike human ear Organoidy nIn vitro spontánně vzniklá 3D struktura nObsahuje n odpovídající typy diferencovaných b. n odpovídající typy progenitorových b. n nVykazuje aspoň část funkcí, které plní orgán v podmínkách in vivo Organoidy nMozek nnervové kmenové buňky nneurony This flow chart outlines the basic steps to create a cerebral organoid. The process takes a span of months and the size of the organoid is limited by the availability of nutrients. Regenerace orgánů salamander1 flatworm nObojživelníci dediferencují specializované buňky n nPloštěnky mobilizují rozptýlené nedifeencované buňkysignálem z poškozené tkáně Regenerace orgánů nObnova oční čočky čolka n n n n nObnova srdeční svaloviny dania n http://images.the-scientist.com/content/images/articles/55861/26-2.jpg 26-4 salamander1 Regenerace obojživelníci nMusí dojít k apoptóze některých n buněk v poraněném místě nTyto buňky brání množení ostatních buněk a jejich diferenciaci v nenarušené tkáni nPo jejich zániku je umožněno nMnožení buněk nDiferenciace nRegenerace Regenerace obojživelníků nČolek ohňobřichý n(Cynops pyrrhogaster) n nRegenerace oční čočky nNenarušena po 18 amputacích nNenarušena ve věku 30 let Tsonis-Lens-photos2 firebellied mouse Kmen myší MRL nGeneticky podmíněná schopnost vysoké regenerace tkání n n n n n nKůže se hojí bez jizev nSrdce regeneruje po spálení tekutým dusíkem Mouse healing (Heber-Katz) MRL mouse (Heber Katz) MRL - Murphy Roths Large mutace pro autoimunitní onemocnění Regenerace – mutace genu p21 – kontrola buněčného cyklu p21 – je regulován p53 alely genů mmp2, mmp9 a řada dalších Heber Ellen Heber-Katz Wistar Institute Bodlinaté myši rodu Acomys nMyš Kempova (Acomys kempi) nMyš Acomys percivali nMechanicky málo odolná kůže nTrhá se při napadení predátorem nDovoluje únik Bodlinaté myši rodu Acomys nNa kůži se vytváří útvar npodobný blastemu obojživelníků nRegeneruje bez zjizvení nKůže nChlupy nChrupavka ucha Den 3 Den 30 Technická řešení kyborg implant Kochleární implantáty nStimulace buněk v hlemýždi nNestimuluje jeho nejužší část nČást zvukového spektra chybí nNevadí pro pochopení řeči schematic3 nZvuk zachytí mikrofon nJde do dekodéru nKódovaný signál přes kůži do přijímače nImpulzy dráždí vnitřní ucho Přímé dráždění sluchového nervu 4245_web nLze zajistit vnímání jen určitých frekvencí při zachování původního sluchu – např. pro lidi neslyšící vysoké tóny nLze využít i po lidi, kteří mají těžce poškozené vnitřní ucho Elektroda pro napojení na sluchový nerv Auditory brainstem implant nElektrická stimulace mozku n v cochlear nucleus abi Implantát pro korekci závratí nKoncepčně je podobný kochleárnímu implantátu. n3 elektrody - zavedeny do kanálků labyrintu vnitřního ucha nDráždí kanálek a navozují pocit rovnováhy nVzor impulsů určuje mikroprocesor analyzující pohyby nNapř. pro pacienty s Menierovou chorobou – prasknutí stěny labyrintu a výtok tekutiny 26556_rel 26555_rel eye Umělá sítnice Lidské oko eye n130 milionů světločivných buněk n1,2 milionu gangliových buněk nty vytvářejí zrakový nerv nSignál jde do zrakové kůry, ale zpracovávají ho i další centra n nNarušení kterékoli části - slepota 9907d38b nUmístění nNa sítnici nPod sítnici 9907d38a portrait_retina Co může být asi vidět? The top image shows the raw output of the retina chip, the middle one a picture processed from it and the third shows how a moving face would appear (Image: Zaghloul/Boahen/IOP) Signál na umělé sítnici Generovaný obraz Obraz