Přednáška kurzu BÍ4010 Základy molekulární biologie, 2018/19 Replikace DNA Jan Šmarda Ústav experimentální biologie, PřF MU ^ Buněčné dělení a reprodukce každá buňka potřebuje svou úplnou sadu genů: rodičovská buňka musí svůj genom před dělením duplikovat ■ geny jsou umístěny v DNA chromozomů: každý chromozom je třeba přesně zkopírovat a kopie rozdělit do dceřiných buněk ■ jednobuněčné organismy: buněčné dělení = reprodukce ■ mnohobuněčné organismy: reprodukce = vznik nových organismů, buněčné dělení = vznik nových buněk bez přímého spojení s rozmnožováním organismu 2 Replikace DNA mechanismus duplikace DNA před buněčným dělením Princip: ■ vlákna v duplexech DNA jsou komplementární: po oddělení může každé z nich sloužit jako předloha - templát pro syntézu vlákna nového nová vlákna vznikají postupným začleňováním nukleotidů na základě pravidel o párování bází na konci replikace je každé vlákno templátu spárováno s nově syntetizovaným vláknem replikace DNA je katalyzována enzymy Nucleotide precursor - G about to bind — A - A — C Template strand - T A — — G H C - Incoming bases — A T — forming new strand — C G - - A t Base pairing by H bonds Kontrola replikace DNA ■ proces musí proběhnout jen jednou v průběhu buněčného cyklu Dva hlavní principy: ■ o následném buněčném dělení se rozhoduje v okamžiku iniciace replikace - podléhá kontrole jako jiné fáze buněčného cyklu buněčné dělení nemůže nastat dokud není replikace dokončena Základní rysy replikace DNA ■ DNA se replikuje semikonzervativně ■ iniciace replikace DNA nastává ve specifických místech - počátcích replikace ("origins") ■ z místa počátku replikace DNA probíhá oběma směry (na každém vlákně jedním směrem) 5 I Replikace DNA je Xsem i konzervativní ■ obě vlákna slouží jako templáty ■ výsledkem je dvoušroubovice obsahující jeden původní a jeden nově syntetizovaný řetězec ■ každé vlákno rodičovské šroubovice zůstává zachováno ■ původní řetězce zůstávají intaktní po mnoho generací REPLICATION I 4 4 a x1 I If I 4 4 4 4 A A A A REPLICATION y\ /\ Av řv %%%%% $$444444 ÍUÄ4MÄ REPLICATION vodíkové vazby rodičovská vlákna ■ semikonzervativní: každé vlákno rodičovské dvoušroubovice se zachovává a uplatňuje jako templát ■ konzervativní: rodičovská dvoušroubovice se zachovává a řídí syntézu nové dvoušroubovice ■ disperzní: segmenty každého rodičovského vlákna se zachovávají a řídí syntézu segmentů nových komplementárních vláken, které se následně spojují Matthew Meselson a Franklin Stáhl (1958) prokázali platnost semikonzervativního modelu navrženého Watsonem a Crickem ■ důkaz byl založen na studiu hustoty DNA po označení těžkým dusíkem 15N 7 Uvažované modely replikace semikonzervativní konzervativní disperzní rodičovská DNA i JL JL první generace potomstva DNA druhá generace potomstva DNA 8 Důkaz sem i konzervativního modelu 14 generations oí growth CsCL v, Sem»-conservative "<í 0 1 2 3 4 Generation J f |100% 50% 25% 12% Q 100% + J 0 20 40 60 80 Time (min.) REPLICATION A A K %%%% iiii C C C C A A A ^REPLICATION s\ /k vv ?v REPLICATION Důkaz sem i konzervativního modelu Buňky £. co/i se kultivují po několik generaci na ,5N, Q Buňky se na jednu generaci přenesou do média obsahujícího "N. 4t O Extrahovaná DNA se analyzuje centrifugací v hustotním gradientu CsCI. ->■ generace 0 JL Analyzuje se extrahovaná DNA. Q Na dvě generace. f JL Q Na tři generace ri rS rS rS generace 1 O Analyzuje se extrahovaná DNA. generace 2 **£+ Analyzuje se extrahovaná DNA. generace 3 .hybridní" „lehká" kontrola kontrola směr --] sedimentace - „těžká" lehká DNA hustota DNA Rodičovská DNA je těžká. směs lěžké a lehké DNA Potomstvo první generace DNA je hybridní. Potomstvo druhé generace DNA je zpola hybridní a zpola lehké. Potomstvo třetí generace DNA je z jedné čtvrtiny hybridní a ze tří čtvrtin lehké. 