1 Buněčná signalizace a karcinogeneze Přednáška kurzu Základy molekulární biologie 2018/2019, PřF MU Jan Šmarda Ústav experimentální biologie PřF MU 2 Signalizace je nástrojem komunikace buňky vzájemně komunikují a koordinují své aktivity základem buněčné komunikace je tvorba/detekce signálů, jejich zpracování a zajištění adekvátní odezvy Zásadně ovlivňuje chování buněk (metabolismus, růst, diferenciaci, pohyb, sekreci proteinů, atd.) 3 Princip signalizace tvorba signálu registrace signálu receptorem přenos signálu z receptoru k efektorům („signal transduction“) efektorem může být transkripční faktor, enzym, složka cytoskeletu, atd... schopnost buňky reagovat na podněty je geneticky určena spektrem receptorů, které je schopna vytvořit 4 Tvorba signální molekuly specializované produkční buňky seskupeny do žláz signální molekuly se po své syntéze dostávají do měchýřků pod plazmatickou membránou, fúzí membrán dojde k sekreci do mimobuněčného prostoru (exocytóze) 5 Chemická povaha signálů proteiny krátké peptidy aminokyseliny nukleotidy steroidy retinoidy mastné kyseliny a jejich deriváty plyny 6 Význam rozpustnosti signální molekuly 7 Signalizace zprostředkovaná nitrobuněčnými receptory typickými ligandy jsou steroidní / tyroidní hormony nízká molekulová hmotnost, hydrofobicita 8 Mechanismus účinku: Malá velikost/lipofilní povaha hormonů - difúze membránou - pevná vazba na nitrobuněčné receptory - konformační změna receptorů - zvýšená afinita ke specifickým sekvencím DNA regulace transkripce cílových genů Signalizace zprostředkovaná nitrobuněčnými receptory 9 C-konec: doména pro vazbu hormonu N-konec: doména pro řízení transkripce Střed molekuly: doména pro vazbu DNA Struktura nitrobuněčných receptorů 10 1. Hydrofilní mimobuněčný signál (ligand, „primary messenger“): růstový faktor, cytokin, hormon, atd. 2. Povrchový receptor: převod mimobuněčného ligandu do podoby nitrobuněčného signálu 3. Sekundární přenašeč („secondary messenger“): nízkomolekulární struktury (cAMP, Ca2+, diacylglycerol, zbytek kyseliny fosforečné, atd.) produkt enzymově katalyzované reakce přenos signálu od povrchových receptorů k efektorům 4. Cílová molekula (efektor): enzym složka replikačního aparátu složka aparátu pro genovou expresi složka cytoskeletu Signalizace zprostředkovaná povrchovými receptory 11 Hlavní třídy povrchových receptorů 12 Jak receptory přenášejí signál přes plazmatickou membránu? 1. Konformační změnou vyvolanou vazbou ligandu, která se projeví v nitrobuněčné doméně receptoru typické pro receptory se sedminásobným vinutím membránou 2. Dimerizací ligand seskupí inaktivní podjednotky receptorů, které jsou schopny laterálního pohybu membránou dimerizace receptoru umožní přiblížení jejich tyrozinkinázových cytoplazmatických domén následkem je vzájemná fosforylace a aktivace receptoru 13 Receptory se sedminásobným vinutím membránou aktivace ligandem vede k vytvoření vazebného místa pro protein G (v cytoplazmatické části receptoru) aktivní receptor může interagovat s proteinem G: vazba vyvolá disociaci GDP z G proteinu a jeho nahrazení GTP aktivované receptory katalyzují výměnu nukleotidu vázaného k proteinu G aktivní G-protein s navázaným GTP reguluje několik důležitých enzymů zodpovědných za tvorbu sekundárních přenašečů 14 Dva typy proteinů G trimerní (velké) G proteiny, které se indukují přímou vazbou s receptory monomerní (malé) G proteiny typu Ras, které interagují s receptory nepřímo prostřednictvím adaptérů všechny stimulované G proteiny obsahují oblasti, které interagují s jinými proteiny a tak ovlivňují jejich aktivitu všechny G proteiny mohou vázat GTP/GDP a disponují GTPázovou aktivitou 15 Funkce trimerních G-proteinů spojovací články mezi povrchovými receptory a sekundárními přenašeči interagují pouze s aktivovanými receptory interakce s aktivovaným receptorem vede k výměně GDP na podjednotce α proteinu G za GTP podjednotka α s navázaným GTP se aktivuje a odděluje se od podjednotek β a γ uvolněná podjednotka α