pohybující se tváře Umělá sítnice Univ. Penn. n3,5 x 3,3 mm n5760 fototranzistorů n3 600 tranzistorů pro generování signálu do očního nervu n13 různých typů tranzistorů nSama se přizpůsobí světlu a kontrastu peoKareemPhoto_000 Kareem Zaghloul V klinických zkouškách nRetinal Implant AG - Tübingen n1500 fotodiod nZesilovače nRozměr 3 x 3 mm nZorné pole 10° nČernobílý obraz The chip gets implanted beneath the retina.. Umělé srdce jarvik Jarvik 7 (1982) jarvik h624n1 Barney Clark Jarvik 7 nDálkové ovládání nVnější zdroj n napájení n Jarvik-7_Artificial_Heart_Image_3559-OT Jarvik 2000 jarvik2000 „Pomocná pumpa“ J2Syss nVoperuje se do nemocného srdce nPacient s ním může dlouhodobě žít nIndukční dobíjení nJeho vlastní srdce přitom regeneruje HeartMate (Thoratec) n HeartMateDevice Deviceplacementinbody The New England Journal of Medicine (Birks et al. 2006) HeartmatePatient n15 pacientů s těžkým postižením srdce nOperace HeartMate + léky nU 11 - HeartMate po roce (320+186 dní) vyňat nU jednoho arytmie a smrt n do 24 hod. nOstatní návrat stavu srdce n k normálu Abiocor - r. 2001 abiocor-hand image_17418_zoom Mike Simons – první pacient nÚplná náhrada nZcela autonomní nPokud selže, n je konec nPacient nemá tep robert_tools2_MikeSimons Bionické protézy nObsahují n senzory n svaly n terén n mikroprocesor n motor nŠetří námahu nJistější pohyb mark-inglis Mark Inglis – NZ Everest - 2006 n1 - manžeta n2 – baterie n3 – kabel napájení n4 – ovládací klávesnice n5 – senzory akcelerace, n sklonu, detekce schodů n6 – pohon pro patu n7 - při každém kroku n uvedeny do pohybu „prsty“ Prosthetic foot graphic 60 000 liber Heather Mills, estranged wife of Paul McCartney Stuart's prosthetic foot from the side, front and stepping down myoelectric_hands_sensorhand_2 myoelectric_hands_sensorhand_1 SenzorHand Speed nPracuje do -20° C (i v rukavicích) nNapětí: 6/7.2 V nRozevření 100 mm nRychlost pohybu prstů 15-300 mm/sec nSíla stisku 0-100 N nHmotnost 460 g nLevá, pravá nVelikosti: 7 1/4, 7 3/4, 8 1/4 n Proportional DMC 4 channel processor 13E195 Elektronické zápěstí dynamicarm solo n nUdrží asi 20 kg nZvedne asi 6 kg nPlný rozsah pohybu n za 0,5 sekundy nPřirozené „komíhání“ za chůze n Sherri gardening Elektronický loket Programování nProtézy lze uzpůsobit n- pacientovi n- podle podmínek myoselect Ovládání ochromené ruky nVyřazení nervů ruky z činnosti nTransport signálů z pohybového centra mozku do svalů ruky nRuka se pohybuje podle instrukcí mozku, i když její nervy nevedou signál Fukční Elektrická Stimulace SmartHand nNapojení elektrod přímo na nervy končetiny n problémy s udržením funkčního spoje nZpětná vazba (hmat) nVyvíjená v EU ve spolupráci s dalšími zeměmi (Izrael) smarthand 4635top2 smarthand2 nPacient vnímá protézu subjektivně jako vlastní končetinu nInterface napojuje protézu přímo na nervy nElektrická stimulace nervů ulevuje od fantómové bolesti n4 servopohony n40 tlakových senzorů nLze psát tužkou nFunguje hmat 09_10_09_small SmartHand eLEGS –Berkeley Bionics photo nProgramovatelná jednotka řídí servomotor v kyčli a koleně. nDovoluje chůzi s využitím pohybových reflexů, které u ochrnutých zůstaly zachovány nPřístroj může chodit i sám bez člověka BMI - brain machine interface JohnyMnemonic2 Převod nervových vzruchů na povely pro elektronická zařízení learning%20SRT Vývoj protéz ovládaných myslí foto3 story BrainGate braingate_illustration Brain-gate BrainGate – ovládání robotické ruky (2012) n Ovládání