Genetická informace
a struktura nukleových kyselin
Přednáška kurzu Bi4010, Základy molekulární biologie, 2018/2019
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie PřF MU
2
DNA a geny
DNA obsahuje genetickou informaci
a tak tvoří hmotnou podstatu genů
gen je nukleotidová sekvence, která je nezbytná pro syntézu funkčního
genového produktu (polypeptidu nebo RNA) – nejde jen o kódující
sekvenci, zahrnuje i promotory, sestřihová místa, apod.
3
r. 1868: objev nukleinu
Johan Friedrich Miescher (1844-1895)
švýcarský přírodovědec a lékař
biochemický přístup: narušuje strukturu
buněk a snaží se popsat uvolněné složky
izoluje leukocyty z hnisu (na obvazech),
jaderné proteiny rozkládá pepsinem
(proteolytickým enzymem izolovaným
ze žaludku prasat)
v r. 1869 získává kyselou hmotu bohatou
na dusík a fosfor, kterou nazval nuklein
jeho výsledky nejsou přijaty k publikaci
až do roku 1871
funkce nukleinu zůstává dlouho nejasná
(polynukleotidové řetězce a jejich schopnost
uchovávat genetickou informaci jsou
objeveny až ve 40. letech 20. stol.)
4
Chromozomy a geny
geny jsou umístěny na chromozomech
chromozomy jsou tvořeny nukleovou
kyselinou (DNA) a proteiny
ve 40. a 50 . letech 20. stol. bylo jednoznačně prokázáno,
že genetická informace je uložena v nukleových kyselinách
a ne proteinech
5
Jaká molekula
nese genetickou informaci?
Odpověď se hledala obtížně:
byl znám jen vertikální přenos genů z rodičů na potomstvo
(Mendel, Morgan), kdy geny neopouštějí buňky a tím jsou
nepřístupné chemické analýze
pomohl objev horizontálního přenosu genů - transformace
transformace je běžná u bakterií (nikoliv u savců)
6
Objev transformace
Frederick Griffith (anglický bakteriolog)
ve 20. letech 20. století zkoumá bakterii Streptococcus pneumoniae
(pneumokok)
návaznost na obrovskou epidemii španělské chřipky v r. 1918,
často doprovázenou zápalem plic vyvolaným touto bakterií
Ministerstvo zdravotnictví požaduje výzkum pneumokoka
a vytvoření vakcíny
Frederick Griffith
(1879-1941)
7
Objev transformace
Frederick Griffith (1928):
existují 2 příbuzné kmeny
Streptococcus pneumoniae,
které se liší morfologicky
a stupněm patogenicity
kmen R tvoří drsné kolonie
a není letální
kmen S tvoří hladké kolonie,
po injekci usmrcuje pokusné
myši
8
Objev transformace
Streptococcus pneumoniae:
Kmen S: buňky obklopeny cukerným pláštěm, který usnadňuje
únik imunitnímu systému, proto vysoká virulence
Kmen R: buňky postrádají cukerný plášť, jsou méně nebezpečné
9
Griffithův experiment
virulentní hladké bakterie injikuje myším: smrt
virulentní hladké bakterie zabije teplem a pak provede injekci: přežívají
injekce směsí zabitých virulentních bakterií s živými nevirulentními: smrt!
pitva usmrcených myší: obsahují buňky virulentních bakterií S
neškodné bakterie R se nějak „transformovaly“ na virulentní S
10
Závěr Griffithova experimentu
existuje chemická látka schopná přenášet
dědičné instrukce mezi organismy – „genová
molekula“
zdrženlivý Griffith otálí s publikací tohoto
revolučního závěru
až v lednu 1928 na nátlak přátel svůj experiment
publikuje v neznámém časopise Journal of
Hygiene
článek psán v omluvném stylu za otřes, který
genetice způsobuje
11
Nositelkou genetické
informace je DNA
Oswald Avery
Colin MacLeod
Maclyn McCarty
(40. léta 20. století)
přímý důkaz: potvrzení Griffithova experimentu
za transformaci bakterií Streptococcus pneumoniae
zodpovídá DNA
přidání purifikované DNA k bakteriím mění jejich vlastnosti
(tvar kolonií, schopnost vyvolat onemocnění, apod.)