s navázaným GTP (podobně jako uvolněné podjednotky β a γ) může interagovat se svou cílovou molekulou v plazmatické membráně (efektorem), který signál předává dál značná rozmanitost efektorů G proteinů (adenylát cykláza, fosfolipáza C, cGMP fosfodiesteráza, různé typy iontových kanálků) 16 Funkce trimerních G-proteinů 17 G-proteiny mohou aktivovat enzymy vázané v membráně následná tvorba dalších signálních molekul nejčastějšími cílovými enzymy jsou adenylátcykláza (tvorba cAMP) a fosfolipáza C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu) spřažení mezi G-proteinem a tvorbou sekundárních přenašečů může být stimulační (Gs) nebo inhibiční (Gi) 18 Regulace tvorby cyklického adenozimnonofosfátu (cAMP) (cAMP objeven při studiu metabolismu glykogenu, Sutherland, 1958) G-protein: aktivace adenylátcyklázy 19 cyklický AMP koncentrace cAMP uvnitř buňky závisí na rovnováze aktivit adenylátcyklázy a cAMP-fosfodiesterázy adenylát cyklázy regulována proteinem G, aktivita cAMP-fosfodiesterázy nepodléhá kontrole (je konstitutivní) rozpustnost ve vodě umožňuje přenos cAMP od membrány k proteinům cytozolu nebo jádra aktivuje cAMP-dependentní protein kinázu (kinázu A) 20 Efektory cAMP Protein kináza A aktivována cAMP fosforyluje transkripční faktor CREB (zodpovídající za transkripci genů vybavených sekvencí CRE – „cAMP-response element“) v metabolismu glykogenu fosforyluje fosforylázovou kinázu (aktivace štěpení glykogenu) a glykogensyntázu (inaktivace syntézy glykogenu) 21 Struktura protein kinázy A Inaktivní stav: dvě regulační podjednotky (vazba cAMP) dvě katalytické podjednotky Aktivní stav: vazba cAMP – změna konformace regulačních podjednotek – disociace regulačních podjednotek z komplexu – uvolněné katalytické podjednotky mohou fosforylovat své substráty PKA: výskyt ve všech živočišných buňkách zprostředkovává většinu účinků cAMP 22 cAMP a metabolismus glykogenu 23 G-proteiny a ionty Ca2+ G-protein ovlivňuje hladinu iontů Ca2+ v cytozolu koncentrace Ca2+ v cytozolu a mimobuněčném prostoru není stejná: cytozol: 10-7M, mimobuněčný prostor: 10-3M důsledek aktivní činnosti iontových pump na membránách koncentrační gradient tlačí ionty Ca2+ do cytozolu zvýšená permeabilita membrány – vyšší koncentrace Ca2+ v cytozolu – aktivace nitrobuněčného signálního mechanismu 24 G protein otvírá kanálky Ca2+ vazba ligandu k receptoru – aktivace proteinu G – aktivace fosfolipázy C – tvorba inozitol trifosfátu a diacylglycerolu IP3 opouští plazmatickou membránu a difunduje cytozolem – otevře kanálky Ca2+ v ER – uvolnění Ca2+ 25 Efektory Ca2+ Troponin C – přítomen v buňkách kosterního svalstva - úloha při svalové kontrakci Kalmodulin – protein zprostředkující většinu reakcí na Ca2+ vazba Ca2+ na kalmodulin – změna konformace - zvýšení afinity pro jiné proteiny – změna jejich aktivity kalmodulin bývá stálou regulační složkou enzymových komplexů důležitou cílovou molekulou řízenou komplexy kalmodulin/Ca2+ je Ca2+-dependentní protein kináza (Ca-kináza), která fosforyluje Ser/Thr cílových proteinů 26 Katalytické receptory proteinkinázová aktivita vázaná na přítomnost ligandu zajištění odpovědi buňky na růstové faktory receptorovou úlohu má glykozylovaná N-koncová doména středová hydrofobní doména prochází membránou C-koncová doména má kinázovou aktivitu nebo je schopna asociovat s nitrobuněčnými kinázami – určuje typ signální dráhy a charakter buněčné odpovědi 27 Receptorové tyrozinové kinázy cytoplazmatická doména má tyrozinkinázovou aktivitu závislou na vazbě ligandu k mimobuněčné doméně většinou jediný polypeptidový řetězec, který prochází membránou šroubovicovou doménou (možnost laterální difúze membránou) vazba ligandu vyvolá dimerizaci podjednotek receptoru, což vede k transfosforylaci partnerské podjednotky: následkem je aktivace receptorové kinázy K fosforylovaným AK zbytkům se doménami SH2 váže řada různých proteinů 28 Doména SH2 spojuje receptorové PTK s nitrobuněčnými přenašeči 29 Signální dráha Ras první část: receptor-Grb2-Sos-Ras