ochrnuté ruky nPacient ochrnutý od 19 let po úrazu míchy při skoku do vody n nNeovládá nNohy nRuce od lokte Ian Burkhart moves his hand using a sleeve of electrodes attached to implant in his brain 07_Photo_PatientArm_03 Ovládání ochrnuté ruky n100 elektrod do pohybového centra mozku nElektronický „rukáv“ pro stimulaci svalů nTrénink 4 hod. 3x týdně po tři roky nPohybuje rukou nPohyb jednotlivých prstů n 70% přesnost pohybů Bezdrátový přenos informace mozek - mícha Nature 2016 Makak s přerušenou míchou chodí nSnímání signálu z mozku nVysílání do přijímače nStimulace míchy elektrodami n IMAGE implant Elektrody pro snímání vzruchů z mozku Bezdrátový přijímač s elektrodami pro stimulaci míchy BCI-cap José Delgado – Yale Univ. 1965 jose-delgado Roborat – elektronicky ovládaný potkan RoboRat http://goodfilmguide.co.uk/wp-content/uploads/2010/04/avatar12.jpg Kortiko-spinální protéza nMaster nPředstavuje si pohyb končetiny pro pohyb kurzoru nKontroluje výsledek nAvatar nPod anestezií nVykonává pohyby po stimulaci míchy n i po přímé stimulaci svalu paže Master Avatar Záznam nervové aktivity Určení úmyslu Stimulace Anestezie http://ziv.mgh.harvard.edu/images/maryam.jpg Maryam Shanechi 2014 Brain-to-brain interface n future-futuristic-one-step-closer-to-telepathy-with-bci-technology-1 Brain-to-brain interface n brain-to-brain-interface-rats Icon-Computer02-Black nicolelis Miguel Nicolelis Brain-to-brain interface nPotkan „odesílatel“ dostane signál nVolí naučenou reakci - zmáčkne správnou páku nDostane odměnu nVzruchy z jeho mozku jsou sejmuty elektrodami a přeneseny do počítače nDekódování vzruchů a jejich „překlad“ do stimulačního signálu pro „příjemce“ BrainToBrainInterface Brain-to-brain interface nPotkan „příjemce“ reaguje na vzruchy generované počítačem tak, že volí naučenou správnou odpověď, i když nedostal signál (světlo). Dostane odměnu nPokud dostane odměnu za správné řešení „příjemce“ i „odesilatel“, je příští signál z nervového centra „ostřejší“ a pro „příjemce“ snáze „čitelný“ Brainet – síť mozků n3 makaci nKaždý ovládá n kurzor ve 2 osách nVýsledný pohyb kurzoru nsložením povelů od všech 3 opic nSpoluprací splní úkol a dostanou odměnu (Scientific Reports, 2015) Etické otázky kolem kmenových buněk nPrimum non nocere n především neublížit nESC - obrovský příslib n pro léčbu mnoha chorob nVýzkum probíhá velmi intenzivně nVeřejnost má obavy Etické otázky kolem kmenových buněk nZdroj kmenových buněk nESC nebo ASC? nDárcovství oocytů nMáme prodlužovat lidský život buněčnou terapií? physician-scientist Zdroj ESC nVědci nEmbryo nRané stádium (blastocysta) nNejsou vyvinuty orgány nIzolovaná ICM – nemůže z ní vzniknout člověk nEmbryo není jedinec, osobnost pope-francesco-i nNěkteré církve nEmbryo nČlověk je osobností n od okamžiku oplození nEmbryo je jedinec, osobnost nTvorba ESC je destrukcí člověka n Zdroj ESC dn9587-1_500 Záchrana nadbytečných embryí z IVF photo-bush-stem-cell-veto Donald Kennedy n„Toto vyhlášené dilema n (vznik ESC a zničení embrya) nevzniká konfrontací vědy a obecných etických zásad. Naopak, námitky vyvěrají z určitého názoru – víry – na to, co je podstatou lidského života. Tento názor zastávají jen někteří věřící, ale ostatní nikoliv.