10 Počátek replikace - "origin specifická nukleotidová sekvence (ori) každý počátek zajišťuje replikaci úseku DNA zvaného replikon u bakterií a virů je obvykle 1 počátek na chromozom (prokaryotické chromozomy obsahují jediný replikon) u velkých chromozomů eukaryot je mnoho počátků replikace (mnoho replikonů) , Replikační -^L bublina a vidlice po rozvolnění DNA v místě ori působením helikáz se templátové řetězce oddělují a vzniká replikační bublina od tohoto místa replikace probíhá v obou směrech a vzniká struktura tvaru "Y" zvaná replikační vidlice rozvolněná DNA a proteinový aparát v replikační vidlici tvoří replizom 1 jxm Replisome Topoisomérase s TT Primeosome Primase (c) 2000 CteňMi DNA poiymerases 12 . Počátek replikace E. coll J_ (oríC) m velikost 245 pb ■ přítomen v genomu 1 x ■ obsahuje 2 typy opakujících se sekvencí: - sekvenci 13 pb (opakovaná 3x, bohatá na AT, místo rozvolnění) - sekvenci 9 pb (opakovaná 4x, místo vazby proteinů, které jsou nezbytné pro tvorbu replikační bubliny) GATCTNTTNTTTT TTATNCANA 13 Počátky replikace u eukaryot ■ v genomu přítomny v mnoha kopiích ■ u kvasinek označované ARS (autonomně se replikující segmenty) - délka cca 50 pb - obsahují stěžejní sekvenci bohatou na AT o velikosti 11 pb velikost místa ori vyšších eukaryot dosahuje až několika tisíc pb Tvorba RNA-primeru po rozvinutí DNA v místě ori DNA-helikázou syntetizuje speciální RNA-polymeráza (primáza) krátké úseky RNA - RNA-primery - komplementární k odděleným templátům ■ RNA-primery se prodlužují DNA-polymerázou ■ pnutí v utahované šroubovici během replikace se uvolňuje DNA-topoizomerázou 15 Rozvíjení dvoušroubovice před replikační vidlicí podmínkou replikace je dostupnost nespárovaných nukleotidů v řetězci DNA dvoušroubovice je však stabilní (pro denaturaci je potřeba teplota blízká teplotě varu) otevírání dvoušroubovice napomáhají 3 typy replikačních proteinů: DNA-helikázy proteiny vážoucí jednořetězcovou DNA (SSB) DNA-topoizomerázy DNA-helikáza katalyzuje rozplétání rodičovské dvoušroubovice. 3' 5' ATP t ADP DNA-helikáza 16 DNA-helikázy Q Topoisomerase Q DNA (swivel) ( /• v helicase °Q/ enzymy tvořící šestipodjednotkové válce, které obklopují jednořetězcovou DNA vážou a hydrolyzují ATP a díky tomu se po jednořetězcové DNA pohybují když narazí na oblast dvouřetězcové DNA, pokračují ve svém pohybu, přičemž řetězce dvoušroubovice odtlačují od sebe Single-stranded DNA binding protein (SSB) < Proteiny vážoucí jednořetězcovou DNA (proteiny SSB) Devně se vážou na jednořetězcové úseky DNA vzniklé působením nelikáz, aniž by blokovaly báze, které tak zůstávají k dispozici pro párování vzniklé jednořetězce tím stabilizují brání náhodnému intramolekulárnímu párování (tvorbě vlásenek), které by komplikovaly replikaci DNA na DNA se vážou kooperativním způsobem (vazba 1 monomeru stimuluje vazbu druhého) Pro zajištění replikace udržuje protein vázající se na jednořetězce (SSB) vlákna DNA rozvinutá. DNA-polymeráza monomery SSB ^ i-----říj-] jednovláknová prerepfikační DNA