Grb2 je adaptérový protein s doménami SH2 a SH3 doména SH2 proteinu Grb2 se spojuje s aktivovanou receptorovou PTK doména SH3 spojuje Grb2 s proteinem Sos Sos je GEF protein - zajišťuje výměnu GDP za GTP na proteinu Ras (aktivace Ras) 30 Ras aktivuje dráhu MAPK druhá část: Ras-Raf-MEK-ERK-ELK1 aktivovaný Ras váže a aktivuje své efektory, např. Raf Raf je serin-treonin kináza, která spouští kaskádu kináz MAP (mitogenactivated protein kinases): Raf aktivuje MEK, MEK aktivuje ERK ERK přechází do jádra, kde aktivuje Elk-1 Elk-1 je transkripční faktor indukující transkripci proliferačních genů 31 Ras aktivuje dráhu MAPK Růstové faktory prostřednictvím dráhy Ras/MAPK zapínají expresi genů nutných pro růst a dělení 32 MAPK(„mitogen-activated protein kinases“) rodina serin/treonin PTK vysoká konzervativnost v eukaryontních buňkách účast na procesech proliferace, diferenciace, pohybu a buněčné smrti MAPK (ERK) jsou fosforylovány a aktivovány MAPK-kinázami (MAPKK) MAPKK (MEK) jsou fosforylovány a aktivovány MAPKK-kinázami (MAPKKK) MAPKKK (RAF) jsou aktivovány interakcí s malými G proteiny (např. Ras) nebo jinými kinázami, které jsou napojeny na povrchové receptory 33 Ras-GTP Ras-GDP Mutantní Ras v nádorových buňkách nemůže hydrolyzovat GTP a hromadí se v aktivním stavu GTP GDP Exchange X Ras a nádory 34 Souhrn buňky komunikují prostřednictvím signálních molekul signály buňky zachycují signály specifickými receptory na povrchu nebo uvnitř buněk rozmanitými nitrobuněčnými signálními drahami se signál o interakci ligandu s receptorem dostává k buněčným efektorům, který zajistí adekvátní reakci buňky schopnost produkovat a/nebo detekovat signály a adekvátně na ně reagovat je podmínkou řádného vývoje embrya i udržování homeostáze dospělého organismu v proměnlivém prostředí 35 Rakovina - definice název rakovina („cancer“) odvozen od latinského slova označujícího kraba (řecky: karkinos = krab, onkos = náklad, břemeno) choroba způsobená maligním nádorem nádor („tumor“) - neoplazie, novotvar - patologický útvar vytvořený v tkáni mnohobuněčného organismu, jehož růst se vymkl kontrole postihuje rostliny, živočichy, člověka (není to nemoc moderní doby) 36 Rakovina - milníky nejstarší zmínky: starý Egypt, 3000 – 1500 let před naším letopočtem (papyrus, popis nádoru prsu) Hippokrates: staré Řecko, 400 před naším letopočtem (zavedení termínu karkinos) Dr. Percivall Pott: Anglie, 1775 (vyšší výskyt rakoviny u kominíků, karcinogenní látka v sazích identifikována o sto let později) Wilhelm Röntgen, Německo, 1895 (objev paprsků, které se začaly používat pro radioterapii rakoviny Sidney Farber - 40. a 50. léta 20. století začátek chemoterapie rakoviny 37 Hippokrates a Galén Hippokrates (400 př.n.l.) – aplikoval poznatky o mechanice tekutin na lidské tělo a jeho nemoci - 4 hlavní tekutiny: krev, černá žluč, žlutá žluč a hlen Galén (160 n.l.) záněty: horký a bolestivý otok = nadbytek krve chladné a vlhké vředy, puchýře, katary = nadbytek hlenu žloutenka = nadbytek žluté žluče rakovina a deprese = nadbytek černé žluče univerzální lék – pouštění žilou Vesalius (16. století) – studiem anatomie vyvrátil domněnku o existenci černé žluče 38 Rakovina - základní charakteristika na buněčné úrovni genetická nemoc (důsledek mutací, které se přenášejí do dceřiných buněk) fenotyp nádorových buněk je dědičný (přenáší se do dalších buněčných generací) projevuje se změnou růstových a diferenciačních vlastností buněk a změnou jejich životaschopnosti začíná na úrovni jediné buňky 39 reprodukují se bez ohledu na potřeby organismu (nereagují na běžné buněčné signály) kolonizují tělní oblasti, které jsou vyhrazeny jiným buněčným typům narušují funkci postižených orgánů vyčerpávají organismus imunitní systém je obtížně odlišuje od buněk zdravých nádor je tvořen heterogenní a průběžně se dále vyvíjející populací buněk, které vykazují různou (a proměnlivou) citlivost k léčivům Proč jsou rakovinné buňky nebezpečné? 