“ kennedy-big Donald Kennedy Stanford Univ. Chief editor Science tet Obecná shoda o lidském embryu nVyžaduje respekt nNakládání s ním nelze komercionalizovat nNesmí se s ním zacházet jako se zbožím nZískávání embryí je eticky citlivá věc Zdroj embryí nNadbytečná embrya z IVF nEmbrya vytvořená jen pro tvorbu ESC n IVF, terapeutické klonování Nadbytečná embrya z IVF nNakládání s nimi musí provázet respekt k embryu nRodiče by měli být informováni o možnosti darovat embrya na ESC až ve chvíli, kdy se rozhodnou pro zničení nadpočetných embryí nZa embryo by se nemělo platit Důvody pro tvorbu embryí nEmbrya z IVF nemají dostatečné spektrum genotypů pro výzkum nPro výzkumné účely – vytváření ESC od jedinců stižených dědičnou chorobou n nMezinárodní konvence zakazují tvorbu lidského embrya pro výzkum Statut embrya z IVF a terapeutického klonování nIVF – kombinace genomu gamet nTerapeutické klonování – rediferenciace somatické buňky nVzniká terapeutickým klonováním embryo? 10a Embryo vzniklé terapeutickým klonováním nNevzniklo kombinací genomu gamet nNevzniklo s cílem narození člověka nJeho vývojová schopnost je snížena nOplozením – zygota nKlonováním – klonota (clonote) n „je vyrobena spíše než zplozena“ Paul McHugh Johns Hopkins Univ. rudolph_jaenisch1 „Klonota“ n„Zničení lidského embrya vzniklého klonováním a následná tvorba embryonálních kmenových buněk představuje menší etický problém než zničení zamražených embryí na klinikách pro IVF.“ n Rudolf Jaenisch n Graphic, BBC Odpůrci terapeutického klonování nVýzkum terapeutického klonování otevírá cestu pro reprodukční klonování, protože vede k vylepšení technik přenosu jader nReprodukční klonování je nepřijatelné Odpůrci terapeutického klonování nLidský život si zaslouží ochranu od okamžiku oplození vajíčka spermií nPři terapeutickém klonování ale nedochází k početí splynutím vajíčka a spermie Nuclear transfer embryo about to be activated PAG101-105F2 Tvorba ECS z handicapovaných embryí nZablokování genu CDX2 nutného pro vývoj trofoblastu - z ICM lze získat ESC nZatím jen u myši nMá gen CDX2 u člověka stejné funkce? nOvěření – jen pomocí pokusů na lidských embryích nJe funkce genu CDX2 v embryu hranicí, kde začíná morální statut člověka? CDX2 Fusion ACT Tvorba ECS z handicapovaných embryí nEmbrya vzniklá fúzí lidské somatické buňky a zvířecího cytoplastu n (králík, skot) nNení to chiméra nKombinuje lidský jaderný genom n se zvířecí mtDNA nJe riziková n - nepovoluje se being_best_wideweb__430x296 Julian Savulescu n„Je z morálního hlediska něco špatného na výzkumu na buňkách, které jsou odvozeny od somatických buněk a nikdy by se nevyvinuly v embryo? nDnes produkujeme lidské proteiny vnášením lidské DNA do zvířat. Zdá se, že proti tomu nikdo nic nenamítá. Když tak můžeme vyrábět proteiny, tak proč ne třeba krvinky?“ Savulescu University of Melbourne hwang4 hwang - darkyne Dárcovství oocytů nJe zapotřebí velké množství n lidských oocytů nPro dárkyně to představuje rizika nHyperstimulační syndrom n u 1% žen vážné komplikace n selhání ledvin, plic, šok, ruptura vaječníku nPlatby – motiv pro chudé ženy n(Indie – prodej ledvin na transplantace) Možnosti produkce oocytů in vitro Fetus_pig_photo mrc5large6 julangli Julang Li University of Guelph vejce17 - upr - zm DSCN2153-Maasai-Woman Removing the maternal nucleus during nuclear transfer 9 blastocyst Stem cell Geron Možnosti produkce oocytů in vitro DSCN2153-Maasai-Woman 9 Možnosti produkce oocytů in vitro stem_cells iPSC 07-09-very-old-man Prodloužení života zpomalení stárnutí nCo se stane, když bude buněčná terapie pomocí ESC skutečně funkční, levná a tudíž široce dostupná? nBude využita pro n prodloužení života n zpomalení stárnutí nJaké to bude mít následky? 