získané vlastnosti se přenášejí do následných generací
12
Averyho pokus
založen na transformaci bakterií R různými
frakcemi inaktivovaných bakterií S
transformaci vyvolává pouze DNA
13
Genetickým materiálem viru
tabákové mozaiky (TMV) je RNA
některé viry obsahují proteiny a RNA, ale žádnou DNA
důkaz kódující funkce RNA:
oddělení RNA a proteinů u dvou kmenů TMV (A a B, lišících se
chemickým složením proteinových obalů)
vytvoření virových částic smísením RNA (A) s proteinem (B)
vznikl životaschopný virus, jehož potomstvo mělo fenotyp A
po smísení RNA (B) s proteinem (A) vznikl virus s fenotypem B
závěr: potomstvo virů je genotypově a fenotypově shodné
s rodičovským virem, ze kterého pochází RNA
14
Struktura nukleových kyselin
lineární polymery složené z podjednotek - nukleotidů
Nukleotidy mají 3 složky:
pětiuhlíkový cukr
dusíkovou bázi
zbytek kyseliny fosforečné
15
Cukerné složky nukleotidů
ribóza u ribonukleových kyselin
deoxyribóza u deoxyribonukleové kyseliny
odlišnost je v přítomnosti/nepřítomnosti
hydroxylové skupiny na 2´-uhlíku
16
Dusíkaté báze nukleotidů
připojují se na uhlík 1 cukru
kovalentní N-glykozidickou vazbou
17
Dusíkaté báze nukleotidů
dva typy:
pyrimidinové (cytozin, tymin, uracil)
purinové (adenin, guanin)
18
Součástí nukleotidů
je zbytek kyseliny fosforečné
připojen k uhlíku 5 cukru esterovou
vazbou
poskytuje nukleotidu negativní náboj
19
Nukleosid
není totéž co nukleotid
20
Deoxyribonukleotidy
21
Polymery nukleotidů
tvoří nukleové kyseliny
zbytek kyseliny fosforečné spojuje sousední cukry
nukleotidů kovalentními fosfodiesterovými
vazbami mezi uhlíky 5´a 3´cukerných jednotek
pravidelné střídání motivu cukr-fosfát-cukr-fosfát...
tvoří cukr-fosfátovou kostru řetězců nukleových
kyselin
řetězce mají chemickou polaritu: 1 konec
obsahuje fosfát (5´-konec), druhý obsahuje
hydroxylovou skupinu (3´-konec)
22
Dvě varianty nukleových
kyselin: DNA a RNA
DNA
obvykle dvouvláknová
molekula
vlákna spojena vodíkovými
vazbami mezi dvojicemi bází
adenin - tymin a gunanin –
cytozin
RNA
obvykle jednovláknová
molekula
místo tyminu uracil
23
Objev
dvoušroubovice DNA
1953: James Watson a Francis Crick
odvozují strukturu DNA na základě těchto údajů:
chemická data: Erwin Chargaff
koncentrace tyminu je v organizmech
stejná jako koncentrace adeninu a
koncentrace cytozinu je vždy stejná jako
koncentrace guaninu
fyzikální data: Maurice Wilkins a Rosalind Franklinová
po vystavení purifikovaných molekul DNA rentgenovému záření,
dochází k charakteristickému rozptylu paprsků, které signalizují
způsob uspořádání složek DNA do šroubovice
24
Objev
dvoušroubovice DNA
25
Trojrozměrná
struktura DNA
za fyziologických podmínek
pravotočivá dvoušroubovice (B-forma)
protilehlé řetězce jsou vázány
vodíkovými vazbami mezi bázemi
báze orientovány dovnitř
dvoušroubovice, cukr-fosfátová kostra
je na její vnější straně
větší purinová báze se páruje s menší
pyrimidinovou
šroubovici stabilizují vazby nad sebou
umístěných aromatických kruhů
26
Trojrozměrná
struktura DNA
adenin se spojuje s tyminem
dvěma vodíkovými vazbami
guanin s cytosinem třemi
vodíkovými vazbami
27
Trojrozměrná
struktura DNA
báze se uvnitř dvoušroubovice orientují do energeticky nejvýhodnějšího
uspořádání
jedna otáčka šroubovice připadá na 10 párů bází, průměr 1,9 nm
vinutí vytváří v šroubovici velký a malý žlábek
obě vlákna dvoušroubovice jsou antiparalelní a plně komplementární
28
Alternativní formy DNA
B-DNA: ve vodných roztocích a běžných koncentracích solí
A-DNA: rovněž pravotočivá, s 11 pb na otáčku, objevuje se
u dehydratovaných vzorků
Z-DNA: levotočivá, s 12 pb na otáčku, výskyt u dvojšroubovic
bohatých na páry GC, funkce v živých systémech nejasná
29
Uchování a exprese
genetické informace v DNA
pořadí nukleotidů v obou řetězcích představuje genetickou informaci,