40 malá populace buněk uvnitř nádoru nesoucí znaky „kmenovosti“ – schopnost diferenciace do různých buněčných variant, které jsou v nádoru přítomny, nízká proliferační schopnost (běžné terapie jsou zaměřeny na rychle rostoucí buňky) často zodpovídají za znovuobjevení nádoru po léčbě zodpovídají za indukci nádoru po přenosu do zdravého organismu Nádorové kmenové buňky 41 Je rakovina dědičná nemoc? predispozice k tvorbě nádorů lze dědit: u vzácných familiálních rakovinných syndromů jsou zaznamenány zděděné zárodečné mutace běžné jsou nádory odvozené ze somatických buněk, ve kterých došlo k nežádoucí kombinaci nádorotvorných mutací zvýšená frekvence mutací/genomová nestabilita zvyšují riziko rakoviny 42 většina nádorů se objevuje v pokročilejším věku Vývoj rakoviny: postupné hromadění genetických změn 43 Nádory benigní (nezhoubné) pomalý růst podobnost s původní tkání (dobrá organizace buněk, vysoký stupeň diferenciace) ohraničenost, beze změny lokalizace většinou neohrožují život 44 Nádory maligní (zhoubné) vysoká proliferace (velká jádra, jadérka - tvorba ribozomů, polyzomy - tvorba proteinů potřebných pro buněčné dělení) změny v morfologii, velikosti a tvaru buněk nižší stupeň diferenciace metastázují 45 Benigní Maligní 46 47 I benigní nádory mohou být smrtelné! nadprodukce důležitých biologicky aktivních molekul (např. hormonů) Příklad: nádor žlaznatých buněk - Langerhansovy ostrůvky přílišná sekrece inzulinu - hypoglykemie - smrt poloha nádoru narušuje nějakou životní funkci Příklad: mozkové výstelka - narušení funkce vitálních center mozku - smrt 48 Klasifikace a nomenklatura nádorů název odráží původní tkáň, kde nádor vznikl přípona určuje, zda se jedná o nádor benigní nebo maligní -om (benigní) -karcinom (maligní epiteliální tkáň) -sarkom (maligní konektivní tkáň nebo sval) 49 Typizace nádorů - příklady Původ Benigní Maligní Epiteliální/Endoteliální Adenom jater, slinivky, tlustého střeva, ledvin, atd. Adenokarcinom jater slinivky,tlustého střeva, ledvin, atd. Mezenchymální pojivová tkáň Lipom Liposarkom Fibrom Fibrosarkom Chondrom Chondrosarkom Neuroblastom Retinoblastom Zárodek Teratom Teratokarcinom Embryonální karcinom Jiný Melanom Leukemie 50 Většina lidských nádorů je odvozena z epitelů epitely jsou povlaky buněk, které vystýlají tělní dutiny a pokrývají tělní povrch nádory epiteliálních buněk (karcinomy) tvoří největší skupinu lidských nádorů (více než 80% úmrtí na rakovinná onemocnění v západním světě) zahrnují nádory ústní dutiny, jícnu, žaludku, malého a velkého střeva, konečníku, kůže, prsu, slinivky, plic, jater, vaječníku, žlučníku a močového měchýře 51 Rakovina a viry? Šmarda_2011 52 Indukce sarkomů u kuřat Peyton Rous – Nobelova cena 1966 důkaz účasti virů u některých typů rakoviny 53 RSV je retrovirus odvozený od viru ptačí leukózy ALV Ohnisko „focus“ nádorových buněk 54 Akutně transformující retroviry transdukují onkogeny virus Rousova sarkomu (RSV) obsahuje gen (src), který se uplatňuje při vzniku rakoviny, ale nezajišťuje žádnou virovou funkci normální buňky obsahují příbuzný gen, který kóduje tyrosin kinázu Src normální gen (c-src) je protoonkogen, virový gen (v-src) je onkogen, kódující konstitutivně aktivní mutantní formu tyrosin kinázy 55 Akutně transformující retroviry běžně neinfikují člověka Šmarda_2011 56 Pomalu transformující retroviry netransdukují onkogeny integrují se do blízkosti buněčného protoonkogenu a podřídí jeho expresi svému promotoru: tím jej aktivují na onkogen 57 DNA-nádorové viry také obsahují onkogeny, ale ty se uplatňují jako přirozené regulátory virové replikace (nemají buněčné protějšky) SV40, Adeno, Papiloma rostou v klidových buňkách používají hostitelský aparát pro replikaci vlastní DNA stimulují přechod hostitelské buňky do S fáze “rané” virové proteiny fungují jako onkoproteiny nebo inhibitory nádorových supresorů Šmarda_2011 58 Nádor vzniká postupnou přeměnou zdravých buněk Mezi zcela normálním a vysoce maligním fenotypem je široké spektrum přechodných stádií. To signalizuje, že vývoj nádoru je složitý a vícestupňový proces. 