24589 Prodloužení života zpomalení stárnutí nSmrt dává životu n naléhavost n smysl nBude silně prodloužený život tak plnohodnotný jako ten „krátký“? nBudeme ještě chtít mít děti? hippies Prodloužení života zpomalení stárnutí nSpolečnost se „renovuje“ n s každou novou generací nCo se stane se společností, n která bude stárnout bez dětí? nNaruší se přenos tradic a kultury? n n McCubbin_oldpolitician Prodloužení života zpomalení stárnutí nZahlcení společnosti schopnými n „glut of able“ nZastaví se střídání generací n v řízení firem n v politice n ve vědě n v kultuře Frederick McCubbin An old politician 1879 Prodloužení života zpomalení stárnutí nCharles Mann: The Coming Death Shortage n „nástup nedostatku úmrtí“ nProdloužení lidského života vyvolá hlubokou ekonomickou a sociální krizi nMoc a majetek se nahromadí v rukou malé skupinky extrémně starých ale přitom zdravých a pracovně výkonných lidí. Prodloužení života zpomalení stárnutí nNeexistuje sociální potřeba prodlužování lidského života nLidí s tímto názorem přibývá nPokrok v medicíně nMěl by být využit k tomu, aby lidé umírali přirozenou smrtí v klidu a důstojně. nNikoli k odvracení přirozené smrti. callahan_david David Callahan campagna_300 ESC a veřejnost nVětšina lidí se v blízkém okolí (rodině) setkává s případy degenerativních onemocnění (Parkinson, Alzheimer, Duchenne aj.), které jsou potenciálně léčitelné buněčnou terapií s ESC. nTo formuje jejich vztah k ESC ESC a veřejnost nVelký vliv mají postižené celebrity christopher_reeve_supermandead onion_news92 ali2 fox Stem_cell_embryo_20x_01 nStupně regulace nBez regulace (USA, Kanada) nÚplný zákaz nPovolen jen výzkum, nikoli tvorba ESC (Německo) nPovolen výzkum i tvorba ESC n z nadpočetných embryí z IVF (ČR) n z terapeutického klonování (GB, Aus.) Regulace ESC ČR – zákon 227/2006 Sb. nVýzkum ESC n– povoluje ministerstvo školství nDovezené i nově vytvořené linie nVytváření ESC z embryí po IVF nNení povoleno terapeutické klonování n nBioetická komise – poradní sbor expertů n Stem_cell_embryo_20x_01 Regulace ESC nVýzkum může provádět jen ten, kdo n1) prokáže vysokou kvalifikaci n2) prokáže, že výzkum přinese významné nové poznatky n3) prokáže, že tyto poznatky nelze získat výzkumem na jiném typu buněk patentova-listina Financování a patenty nSoukromé zdroje nVeřejné zdroje nPatentování nUSA- nPatentovatelné - nové, zlepšující, fungující n bez ohledu na etiku n (ale nepatentovali lidsko-zvířecí chiméry) nEvropa – v biotechnologiích n nelze patentovat věci, které jsou v rozporu n s dobrými mravy a morálkou 1110994981_4592 Patenty nVýzkum financovaný n ze soukromých zdrojů n nemusí být vždy patentován nK jeho výsledkům může být volný přístup nD. Melton (2004) – získal ESC pro výzkum dětské cukrovky za peníze ze soukromých zdrojů. n Buňky poskytuje zdarma. Douglas Melton Harvard University Patentování hESC v EU n2011 – Evropský soudní dvůr nZákaz patentování hESC nLze i nadále patentovat „přidružené techniky“ (např. složení kultivačních medií) nebo samotné léčebné postupy nSnahy omezit financování výzkumu hESC z fondů EU Dostupnost buněčné terapie nLze předpokládat, že léčba pomocí ESC bude náročná technicky i finančně nObtížná dostupnost n V zemích s nízkou úrovní medicíny n V zemích, kde na to nebude stačit zdravotní pojištění the_krank_malaria rich Dostupnost buněčné terapie nLéčba pomocí ESC nmůže být dostupná njen úzké skupině lidí nMáme právo vynakládat veřejné prostředky