Přednáška kurzu BÍ4010 Základy molekulární biologie, 2018/19 ^ Transkripce DNA a sestřih Jan Šmarda Ústav experimentální biologie, PřF MU . Cesta od DNA ^ k RNA a proteinu tok genetické informace: 1. řizeni fenotypu: genová exprese centrální dogma přenos genetické informace z generace na generaci replikace transkripce DNA-dependentní RNA-polymeráza mRNA DNA-dependentni DNA-polymeráza zpětná transkripce RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná transkriptáza) U U U JJ-L translace složitý proces, do kterého jsou zapojeny ribozomy, tRNA a jiné molekuly Polypeptid vAAA/WW Pne ■ fenotyp je výsledkem funkce enzymů, tj. proteinů ■ proteiny jsou syntetizovány podle genetické informace: transkripcí a translací ■ každá porucha toku informace se může projevit defektem v tvorbě proteinu a fenotypovou změnou Přepis z DNA do RNA: transkripce převedení informace ze sekvence deoxyribonukleotidů jednoho z vláken DNA do sekvence ribonukleotidů v RNA (transkriptu) informace si v RNA udržuje podobnou chemickou povahu jako v DNA kóduje-li transkript protein, podrobí se translaci v ribozomech, tj. informace se převede ze sekvence ribonukleotidů do pořadí aminokyselin v proteinech I Transkripce a regulace genové exprese geny mohou být podrobeny transkripci a translaci s různou účinností provozní (housekeeping") geny se exprimují trvale většina genů se exprimuje jen, když je potřeba gene A TRANSCRIPTION RNA TRANSLATION v& v&/ ^ • •••• ##### ##### gene B ] DNA TRANSCRIPTION RNA TRANSLATION 4 ^ Transkripce u prokaryot a eukaryot EUKARYOTES Prokaryotes DNA Promoter Stn$I&ra1 DNA Prcsixrter Structural ge^^ Operon Transcription ^^^^ Monncisimiiu mRNA Polycistronic | Translation or Single protein Several proteins I Transkripce a translace u p roka ry o t_ primární transkript je ekvivalentní molekule mRNA mRNA se podrobuje translaci v ribozomech, které jsou díky absenci jaderné membrány snadno dostupné . Transkripce a translace -1 u e u kary o t_ ■ transkripce a translace jsou prostorově i časově odděleny ■ v jádře vzniká primární transkript (pre-mRNA) obsahující přepisy exonů i intronů ■ pre-mRNAse na obou koncích modifikuje a zbavuje přepisů intronů ■ po úpravách se mRNA exportuje do cytoplazmy, kde se podrobí translaci I Specialita genů eukaryot: -^introny_ introny: nekódující sekvence exony: exprimované sekvence objeveny v roce 1977 díky rozvoji sekvenačních technik sekvence zahrnující introny i exony se přepisují do pre-mRNA nekódující sekvence se následně vystepují sestřihem ("splicing") ve speciálních komplexech spliceozomech Eion DNA RNA transcript Exort Intra n Exon A gene composed of exons and introns is transcribed to RNA fay RNA polymerase. mRNA Processing Involves ribozymes and proteins In the nucleus to remove the Intron-derlved RNA and splice together the exon-derlved RNA into mRNA. After further modification, the mature mRNA travels to the cytoplasm, where it directs protein synthesis. Cytoplasm Cnpyrighr. & 20C4 pÉfli iCrt Eduřaliúil. řrti., pi.tx-:;lin ly .'ir; ií s ■ ;itrt nil CuilWiillyi. 