59 Postupnost kancerogeneze spočívá v hromadění mutací Podmínkou přeměny zdravé buňky na nádorovou je kombinace následujících mutací v jedné buňce: mutace umožňující přežití a růst bez ohledu na vnější a vnitřní signály řídící růst, diferenciaci a apoptózu mutace umožňující únik z rodné tkáně mutace umožňující přežití a proliferaci v cizích tkáních mutace stimulující genetickou nestabilitu ("but not too much"!) 60 61 Které typy genů jsou při kancerogenezi mutovány? (A) protoonkogeny pozitivně ovlivňují buněčný cyklus (urychlují jej) kancerogenní jsou mutace způsobující hyperaktivitu jejich produktů („gain-of-function mutation“) dominantní charakter mutací 62 Které typy genů jsou při kancerogenezi mutovány? (B) nádorové supresory negativně ovlivňují buněčný cyklus (zpomalují jej) v případě poškození DNA umožňují její opravu kancerogenní jsou mutace eliminující jejich funkci („loss-of-function mutation“) recesivní charakter mutací Šmarda_2011 63 Selhání kontroly buněčného dělení souvisí s poruchou signalizace 64 Protoonkogeny a onkogeny protoonkogeny - přirozená součást genomu, plní fyziologické funkce, obvykle spojené s růstem a proliferací mutací nebo aktivací virem se protoonkogeny mění na transformující onkogeny onkogeny kódují onkoproteiny onkoproteiny se zapojují do mitogenních signálních drah a signalizací spojených s diferenciací nebo apoptózou na úrovni buňky se chovají dominantně, porucha v jedné kopii již vyvolává účinek (účinek jednoho onkogenu ale k vyvolání nádoru většinou nestačí) až na malé výjimky (např . onkogen ret) onkogeny nejsou dědičné (z rodičů na potomstvo) 65 Šmarda_2011 66 Funkce onkoproteinů jsou rozmanité růstové faktory receptory pro růstové faktory nitrobuněčné přenašeče transkripční faktory regulátory apoptózy proteiny řídící buněčný cyklus proteiny zapojené do oprav DNA 67 Onkoproteiny mohou být kódovány viry glykoprotein gp55 retroviru SFFV („spleen focus-forming virus“) indukuje erytroleukémii u myší gp55 je transmembránový protein schopný vyvolat dimerizaci a aktivaci receptoru EPO za nepřítomnosti jeho přirozeného ligandu vznik nadměrného množství erytrocytů 68 aktivující mutace nebo silná exprese receptorů pro růstové faktory mohou vyvolat transformaci buňky specifická bodová mutace mění normální receptor Her2 na onkoprotein Neu, který vytváří dimery a vykazuje kinázovou aktivitu i za nepřítomnosti ligandu delece domény pro vazbu ligandu receptoru pro EGF způsobuje vznik konstitutivně aktivní dimerizující formy (ErbB) v obou případech ztráta kontroly aktivity receptoru Aktivující mutace receptorových kináz napomáhají karcinogenezi 69 Onkogeny často kódují konstitutivně aktivní proteiny zapojené do signalizací kinázová aktivita c-Src je inhibována fosforylací Tyr 527 tyrosin 527 často chybí u onkoproteinů Src, které vykazují konstitutivní aktivitu (tj. nemusí být aktivovány fosfatázou) např. v-Src RSV postrádá 18 C-koncových AA, včetně Tyr 527 70 Přeměna protoonkogenů na onkogeny 71 Nádorové supresory Šmarda_2011 72 Inaktivující mutace nádorových supresorů G1 S G2 M Rb p21 ATM Většina nádorových supresorů funguje jako negativní regulátory buněčného cyklu p16 ARF pRb p53 p21 ATM 73 Funkce nádorových supresorů negativní regulátory buněčného cyklu (Rb, p16) negativní regulátory prorůstových buněčných signalizací (WT-1 inhibuje EGR-1; NF-1 inhibuje RAS) pozitivní regulátory mezibuněčné adheze (APC, DCC) složky aparátu rozeznávajícího poškození DNA a reparačního aparátu (p53, MSH2, MLH1) 74 Způsoby inaktivace nádorových supresorů mutace metylace DNA zablokování genové exprese 75 Mutace nádorových supresorů jsou u nádorů velmi časté postihují i sporadické (nedědičné) formy nádorů příklady mutací nádorových supresorů u nádorů tlustého střeva mutace p53 nalezeny v 70% sporadických nádorů tlustého střeva mutace APC nalezeny v 70% sporadických nádorů tlustého střeva mutace MSH2 nalezeny v 15% sporadických nádorů tlustého střeva 76 77 ztráta