na výzkum ESC, když jeho výsledky pak bude využívat jen elita? nJe to jeden z bodů etických výhrad proti ESC homeless Dostupnost buněčné terapie nPostupem času bude terapie s ESC dostupnější i pro méně movité nPůvodní nerovný přístup se vyrovná nPéče o neléčené nemocné představuje ještě větší ekonomickou zátěž nJsou tu i sociální dopady n např. rodiny, které se starají n o parkinsonika JU2011309 Judaismus a ESC nOplozené vajíčko není osoba nNeschvalují interupci n na základě Genesis 9:6 – Prolita bude krev toho, kdo sám prolil lidskou krev nEmbryo nemá krev n do 40. dne „jakoby embrya byla voda“ nZmrazené embryo smí být zničeno nebo použito na výzkum včetně ESC JU2011309 Judaismus a ESC nLidé mají za povinnost léčit a hojit nVýzkum na ESC má z tohoto hlediska velký potenciál nPoužití nadpočetných embryí n podle některých rabínů lze obhájit odkazem na záchranu lidského života při léčbě pomocí ESC pope-francesco-i Římsko–katolická církev nOd oplození vajíčka spermií je zárodek lidskou bytostí nZákaz jakéhokoli výzkumu na ESC nV důsledku odporu k interupcím odmítají i embryonic germ stem cells Rus002 Ortodoxní pravoslavná církev nČlověk se blíží během života k bohu nTento proces začíná početím n proto odmítají interupci n Interupce je akt proti boží vůli nNelze podporovat tvorbu ESC nMedicína je dar od boha n lidé jsou povinni léčit n povolují výzkum na hotových liniích ESC nebo na buňkách ze spontánních potratů 01_d68fb1 Protestantské církve nVelmi různorodá stanoviska nNa jedné straně striktní příkaz ochrany embrya jako nejslabšího člena lidské společnosti. n Embryo má stejný statut jako dospělý člověk. n Jakýkoli výzkum či zásah do embrya je vyloučen. 01_d68fb1 Protestantské církve nNa druhé straně nPodpora výzkumu ESC z nadpočetných embryí po IVF nPodpora výzkumu na buňkách z plodů po intrerupcích provedených ze zdravotních důvodů nŘada protestantů silně podporuje výzkum na ESC blue-mosque Islám nVelká tolerance k ESC nOduševnění npo 40. ale i až po 120. dni těhotenství nPovolují výzkum na ESC, které byly získány ze zárodků před tímto termínem nPovolují tvorbu ESC z nadpočetných embryí po IVF a v některých případech i terapeutické klonování megatrekltrburro Al_Gore_i_An_Inconv_100607o Ideály a činy nMnoho lidí jedná v rozporu s tím, n co hlásají nKristus chtěl mír, ale křesťan jde do války nOchránce zvířat nosí kožené boty nAl Gore brojí proti globálnímu oteplení a má doma vyhřívaný bazén temple Ideály a činy - ESC nJižní Korea– buddhistická země nBuddhismus n– důraz na neubližování jakékoli formě života nEmbryo n není důležité, jestli je to člověk n je živé a musí být chráněno nEmbryo nese karmickou identitu zemřelé osoby, zaslouží si stejný respekt jako osoba Ideály a činy - ESC nJižní Korea nJe rájem interrupcí, i když n interrupce ze sociálních důvodů jsou zakázány n buddhismus interrupce odmítá nPočet interrupcí v Jižní Koreji ročně npřes 1,5 milionu nVětšina interrupcí je ilegálních hwang-demostrace-ibisek cloningscientist Ideály a činy - ESC nJižní Korea npodpora výzkumu na ESC npodpora terapeutického klonování Ideály a činy - ESC nČást veřejnosti podporuje výzkum na ESC, i když jsou proti interrupcím a klonování nVelkou roli hraje příslib léčby závažných onemocnění child_dog Ideály a činy - ESC nCo když ECS přinesou léčbu závažných onemocnění? nJak se zachovají ti, n co ESC odmítají? nLze nechat léčit psími ESC cukrovku u psa a přitom odpírat stejnou léčbu diabetickému dítěti?