která se kopíruje před svým přenosem do dceřiné buňky
komplementarita řetězců umožňuje odvození sekvence nukleotidů
jednoho řetězce ze sekvence nukleotidů druhého řetězce – základ
dědičnosti genetické informace
odlišnost organismů vyplývá z odlišností v pořadí nukleotidů jejich DNA
lineární sekvence nukleotidů v genech
určuje lineární pořadí aminokyselin
a trojrozměrnou strukturu proteinů
trojrozměrná struktura proteinů
zodpovídá za jejich funkci
30
Struktura DNA vysvětluje
kopírování genetické informace
komplementarita vláken dvoušroubovice usnadňuje kopírování
a přenos genetické informace
vodíkové vazby mezi vlákny dvoušroubovice jsou mnohem slabší
než kovalentní vazby mezi nukleotidy uvnitř vláken: pomocí
určitých enzymů lze dosáhnout oddělení vláken a jejich kopírování
do komplementárního vlákna (replikace DNA)
31
DNA v chromozomech
chromozom je komplex DNA
a proteinů, které pomáhají
udržovat jeho strukturu
na chromozomu jsou v
lineárním pořadí uspořádány
geny oddělené regulačními a
mezigenovými úseky
32
Chromozomy prokaryot
kružnicové molekuly dvouřetězcové DNA
nesou většinou několik tisíc genů
intergenové úseky jsou velmi krátké, úspornost genomu
skupiny sousedních genů s minimálními mezigenovými úseky
(operóny) mohou sdílet jednu regulační oblast
při replikaci se v určitém místě dvoušroubovice rozvolňuje
a replikuje se oběma směry
33
Chromozomy
vyšších živočichů a rostlin
komplex lineární molekuly dvouřetězcové
DNA a proteinů
obsahují centromeru a koncové telomery
nesou až 50 000 genů
intergenové úseky jsou rozsáhlé
eukaryota jsou obvykle diploidní: v každé
buňce jsou chromozomové páry (u člověka
46 chromozomů, 23 párů, z toho jeden pár
pohlavních chromozomů)
ve světelném mikroskopu viditelné jen v době buněčného dělení
karyotyp: úplná sada metafázových chromozomů v dané
buňce/organismu – základ cytogenetických analýz
34
Sekvenování genomu
úplná sekvence známá např. u mnoha virů, bakterií, kvasinek,
octomilky, háďátka, myši, člověka, atd.
nalezení dosud neznámých genů
odhad počtu všech genů kódujících proteiny
odhad funkcí nových genů
srovnání mezi druhy – evoluční souvislosti
velká část genomu vyšších eukaryot nekóduje mRNA
v nekódujících oblastech DNA jsou podobné, ale nikoliv identické oblasti
vysoká variabilita některých repetitivních sekvencí (specifické pro každého
jedince)
dříve se nekódující oblasti považovaly za bezúčelnou „junk“ DNA
dnes se jim přisuzuje evoluční význam
35
Geny eukaryot
obsahují introny a exony
introny: nekódující sekvence
exony: kódující sekvence
evoluční tlak udržuje sekvence
exonů u různých jedinců
daného druhu ve stejné nebo velmi podobné struktuře
změny struktury intronů, včetně úplné ztráty, se tolerují: malý funkční
význam
funkce většiny sekvencí intronů není známa – patrně přispívají k
variabilitě proteinových struktur (alternativní sestřih), umožňují vazbu
regulátorů, podílejí se na regulaci genové exprese
36
DNA mitochondrií
a chloroplastů
obsahuje geny kódující proteiny související
s funkcí těchto organel (ale ne všechny)
součást genomu daného organismu
37
Solitérní geny a genové rodiny
25-50% genů mnohobuněčných organismů kódujících proteiny jsou
v haploidním genomu zastoupeny pouze 1x: solitérní geny
např. gen kódující lysozym (enzym, který štěpí polysacharidy
buněčné stěny bakterií, složka vaječného bílku, obsažen v slzách)
genové rodiny: geny s velmi podobnou, ale ne zcela identickou
strukturou, které kódují příbuzné proteiny (proteinové rodiny)
např. rodiny imunoglobulinů nebo kináz mají stovky členů
38
Rodiny globinů
rodina globinových genů kóduje proteiny
podílející se na tvorbě hemoglobinu
2 identické polypeptidy ß-globinu vytvářejí komplex se dvěma identickými
polypeptidy α-globinu + 4 hemové skupiny
všechny hemoglobiny přenášejí kyslík v krvi, odlišují se však