nádorového supresoru APC s následkem stabilizace β-kateninu a ovlivnění mezibuněčné adheze: vzniká malý výrůstek - polyp stimulující mutace ras: benigní adenom oslabující mutace nádorových supresorů DCC a p53; DCC se účastní regulace mezibuněčných kontaktů; p53 je součástí kontrolního bodu monitorujícího stupeň poškození DNA v buněčném cyklu: “late” adenom a karcinom Postupná přeměna zdravé střevní buňky na nádorovou 78 dědičná (familiální) forma: predispozice k rakovině (nádor retinoblastom, zhoubný nádor sítnice, je častý v dětském věku) sporadická forma: postupná inaktivace obou alel Rb Nádorový supresor Rb 79 model vzniku rakoviny u osob se zděděnou predispozicí a osob bez dědičné zátěže Alfred Knudson: teorie dvou zásahů 80 Ztráta heterozygotnosti (LOH) Druhá mutace Mechanismy ztráty heterozygotnosti Šmarda_2011 81 translokace t(9; 22) vedoucí ke vzniku onkogenu bcr-abl je spojena s chronickou myeloidní leukémií (CML) markerem je přítomnost “Filadelfského” chromozomu Transformace a translokace 82 Příčinou CML je selhání regulace c-Abl c-Abl je tyrozin kináza napomáhá transkripci genů zapojených do buněčného cyklu Proteinová chiméra Bcr-Abl má vysokou konstitutivní tyrozin kinázovou aktivitu 83 Úspěch protinádorové terapie: Gleevec/Imatinib Gleevec inhibuje aktivitu chimérické kinázy blokováním jejího aktivního místa vysoce specifická a netoxická terapie CML 84 Vlastnosti nádorových buněk klonální původ – nádory jsou obvykle odvozeny od jediné deregulované neoplastické buňky neregulovaný růst – nádorové buňky nereagují na normální regulační mechanismy ovlivňující růst, ale neomezeně proliferují změněná tkáňově specifická afinita – nádorové buňky prorůstají za hranice původní tkáně – metastázy 85 Vlastnosti nádorových buněk změněné biochemické vlastnosti, které zvyšují růstový potenciál: - zvýšená glykolytická aktivita umožňující růst i za snížených koncentrací kyslíku - sekrece hydrolytických enzymů umožňujících degradaci bazálních membrán a dalších struktur mimobuněčné matrix - tvorba angiogenních faktorů pozměněný cytoskelet – chybná organizace cytoskeletu a změněná buněčná morfologie chromozomové abnormality – změny v počtu chromozomů, časté delece, translokace a genové duplikace neomezený růst v tkáňové kultuře – nádorové buňky jsou obvykle nesmrtelné a mohou být neomezeně kultivovány in vitro 86 From Hanahan and Weinberg (2000) Cell 100:57 Cesty k rakovině 87 From Hanahan and Weinberg (2011) Cell 144: 645 88 (A) Nezávislost na růstových faktorech zdravé buňky nemohou proliferovat bez růstových signálů mnohé onkogeny v buňkách stimulují signální dráhy, které jsou ve zdravých buňkách aktivní pouze za přítomnosti růstových faktorů snížená závislost na růstových faktorech je zřejmá u nádorových buněk pěstovaných in vitro 89 Strategie buněk pro získání nezávislosti na růstových faktorech změna charakteru růstových faktorů nebo způsobu jejich tvorby změna transmembránových nebo nitrobuněčných přenašečů signálů Šmarda_2011 90 Změna charakteru růstových faktorů nebo způsobu jejich tvorby zdravé buňky obvykle produkují růstové faktory pro jiné buňky (heterotypická signalizace) nádorové buňky získávají schopnost syntetizovat růstové faktory, na které jsou citlivé (autokrinní stimulace) např. PDGF - produkován glioblastomy 91 zvýšená exprese genů kódujících povrchové receptory pro růstové faktory: zvýšení citlivosti buňky k běžným koncentracím růstových faktorů (např. exprese EGF receptoru je zvýšena u nádorů žaludku, mozku a prsu) změna struktury receptoru: konstitutivní aktivita Změna transmembránových přenašečů signálu 92 hlavní úlohu má kaskáda Ras-MAPK proteiny Ras jsou pozměněny u 25% lidských nádorů je pravděpodobné, že růstové signální dráhy jsou deregulovány u všech lidských nádorů Změna signálních drah 93 (B) Necitlivost na protirůstové signály Zdravá tkáň existence protirůstových signálů v podobě rozpustných faktorů a inhibitorů imobilizovaných v matrix a na povrchu buněk na protirůstové signály buňka (např. TGFβ) reaguje stejně jako na růstové faktory (prostřednictvím receptorů a nitrobuněčných signálních kaskád) Šmarda_2011 94 Ztráta signalizace TGFβ Nádorová buňka může ztratit citlivost na TGFβ: snížením exprese receptorů mutací v genu kódujícím receptor mutací v genu kódujícím některý z dalších nitrobuněčných přenašečů (proteiny SMAD) 95 (C) Metastázy přechod nádorových buněk z primárního nádoru do nové tělní lokalizace, ve které je dostatek prostoru a výživy umožněno změnami dvou typů proteinů: - proteinů, které zajišťují upevnění buněk k okolním buňkám (CAM) a matrix (integriny) - mimobuněčných proteáz (zvýšená exprese genů kódujících proteázy, snížená exprese genů kódující inhibitory proteáz) Šmarda_2011 96 Šíření nádorů 97 Lokalizaci buněk ve tkáních určují adhezivní molekuly a receptory 98 Metastázová kaskáda rozrušení bazální membrány oddělení buněk pohyb buněk invaze penetrace vaskulárního systému cirkulace rakovinných buněk opuštění krevního řečiště Šmarda_2011 99 Tvorba metastáz 100 Složky bazální membrány bazální membrána je tenká vrstva mimobuněčné matrix odděluje epiteliální buňky od prokrvených konektivních tkání bazální membrána musí být rozrušena, aby nádorové buňky získaly přístup ke krevnímu toku rozklad membrány zajišťují enzymy (proteázy) katepsin B je proteolytický enzym rozkládající složky bazální membrány: jeho hladina stoupá v krvi pacientů s nádory gastrointestinálního traktu a především u metastázujících nádorů plic a jater (marker metastázování) 101 Oddělení buněk nádorové buňky mají sníženou vzájemnou přilnavost důsledek redukce exprese genů pro adhezivní povrchové molekuly (kadheriny, kateniny) normální buňky téhož typu se od sebe v tkáni neoddělují transfekce invazivních buněk cDNA kódující kadherin E snižuje jejich invazivitu 102 Pohyblivost buněk nádorové buňky mají zvýšenou pohyblivost existují enzymy, jejichž přítomnost koreluje s pohyblivostí a metastatickým potenciálem buněk (např. glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza) cytokin AMF („autocrine motility factor“) stimuluje pohyb buněk: - produkován nádorovými liniemi - indukuje tvorbu pseudopódií 103 Invaze buněk průnik buněk konektivní tkání ke kapilárám obdoba překonání bazální membrány syntéza kolagenázy I a dalších rozkladných enzymů 104 Penetrace vaskulárního systému nádorové buňky se šíří krevními nebo lymfatickými kapilárami tlusté stěny kapilár se překonávají obtížně, zřejmě využívány drobné strukturní poruchy v nově tvořených kapilárách drobnými mezerami se buňky dostávají do kapiláry (diapedeza) 105 (D) Podpora angiogeneze angiogeneze = růst nových krevních vlásečnic život všech buněk je závislý na přísunu živin a kyslíku tvorba kapilár závisí na rovnováze mezi induktory angiogeneze (např. FGF, VEGF) a inhibitory angiogeneze (např. trombospondin-1) růst nádoru je omezen stupněm prokrvení; za nepřítomnosti živin a kyslíku nádor nemůže dosáhnout větší velikosti než průměru 1 mm3 (nekróza buněk ve středu kolonie nádorových buněk) nádorové buňky ve zvýšené míře tvoří induktory angiogeneze a méně inhibitorů angiogeneze 106 Vývoj nových cév za fyziologických podmínek Při růstu cév se uplatňují 2 mechanismy: – angiogeneze – růst nových cév ze starých – vaskulogeneze – tvorba cév „z ničeho“ – tj. sestavením a diferenciací endoteliálních prekurzorů u embrya kyslík ve tkáních difunduje do vzdálenosti 100 mikronů (0,1 mm) 107 Zapnutí angiogeneze je podmínkou růstu nádoru nádorové buňky produkují angiogenní faktory 108 Ovlivňováním angiogeneze lze s nádorem manipulovat angiogeneze je výsledkem dynamické rovnováhy mezi pro- a antiangiogenními faktory; pro terapii je vhodné odstranit proangiogenní faktory a přidat antiangiogenní cévy v nádorech jsou podobné běžným cévám, ale mají nižší stupeň organizace, mění se jejich průměr, mají heterogenní vzhled u různých nádorů vypadají cévy různě, protože vznikly působením různých kombinací pro- a antiangiogenních faktorů 109 Normální vaskulatura (vpravo) je