bez proteinu SSB vlásenkové struktury MllLlUiUllUi^UimmuiilM jednovláknová ^——^—-X——^—X-—prereplíkační DNA pokrytá proteinem SSB DNA-topoizomerázy ■ katalyzují tvorbu přechodných zářezů v DNA ■ zářezy v jednom zajišťuje topoizomeráza I zářezy v obou vláknech zajišťuje topoizomeráza II = DNA-gyráza DNA-topoizomerázy DNA se před replikační vidličkou otáčí díky rozvíjení šroubovice bez přerušení vláken DNA-topoizomerázami by rozvíjení DNA vedlo k tvorbě pozitivních nadšroubovicových závitů Pro rozvinutí vláken tempiátu v E. co/; se musí šroubovice DNA před replikační vidlicí otáčet rychlostí 3000 rpm. ^<^On| místo, kde je nutná J^>\1 rychlá rotace šroubovice DNA >' templát vedoucího vlákna \ í-isí templát opožďujícího se "^^^^ vlákna 3' — DNA-polymeráza na vedoucím vlákně 5' nově syntetizovaný řetězec DNA Bez bodu nebo osy otáčení by před replikačními vidlicemi procesem rozplétání vznikalo pozitivní nadšroubovícové vinutí. replikace DNA V pozitivní nadšroubovícové závity DNA-topoizomeráza I katalyzuje přechodné zářezy v jednom vlákně DNA: kovalentně se připojí k jednomu z fosfátů v DNA přerušené vlákno DNA se může otočit kolem své podélné osy uvolnění tlaku obnovení dvoušroubovice uvolnění enzymu Q Jeden konec dvoušroubovice DNA se nemůže otočit vzhledem k druhému konci. 3'- P 5'- P IIIIII P -5' P -f £3f 9 DNA-topoizomeráza I se kovalentně připojuje k fosfátu v DNA, čímž přeruší fosfodiesterovou vazbu v jednom vlákně DNA. Energie původní fosfodiesterové vazby se ve fosfotyrozinové vazbě uchová, což způsobuje, že reakce je reverzibilní. Konce dvoušroubovice DNA se nyní mohou vzájemně otáčet. P —1 Opětným vytvořením fosfodiesterové vazby se obnovuje jak dvoušroubovice DNA, tak DNA-topoizomeráza I v původní formě. HO' 3'- P IIIIII 5'- P*-*P P -5' P -3' DNA-topoizomeráza I odstraňuje nadšroubovicové vinutí z DNA Double hnlix Double stranded helix Top o I Binding \ of To po I 3 negative S-lipsnciji Is 3' 5' Nick DNA: form □ova I Knt DNA-phosphotyrosinc b[]nd p -5> ůj3\ \ Tyr □ NA-enzyme inLtirrTisdiaLs Phhk ííuI 3' «nd under other s I rand and reseal DNA Dissocial i u n of To po I í negative superooils 22 DNA-topoizomeráza II (DNA-gyráza) katalyzuje přechodné zářezy v obou vláknech i Iniciace replikace: RNA-primery_ DNA-polymerázy nesyntetizují DNA de novo ■ pouze prodlužují již existující řetězec se správně spárovaným nukleotidem disponujícím volnou 3'-OH skupinou ■ nemohou tvořit DNA "z ničeho", dokážou prodlužovat krátký oligonukleotid - primer ■ jsou velmi přesné RNA-polymerázy ■ méně přesné, chyby jsou více tolerovány ■ nedisponují exonukleázovou korektorskou funkcí ■ mohou začít tvorbu nových polynukleotidových řetězců bez primeru ■ jako primery při replikaci DNA proto slouží krátké úseky RNA a. > > / Nucleotides y<< A * > T A \ DNA Polymerase ' \ .................... DMA Template No DNA Synthesis r r > DNA Synthesis! A, A Nucieotides Primer ■^j^. "{* ~f* DNA Polymerase Jfa1 "T A» DNA Template 24 Replikaci DNA katalyzují DNA-polymerázy ■ zajišťují připojení deoxyribonukleotidu definovaného templátem k 3'-OH skupině příměrového řetězce ■ katalyzují tvorbu kovalentní fosfodiesterové vazby mezi nimi Substrátové požadavky: ■ primerové vlákno s volnou 3'-OH skupinou ■ templátové vlákno DNA určující sekvenci nového vlákna ■ volné dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) ■ Mg2+ Replikace = kopírování DNA polymerace nově tvořeného