fyziologickými úkoly
určité typy globinů se exprimují jen ve vyvíjejícím se plodu – vytvářejí
hemoglobin s vyšší afinitou ke kyslíku než hemoglobin dospělých
(snadněji získávají kyslík z krevního oběhu matky placentou)
nižší afinita ke kyslíku je výhodnější u hemoglobinu dospělých
organismů, protože usnadňuje jeho uvolnění v tkáních, především
svalech, které mají při zátěži velkou spotřebu kyslíku
39
Vznik genových rodin:
duplikace
různé geny pro ß-globin vznikly duplikací původního genu
během evoluce se v obou genech hromadily náhodné mutace
mutace výhodné pro funkci přenosu kyslíku se fixovaly
v oblasti ß-globinové rodiny se nacházejí pseudogeny
pseudogeny se podobají původním genům (vznikly rovněž
duplikací), ale jsou kvůli mutacím nefunkční
pseudogeny nejsou škodlivé – pasivně se v genomu udržují
40
Tandemově opakované
řady identických genů
toto uspořádání mají především geny kódující RNA (např. rRNA
nebo RNA fungující při sestřihu), po kterých je v buňce vysoká
poptávka
kódují zcela nebo téměř identické produkty
geny jsou umístěny v mnohonásobném opakování bezprostředně
za sebou
41
Otevřený čtecí rámec (ORF)
úsek DNA, obsahující alespoň 100 kodónů, který začíná iniciačním a
končí terminačním kodónem, o kterém není známo, zda má kódující
funkci
42
Velikost genomu
a biologická komplexita
počet genů kódujících proteiny není přímo úměrný biologické
komplexitě organismu (C. elegans má více genů než octomilka,
člověk má jen o tisíc genů více genů než C. elegans)
ze struktury genomu nelze biologickou komplexitu odvozovat přímo
variabilitě přispívají:
alternativní sestřih
posttranslační modifikace
regulace genové exprese
43
Genetické rozdíly
mezi jednotlivci
odlišnosti v počtu kopií opakujících se sekvencí
využitelné pro profilování DNA (fingerprinting)
používá se pro identifikaci zločinců od r. 1988
pravděpodobnost shody profilů dvou osob je
zanedbatelná 1:109
44
Forenzní analýza
pro profilování jsou vhodné dva typy
polymorfismu DNA
tandemové repetice variabilního počtu (VNTR),
minisatelity, opakující se sekvence 10-80 pb
krátké tandemové repetice (STR), mikrosatelity,
opakující se sekvence o délce 2-10 pb
počet jejich kopií je vysoce variabilní a proto
ideální pro profilování
v určitých oblastech genomu je počet
opakování VNTR a STR snadno detekovatelný
(restrikční analýza, PCR, elektroforéza)
45
Genetické rozdíly
mezi jednotlivci
46
Strukturní organizace
eukaryotických chromozomů
velikost DNA monohonásobně přesahuje průměr buňky
DNA se organizovaným způsobem sbaluje do komplexu
s proteiny
speciální části chromozomů tvoří centromery a telomery
47
Centromera
zúžená oblast chromozomu v jeho střední části
místo vazby mikrotobulů dělícího vřeténka
nezbytná pro správnou segregaci chromozomů při
anafázi mitózy a meiózy
stejná funkce - podobná struktura u všech
chromozomů
obsahuje nukleotidové sekvence, na které se vážou
proteiny (kinetochory) zprostředkovávající vazbu
vřeténka
48
Telomery
(z řečtiny: telos = konec, meros = část)
Hermann J. Muller, 1938: první důkaz, že
absence přirozených konců chromozomů
drozofily (odstraněných rentgenovým zářením)
znemožňuje přenos chromozomů do buněk
potomstva
Barbara McClintocková, 1948: konce
přerušených chromozomů jsou lepivé a mají
tendenci se spojovat za vzniku fúzních
chromozomů; normální konce chromozomů tuto
vlastnost nemají
49
Hlavní funkce telomer
chrání konce lineárních molekul DNA před
deoxyribonukleázami
brání fúzi konců chromozomů s jinými molekulami
DNA
umožňují úplnou replikaci konců lineárních
molekul DNA (spolu s enzymem telomerázou)
Struktura:
obsahují krátké opakující se nukleotidové
sekvence
počet opakování sekvencí s věkem klesá
to neplatí pro embryonální kmenové buňky a
buňky nádorové, kde se telomery nezkracují
50