velmi uspořádaná ve srovnání s vaskulaturou nádoru (vlevo) Vaskulatura nádoru je nedokonalá (ale stačí...) Šmarda_2011 110 Nádorová vaskulatura Časté jsou ohyby, nepravidelnosti, rozdíly ve velikosti 111 Látky s anti-angiogenním účinkem: potenciální léčiva - protilátky proti pozitivním regulátorům -VEGF or FGF-2 nebo jejich receptorům (zatím nejúspěšnější) - inhibitory matrixových metaloproteináz Angiostatin: vnitřní doména plasminogenu, 38 kDa, přímo snižuje proliferaci endoteliálních buněk, zvyšuje apoptózu Endostatin: C-koncový peptidový fragment kolagenu 18 , 20kDa, neovlivňuje proliferaci, ale zvyšuje apoptózu a tím snižuje počet krevních cév vyživujících nádory 112 (E) Neomezený replikační potenciál buňky pěstované v kultuře procházejí omezeným počtem dělení, pak se dělit přestávají, stárnou a odumírají inaktivací proteinů Rb a p53 buňky získávají schopnost dělení po další generace až do nástupu „krize“ buňky ve stadiu „krize“ jsou charakterizovány častými změnami karyotypu (vznik fúzních chromozomů) a masivně odumírají vzácně dojde k vzniku nesmrtelné buňky (frekvence 1:107) většinu nádorových buněk lze úspěšně pěstovat in vitro 113 Telomery: zajišťují počítání dělení buněk konce chromozomů složené z několika tisíců opakování krátké nukleotidové sekvence během každého buněčného cyklu dochází ke ztrátě 50-100 pb z konce každého chromozomu postupná eroze telomer vede ke ztrátě schopnosti chránit konce chromozomové DNA před chromozomovými fúzemi, které ve zdravém těle nejsou tolerovány a vedou k smrti buňky udržování telomer je běžné u všech typů maligních buněk (následek vysoké exprese telomerázy) zvýšení exprese telomerázy v buňkách in vitro prodlužuje počet pasáží, kterými buňka může projít Imortalizace a telomery 114 (F) Únik apoptóze rakovinné buňky se neřídí regulačními signály pro buněčnou smrt zdravé buňky mohou žít jen za přítomnosti růstových faktorů, jinak odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i bez růstových faktorů zdravé buňky s poškozenou DNA odumírají apoptózou x nádorové buňky nikoliv rezistence k apoptóze je jedním z důvodů zvýšené životaschopnosti nádorových buněk 115 Frost and Levin (1992): „There is nothing that a metastatic cell can do that is not a routine task for normal cells“. Neadekvátní chování nádorových buněk nevzniká de novo, ale souvisí s vyjádřením jinak normálních vlastností buněk v nesprávném místě a čase. 116 - např. granulocytů, lymfocytů, monocytů a makrofágů, myogenních kmenových buněk somitů, primordiálních zárodečných buněk Mobilita je vlastností mnoha normálních buněk 117 - např. proces oplodnění: probíhá mimo dělohu vyvíjející se embryo se dostává do dělohy až v okamžiku, kdy je schopné implantace děložní výstelky implantaci embrya zajišťují agresivní trofoblastové buňky, které mají schopnost rozložit děložní výstelku, včetně matrix konektivní tkáně a mateřských krevních kapilár (účast proteáz) obdobnou vlastnost mají buňky nádorové Agresivní chování nádorových buněk vůči okolním tkáním má rovněž fyziologickou obdobu 118 Stádia vývoje nádoru dle patologů: „grading / staging“ GRADE vyjadřuje stupeň diferenciace nádorových buněk, míru jejich cytologické odlišnosti od buněk zdravých a frekvenci mitotických buněk uvnitř nádoru nízký „grade“ charakterizuje dobře diferencované nádory s minimálním počtem cytologických abnormalit a nízkou frekvencí mitotických buněk vysoký „grade“ signalizuje, že nádory jsou složeny z málo diferencovaných buněk se zřetelnými cytologickými změnami a vysokou frekvencí mitóz 119 STAGE vyjadřuje velikost nádoru, rozsah jeho přechodu do okolní tkáně, rozšíření do lymfatických uzlin a přítomnost nebo nepřítomnost kostních metastáz Podle amerického systému AJC se rozlišuje T stage udávající velikost nádoru a stupeň penetrace do okolní tkáně, N stage udávající přítomnost nádoru v uzlinách a M stage udávající existenci metastáz v kostech. GRADE THE TUMOR! STAGE THE PATIENT! Stádia vývoje nádoru dle patologů: „grading / staging“