řetězce probíhá jen ve směru 5'- 3' potřebná energie je zajištěna uvolněním pyrofosfátu z dNTP 5'triphosphate HO incoming deoxyribonucleoside triphosphate pyrophosphate thumb" 5'-to-3f direction of chain growth incoming deoxynucleoside triphosphate template strand 5> POSITIONING ■ \ \ OF INCOMING 1 1 DEOXYNUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE JX. NUCLEOTIDE i \ INCORPORATION FOLLOWED BY DNA TRANSLOCATION primer strand DNA-polymeráza I 5 - konec o NH, "0—P-O-CH II O H O 2 /°-H cytozin H O HN, guanin H2N' 0 1 "0-P-O-CH II O 2 ^0 H H V3 ;7H volný 3 - konec -OH — OH H smer prodlužován řetězce o o ý Q _ II II »-\ ^ c 0-P-0-P-r 0-P-O-CH, „ III 2 'a O" O- O" o HN_ 0^5 CH, tymin OH H prekurzor dTTP první DNA-polymeráza, kterou se podařilo izolovat (Arthur Kornberg, 1957; Nobelova cena 1959) Zdroj: E. co li Funkce: ■ oprava poškozené DNA ■ syntéza krátkých úseků DNA ■ odstraňování RNA-primerů = hlavní funkce 27 ■ DNA-polymeráza I L má nukleázovou aktivitu Nukleáza je enzym, který rozkládá nukleové kyseliny: ■ exonukleáza štěpí nukleové kyseliny od konců ■ endonukleáza štěpí DNA uvnitř molekuly DNA-polymeráza I má dvě nukleázové aktivity: ■ 5'^ 3' exonukleázovou aktivitu: odštěpuje krátké oligonukleotidy od 5 -konce DNA ■ 3'^ 5'exonukleázovou aktivitu: odštěpuje mononukleotidy od 3 -konce DNA 28 Exonukleázová aktivita 5 - 3 DNA-polymerázy zajišťuje odstraňování RNA-primerů exonukleázová aktivita 5' —► 3' štěpen' 3' ho 3' ho \ A T G C C G T A G T C A T C oh 3' G C é4ě C G T •t A oh 5' / / štěpení p; 5 + A T G Mi C T C oh 3' 29 Exonukleázová aktivita 3 - 5 DNA-polymerázy zajišťuje korektorskou funkci DNA-polymerázy exonukleázová aktivita 3' 3' ho 5' G C T A G T C A C G A T T © 3' ho 5' \ 5' G C T A G T C A T C G A T T s nesprávne spárované nukleotidy 5 ®J\NN\J\h oh , © ©sKoH štěpení 30 i Po lym e rázová aktivita 5- 3 jLoNA-polymerázy polymerázová aktivita 5' h0>©©@ 3' ho \ G C A T C G 5' 3" 3' ho f J 5' A G T C T \ A G C A T C G ®©©J\h P J 5' T A G T C A T C A oh 3' 31 Přehled DNA-polymeráz u E. coli: 5 DNA-polymeráz ■ replikaci DNA zajišťují DNA-polymeráza I (odstraňuje RNA primery, podíl na opravách DNA) a DNA-polymeráza III (vlastní replikáza) ■ na opravách DNA se podílejí DNA-polymerázy I, II, IV a V ■ rychlost replikace: cca 30 000 nukleotidů za minutu u eukaryot: 15 DNA-polymeráz ■ replikaci jaderné DNA zajišťují DNA-polymerázy a, 8, e ■ replikaci mitochondriální DNA zajišťuje DNA-polymeráza y ■ opravy DNA zajišťují DNA-polymerázy p, e, k, |i, a r\ ■ rychlost replikace: cca 3 000 nukleotidů za minutu ■ všechny tyto enzymy syntetizují DNA ve směru 5'- 3' a požadují volnou 3'-OH skupinu na konci primeru ■ DNA-polymeráza III je hlavní replikázou u E. coli ■ vícepodjednotkový enzym ■ minimální jádro s enzymovou aktivitou in vitro obsahuje podjednotky a, z, 6 ■ podjednotka (3 tvoří dimer, který brání předčasnému uvolnění DNA-polymerázy z templátu syntetizuje dlouhé úseky DNA katalytické jádro DNA-polymerázy III 5' ^r^) j dva monomery podjednotky p ^3 dimer podjednotky (3 tvoří klouzavý kruh obklopující molekulu DNA Korektorská funkce: kontrola přesnosti replikace přesnost kopírování je překvapivě vysoká: pouze 1 chyba na 109 kopírovaných nukleotidů korektorská funkce spočívá v kontrole konce právě syntetizovaného vlákna DNA, hledání chyb a jejich opravě bez korektorské funkce by DNA-polymeráza do DNA často včleňovala chybné