Hayflickův limit
Leonard Hayflick začátkem 60. let kultivoval
lidské buňky in vitro
po 50 – 70 cyklech zdvojování se buňky dělit
přestávaly a přecházely do senescence,
následně krize a odumíraly
důsledek kritického zkrácení telomer
korelace s celkovým stárnutím
Leonard Hayflick
(*1928)
51
Nádorové buňky dokážou
prodloužit život buněk
ztráta telomer je eliminována
aktivace telomerázy
alternativní prodlužování telomer rekombinací (bez účasti telomerázy)
52
Proteiny chromatinu
šetrnou izolací DNA z jader eukaryotických buněk se získá
nukleoproteinový komplex - chromatin
chromatin = komplex DNA a proteinů
2 typy chromatinových proteinů:
bazické (v neutrálním pH nesou kladný náboj) = histony
kyselé (v neutrálním pH nesou záporný náboj) = nehistonové
chromozomové proteiny
53
Histony
hlavní strukturní úloha v chromatinu
v buňkách přítomny v množství, které koreluje
s množstvím DNA
hlavní typy histonů: H1, H2a, H2b, H3, H4
v hojné míře zastoupeny bazické aminokyseliny s kladným nábojem
arginin a lysin (20-30% histonových aminokyselin), které interagují
s negativním nábojem fosfátových skupin DNA
vysoce konzervativní struktura histonů, přítomny téměř ve všech
buněčných typech
54
Složkami nukleozomů
jsou čtyři typy histonů
Nukleozomy
primární strukturní jednotky chromatinu
útvary vzniklé interakcí H2a, H2b, H3 a H4 s DNA o velikosti 146 pb
podíl na správném složení DNA
interakce mezi histony a DNA usnadňují elektrické náboje (DNA je
polyanion, histony jsou díky bazickým aminokyselinám polykationty)
při replikaci se DNA do nukleozomů sestavuje okamžitě pomocí
chaperonů
posttranslační modifikace histonů (např. acetylace) mohou ovlivnit
kompaktnost chromatinu (rozvolnění, aktivace genů)
55
Nehistonové proteiny
chromatinu
různé u různých buněk (i v rámci téhož organizmu)
nepodílí se na uspořádání DNA v chromozomech
účast na regulaci genové exprese
56
Tři úrovně sbalení eukaryotických
chromozomů: 1. nukleozom
jádro nukleozomu tvoří oktamer histonů 2x(H2a+H2b+H3+H4) a
nadšroubovicová DNA o velikosti 146 pb
úplný nukleozom je stabilizován histonem H1
výsledkem je interfázové chromatinové vlákno o průměru 11 nm
57
Tři úrovně sbalení eukaryotických
chromozomů: 2. solenoid
solenoid (30 nm chromatinové vlákno) vzniká v důsledku interakcí
mezi nukleozomy, způsobující vinutí chromatinového vlákna do
velké šroubovice s 6 nukleozomy na jeden závit
58
3. stáčení 30 nm vlákna do smyček
pomocí proteinového lešení ("scaffold")
proteiny nehistonové povahy (např. proteiny
HMG) tvoří proteinové lešení („scaffold“)
lešení napomáhá složení 30 nm vlákna do
kondenzovaného stavu
nejvýraznější kondenzace chromozomů
během mitózy
EM: lidský metafázový chromozom
po odstranění histonů
Histonový kód
N-konce aminokyselinových řetězců histonů jsou volné a
přístupné posttranslačním modifikacím
kombinace těchto modifikací v různých oblastech chromatinu
vytvářejí kód, který ovlivňuje funkci chromatinu – hlavně tvorbou
a odstraňováním vazebných míst pro specifické proteiny
ovlivňuje se tak úroveň kondenzace chromatinu (rozhodující pro
transkripci, replikaci reparaci DNA)
kondenzovaný chromatin: heterochromatin
rozvolněný chromatin: euchromatin
59
Heterochromatin
zůstává ve značně kondenzovaném stavu i v interfázi
typicky přítomen v oblasti centromery a telomer
silně barvitelný barvivy vážoucími se na DNA
transkripčně inaktivní
60
Euchromatin
méně kompaktní v interfázi
typicky přítomen v aktivně přepisovaných oblastech
slabě barvitelný barvivy vážoucími se na DNA
61
Posttranslační modifikace
histonů
epigenetické mechanismy regulace genové exprese
fosforylace H1: kondenzace chromozomů – ztížení transkripce
acetylace histonů nukleozomového jádra: rozvolnění chromozomů –
usnadnění transkripce
zajištěno enzymaticky
62
63
Schéma skládání
DNA v chromozomech