nukleotidy a vznikaly by mutace o* T T T T A A I 1 I ---- unpaired 3'-OH end of primer blocks further elongation of primer strand by DNA polymerase T T T T -OH* 1111111 3'-to-5' exonuclease activity attached to DNA polymerase chews back to create a base-paired 3'-OH end on the primer strand DNA polymerase continues the process of adding nucleotides to the base-paired 3'-OH end of the primer strand T T T T T A A A A A A A A A 34 Korektorská funkce DNA-polymerázy na 3'-konci příměrového vlákna se objevuje chybný (nepárující se) nukleotid replikace se pozastaví exonukleázovou aktivitou 3'- 5'DNA-polymerázy se chybný nukleotid z řetězce uvolní DNA-polymeráza obnoví replikaci S' 5' 5" —G —G iř—G p p p Z"7-T -T -T z_ Z_ ♦ Z_ / Primer / ' / Z_?-A terminal 3.—^5. Z_,-A h^jŕ_ 5'—3' -A mismatch/ Exonuclease of >P_ Polymerase Z_ .„.. / 7 C A / polymerase / ^ activity / Cs::G— — t Z p 7 z 7 c A / polymerase 7 ^ activity 7 cG / z_ _/_-► Z_ _/ -► Z_ _/ *—p—c m g-*-7 z~7—c ;;;;; g-^-7 *—p—c m G-*—7 p / p / p / ^-7-G i!:!! C-^—7 ^-7-G E! C-^-7 ^-7-G E: C-7 p / p / p / ^-7-A ™: T-£-7 Z_,-A ™: T-^-7 ^—7-A ™: T-^7 3' 5' 3' 5' 3' 5' (a) (b) (c) ■ I Templátová vlákna jsou antiparalelní, ale DNA-polymeráza funguje jen ve směru 5- 3'! Jak může DNA růst ve směru 3'- 5'? ■ rozlišuje se vedoucí řetězec syntetizovaný ve směru 5'- 3' průběžně a opožďující se řetězec, syntetizovaný ve stejném směru přerušovaně ■ přerušovanou syntézou vznikají krátké tzv. Okazakiho fragmenty (dlouhé 1000-2000 nukleotidů u prokaryot, 100-200 nukleotidů u eukaryot) Okazakiho fragmenty se následně spojí do jednoho řetězce 36 . Okazaki -L a jeho fragmenty Objevitelé: Reiji Okazaki (1930-1975) a jeho manželka Tsuneko Okazaki (*1933) Nagoya University, Japonsko Reiji zemřel předčasně na leukémii na následek těžkého ozáření po bombardování Hiroshimi Tsuneko - první žena - profesorka v Nagoya University Vedoucí a opožďující se řetězec opožďující se řetězec vedoucí řetězec DNA polymerase DNA ligase 38 Syntéza RNA-primerů při replikaci DNA syntézu RNA-primerů zajišťuje komplex DNA-primázy a DNA-helikázy (tzv. primozom) primozom se pohybuje po molekule DNA poháněn energií ATP DNA-helikázová aktivita uvolňuje jednořetězce rodičovské dvoušroubovice DNA-primázová aktivita syntetizuje RNA-primery DNA-primáza (DNA-dependentní RNA-polymeráza) dokáže spojit dva ribonukleozidtrifosfáty na templátu DNA a dinukleotid prodloužit do krátkého polyribonukleotidu (10-60 nukleotidů u prokaryot, cca 10 nukleotidů u eukaryot) ve směru 5'-3'a vytvořit tak substrát pro DNA-polymerázu 5' l 3'H°-TT 111111111111111111111 3' 1......111111111 5' 1 RNA primer 3' DNA primase »'............... 5' 3' 39 Syntéza RNA-primerů při replikaci DNA Vedoucí řetězec ■ postačuje jeden RNA-primer ■ replikace DNA probíhá bez přerušení Opožďující se řetězec ■ po dokončení syntézy každého Okazakiho fragmentu se syntetizuje další RNA-primer [7 " Spojeni ' Okazakiho fragmentu. Spojení Okazakiho fragmentů DNA-polymeráza prodlužuje RNA-primer a tvorí nové vlákno DNA syntéza Okazakiho fragmentu na opožďujícím se řetězci DNA skončí, jakmile DNA-polymeráza narazí na RNA-primer předchozího fragmentu při vytvoření celistvé struktury DNA na templátu opožďujícího se řetězce se uplatňují opravné mechanismy: RNA-primery odstraní a nahradí je DNA kovalentní spojení 3'-konce jednoho fragmentu DNA s 5'-koncem jiného zajistí DNA-ligáza new RNA primer RNA synthesis by DNA primer primase 15' 3'«^ 5' 5' lagging-strand template 31 5' 31 5' 31 5' 3'H 5'H 3' DNA polymerase adds to new RNA primer to start new Okazaki fragment 3' DNA polymerase finishes DNA fragment old RNA primer erased and replaced by DNA 3' 15' 3' nick sealing by DNA ligase joins new Okazaki fragment to the growing chain 15' 3' Odstranění RNA-primerů RNA-primery jsou odstraněny 5'-3'-exonukleázovou a nahrazeny polymerační aktivitou DNA-polymerázy I 3'-OH konec jednoho Okazakiho fragmentu se spojí s 5'P koncem sousedního Okazakiho fragmentu DNA-ligázou rozvinuté misto vlákno Iniciace prereplikační DNA ^........... lllllllllllllllllllliHIIIIII misto iniciace (|P Iniciace syntézy RNA-primeru DNA-primázou. 5'->- S_ 5'----> 3' lllllllllll MU Q Prodlužováni RNA-primeru ve sméru 5' —►3' a odstranění DNA-primázy. 5'--- 1111111111 Q Syntéza DNA ve směru 5"-»3' DNA-polymerázou III iniciovaná ' volnou 3'-0H skupinou RNA-primeru. 5' 3' lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll 3' 1111111111111111111111 ' ■ ■............1111111......II 5' %3 Současné odstranění RNA-primeru exonukleázovou aktivitou 5' —> 3' DNA-polymerázy I a syntéza DNA ve směru 5' —> 3' : polymerázovou aktivitou DNA-polymerázy I. 51 -->■ 3' 5' **3' 5' -->-3' S*~3 3' 111111111 11 11111 11 11 ■ 111 11 11111111 11 ■ 11 11 111111 11 11 ■ 11 l l 111111 l o 1 5' -->-3' S f -->-3' 5' 3' 11 ■ 111■1111111111111111111111 11111 ■ l ■ l i l ■ 11 ■II 111111111111II ■ l ■ í 111 i 111 11111 i 11111 ■ 1 1111 11 i 11111 i 11111 i 111 ■ 1111111 ■ 1 i 1 1111 11 i 1 ^7 Kovalentni uzavření DNA-ligázou. ...... <• ^ Funkce DNA-ligázy DNA-ligáza opravuje "zářezy" v cukr-fosfátové kostře DNA, tj. porušené fosfodiesterové vazby DNA-ligáza se aktivuje vazbou ATP a přechodně se připojí k volnému 5'P v místě zářezu (uvolní se P-P) uvolněním AMP se obnoví kovalentní vazba v řetězci jednořetězcový zářez 0 — P — 0 'IIIIII ho \ 0 3'- P -5' enzym + ATP nebo enzym + NAD enzym-AMP \ / fosfodiesterové \~o-p-o-/ vazba 0 v / 5'- P 5' P 3'OH Av£áEäP> 3' ■ m^m ^ y s' |^ A-»JIJľXX y STEPI " 1 " \ ft -ZUT ľunti y « • m m • 4 used AMP released 3'- IIIII2 P -5' 43 Průběh replikace DNA v E. coli DNA-topoizomerázy vytvářejí v DNA přechodné zářezy, aby se DNA nesmotávala proteiny vážoucí jednořetězce (SSB) pokrývají rozvinutou DNA RNA-primery jsou nahrazovány DNA působením DNA-polymerázy I jednořetězcové zářezy jsou odstraňovány DNA-ligázou DNA-polymeráza III, která replikuje vedoucí vlákno bez přerušení DNA-polymerázy DNA polymeráza III - 1000 bází/sek ■ hlavní enzym syntézy DNA Roger Kornberg (*1947), Stanford University, USA Nobelova cena za chemii (2006) za výzkum mechanismu eukaryotické transkripce DNA polymeráza I - 20 bází/sek ■ editace, reparace DNA a odstranění primerů Arthur Kornberg (1918-2007), Stanford University Nobelova cena (1959) za fyziologii a medicínu za objev mechanismu syntézy DNA a RNA 45 Replikace DNA 1 otáčející se kružnicí ■ používaná viry ■ používaná bakteriemi pro přenos DNA z donora do recipienta Princip ■ mechanismus replikace kružnicových molekulu DNA ■ jedno rodičovské vlákno zůstává intaktní a otáčí se a zároveň slouží jako templát pro syntézu nového komplementárního vlákna 46 Replikace otáčející se kružnicí ■ iniciace: sekvenčně specifická endonukleáza štěpí jedno vlákno DNA v místě ori ■ neporušené templátové vlákno se otáčí kolem své osy a zároveň vytěsňuje 5-konec druhého vlákna ■ kovalentní prodlužování nastává od 3'-OH konce naštěpeného vlákna (není třeba RNA primer) ■ replikace DNA je úplná při otáčce templátu o 360° ■ terminace nastává ve specifických místech Ter, kde se zastavuje pohyb helikázy ■ mohou vznikat DNA dvou typů: - jednořetězcová kružnicová (po štěpení lineární DNA v oblasti ori a následné cirkularizaci) - dvouřetězcová kružnicová (ssDNA se použije pro syntézu dsDNA přes Okazakiho fragmenty, naštěpí se na jednotkovou délku a cirkularizuje se) rodičovská kružnicová dvoušroubovice DNA replikační počátek Sekvenčně specifická endonukleáza vytváří zářez v miste počátku. 5'-fosfát se odstraňuje a od 3-OH začíná kovalentní prodlužování. Kružnicové templátové vlákno pokračuje v otáčení za současného kovalentního prodlužování od 3'-OH. O Štěpením a opětným uzavřením do kružnicové formy vzniká jednořetězcová DNA. nebo Přerušovanou syntézou komplementárního vlákna vzniká dvouřetězcová DNA s jednořetězcovým templátovým segmentem, která se štěpí a opětně uzavírá do kružnicové formy. Okazakiho fragmenty ■ 3-OH ■ 5'-fosfát i Replikace eukaryotických chromozomů základní principy platné stejně jako u prokaryot Odlišnosti od prokaryot: přítomnost mnoha počátků replikace - řádově 10 000 syntéza DNA probíhá jen v určité fázi buněčného cyklu (S-fázi) RNA-primery a Okazakiho fragmenty jsou kratší více typů DNA-polymeráz 48 ^ Složky j eukaryotického replizomu průběžná syntéza vedoucího vlákna přerušovaná syntéza - opožďujícího se vlákna replikační faktor C PCNA (= „svorka") QNA-polymeráza replikační protein A topoizomeráza _& RNA-primer DNA-polymeráza a RNA-primer -DNA-primáza ribonukleáza h1 ribonukleáza FEN-1 Okazakiho fragment ■ rozvíjení šroubovice vyžaduje aktivitu DNA-helikázy a DNA-topoizomerázy ■ PCNA zvyšuje procesivitu enzymu ■ rozvinuté řetězce se obklopují proteinem vážoucím jednořetězce - replikačním proteinem A ■ replikace jaderné DNA se účastní 3 různé DNA-polymerázy: Pol a, Pol 5 a Pol £ 49 ^Eukaryotické DNA-polymerázy DNA polymerázy 8 a e mají vysokou procesivitu, jsou vhodné pro syntézu dlouhých vláken; mají 3'-5'exonukleázovou aktivitu pro korektorskou funkci, ale nemají 5'-3' exonukleázovou aktivitu pro odstranění RNA primerů ■ primery syntetizuje DNA-primáza a prodlužuje je Pola Pola udržuje stabilní komplex s DNA-primázou, napojuje na primery krátké řetězce DNA (cca 30 bp) při syntéze Okazakiho fragmentů ■ RNA-primery odstraňují samostatné enzymy: ribonukleázy H1 a FEN1 ■ mezery po primerech zaplňuje a další prodlužování zajišťuje Polo nebo Pol e ■ zářezy odstraňuje DNA-ligáza , Duplikace nukleozomů v replikačnich vidlicích EM: nukleozomy si udržují svou strukturu i vzájemnou vzdálenost na obou stranách replikační vidlice vzdálenosti nukleozomů v replikujícím se chromatinu - v;'••-.V; v.' 7 ' , nukleozomy ■ replikační vidlice 't^j^y^^y/^ý--■ ' \ " ^^^^ ''•^■■■.;^;-vt',*'--.'T"íít''"\ i t'1'.'■■*•■**•«:"-' ^■■.''"'•w--i'-V ';*v.'''*'■!■-- .-:-:v.1-"i'***:v--í'.! v v 1 ^m ■ nukleozomy se rozkládají a zase rychle skládají, aby umožnily duplikaci DNA ■ histony se syntetizují preferenčně během S-fáze 51 i Rozklad a sestavení nukleozomů ^ během replikace DNA Účast specifických proteinů: Nap-1 (nucleosome assembly protein 1): zajišťuje přenos histonů z místa jejich syntézy v cytoplazmě do jádra CAF-1 (chromatin assembly factor 1): zajišťuje přenos histonů do správných míst na chromozomech, kde mají vytvořit nukleozomy, váže se na PCNA sestavování nukleozomů během replikace chromozomu nukleozomový sestavovací protein-1 (Nap-1) nukleozomy . Replikace konců chromozomů: telomeráza problém s primerem pro telomery na opožďujícím se vlákně vzdálený konec konec směřující k centromeře 5' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ........111iiiiiimii.....- "V Okazakiho fragment RNA-primer 11111 li 1111 lil i li 111111111 li i u 111...........i ■ 1111 ■ - : ) 3'-OH skupina není k dispozici pro kovalentní prodloužení DNA-polymerázy nedokážou replikovat poslední segment opožďujícího se vlákna DNA lineárního chromozomu přidání koncových úseků (telomer) zajišťuje speciální mechanizmus, který je založen na aktivitě enzymu telomerázy 53 Telomeráza a replikace konců .chromozomů zabraňuje zkracování konců chromozomů během každého replikačního cyklu disponuje aktivitou zpětné transkriptázy (TERT) obsahuje RNA, která slouží jako templát pro zpětnou transkripci váže se na 3'-přečnívající konec a prodlužuje jej přidáním několika telomerových sekvencí Telomeráza řeší problém koncového primeru. ^rodičovské vlákno ^^Tag g g t t a g g g t t a g g g t t a i i i i i i aatccc-~^_ UUUuu^k j-,^- neúplné, nove syntetizované opožďující se vlákno O Navázání telomerázy. ttagggttagg _aatccc . telomeráza ^ Telomeráza prodlužuje 3'- konetí" (RNA-dependentn syntéza DNA). 111111 ttagggttag ......yATCCC Translokace. iiiiii" Q Několikrát opakované prodlouženi a translokace; uvolněni telomerázy. agggttagggttagg G/T T a g g g t t a aatccc / aaucccaau I I I I I I I I I I I I I I I I I I/"" j' I I I........III lllll'ttagggttaggg ttagggttagggtta ...... Q Dokončení komplementárního vlákna DNA-polymerázou (DNA-dependentní syntéza DNA). / LLLLLĽ ttagggttaggg t t a ď g g T T A ttagggtt aatccc f AA t a a u c c c *5' RNA-primer DNA-polymeráza Délka telomer a stárnutí většina somatických buněk nemá telomerázovou aktivitu (na rozdíl od buněk kmenových nebo nádorových) - telomery se postupně zkracují lidské somatické buňky pěstované v kultuře projdou jen omezeným počtem dělení (50 - 70 generací) - pak nastane stárnutí a smrt koreluje délka telomer a počet buněčných dělení, které předcházejí stárnutí a smrti vzácně se stane, že somatické buňky začnou v kultuře neomezeně proliferovat (= růst a dělit se): na rozdíl od svých předchůdců mají telomerázovou aktivitu obdobně se chovají nádorové buňky 55 Progerie ■ dědičná onemocnění typická předčasným stárnutím (např. Hutchinson-Gilfordův syndrom, Wernerův syndrom) ■ příznaky - předčasná plešatost, vrásčitost, apod.) se objevují krátce po narození ■ smrt nastává před 20. rokem věku (HGS) nebo před 40. rokem věku (WS) ■ v obou případech jsou v somatických buňkách zkráceny telomery a tyto buňky mají v kultuře sníženou proliferační schopnost Take home message syntézu DNA katalyzují DNA-polymerázy všechny DNA-polymerázy požadují příměrové vlákno (které se prodlužuje) a templátové vlákno (které se kopíruje) všechny DNA-polymerázy striktně požadují volnou 3'-OH skupinu na příměrovém vlákně a syntéza veškeré DNA probíhá výhradně ve směru 5' -> 3' 3'^ 5' exonukleázové aktivity DNA-polymeráz mají korektorskou funkci: kontrolují vznikající vlákna a odstraňují chybně spárované nukleotidy na 3' -koncích příměrových vláken replikaci konců lineární DNA zajišťuje telomeráza 57 (wish I was Adenine... so (get paired with U/