8 Transkripce a úpravy RNA probíhají v jádře. Translace probíhá v cytoplazmě. lEukaryota TRANSKRIPCE ■ jaderná membrána odděluje prostor pro transkripci a sestřih (jádro) od prostoru translace (cytoplazmy) ■ existuje několik typů RNA, většinou se uplatňují mimo jádro, nutný export jadernými póry JÁDRO geny v DNA i transkripce CYTOPLAZMA ribozorn TRANSLACE <---í E | P 1 A ! X J, mm Icjo rnRNA míRNA ^ nebo^^ i-mRNA- štěpení represe mRNA translace Funkce molekul RNA všechny zapojeny do genové exprese: ■ mediátorová RNA (mRNA)—přenáší genetickou informaci z DNA do ribozomů ■ transferová RNA (tRNA)—adaptér spojující aminokyseliny a kodóny v mRNA ■ ribozomová RNA (rRNA)—strukturní a katalytická složka ribozomů ■ malé jaderné RNA (snRNA)—strukturní složky spliceozomů, účast na sestřihu pre-mRNA ■ micro RNA (miRNA)—krátké jednořetězcové RNA, které blokují translaci komplementárních mRNA ■ small interfering RNA (siRNA)—krátké dvouřetězcové RNA, které selektivně rozkládají komplementární mRNA a tak znemožňují jejich translaci další nekódující RNA (různé funkce, např. složka telomerázy) RNA jednořetězcová molekula skládá se do specifického tvaru (párováním bází uvnitř téže molekuly) podobně jako polypeptidový řetězec proteinu je méně stabilní než DNA (atom kyslíku v ribóze zvyšuje její reaktivitu) 5' end I 0 1 O— P=0 I o H,C S> 0 OH 1 O— P=0 ■ta O OH m I o—p=o o O OH \ b / U O—P=0 I o H,C S> 0 OH 1 3'end Transkripce má několik stejných rysů jako replikace DNA začíná rozvolněním malé oblasti dvoušroubovice DNA: obnažení několika bází obou řetězců jeden z řetězců DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárního vlákna (RNA) výběr začleňovaného nukleotidu vyplývá z principu párování komplementárních bází nový nukleotid je do rostoucího vlákna začleněn kovalentní vazbou vzniklá RNA je přesnou komplementární verzí templátového řetězce syntéza RNA probíhá ve směru 5'-»3' DNA ■ i■lil'iÍ template strand ■ TRANSCRIPTION 3' 5' 5' 3' RNA 12 Odlišnosti transkripce a replikace prekurzory jsou ribonukleozidtrifosfáty a ne deoxyribonukleozidtrifosfáty přepisuje se jen jedno vlákno DNA syntéza RNA iniciována de novo vzniklý řetězec RNA nezůstává připojen vodíkovými vazbami k DNA, ale odvíjí se od něj, čímž umožňuje obnovení ds struktury DNA transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce velikost transkriptů je podstatně menší než velikost genomu transkripci zajišťuje DNA-dependentní RNA-polymeráza, zatímco replikaci katalyzuje DNA-dependentní DNA-polymeráza 13 Odlišnosti ^ RNA- a DNA-polymeráz odlišná chemická povaha substrátů a produktů reakce ■ RNA-polymerázy mohou katalyzovat tvorbu RNA za neprítomnosti primeru RNA-polymerázy jsou méně presné než DNA-polymerázy 14 I Pro transkripci se využívá jen jedno vlákno DNA které vlákno je templátové určují signální sekvence (promotory) DNA syntéza RNA mRNA 5' templátové vlákno netemplátové vlákno \ templátové vlákno 5'-GCATACGATCAGGCTAACGC-3' netemplátové vlákno 5'-GCAUACGAUCAGGCUAACGC-3 smyslové vlákno RNA 15 RNA-polymerázy 3'5' direction of RNA polymerase transcription ...... *i ....;> / DNA double helix ribonucleoside triphosphates J ribonucleoside RNAexit active site triphosphate 5 channel newly synthesized short region of RNA transcript DNA/RNA helix uptake channel katalyzují tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy a vytvářejí tak lineární řetězec pohybují se podél DNA, postupně rozvíjejí dvoušroubovici, obnažují templátový řetězec pro párováni s komplementárními bázemi vznikající řetězec RNA se prodlužuje ve směru 5'-3' substráty polymerace jsou nukleozidtrifosfáty ATP, CTP, UTP a GTP nutnou energii poskytuje hydrolýza makroergických vazeb 16 I Průběh transkripce - stručný ^ přehled Pro mo ter Regio n RNA-polymeráza se váže na specifickou nukleotidovou sekvenci DNA, tzv. promotor o y v \vTtxwscv\oeA veg»o\o •> l l l m i i i i r> i i i i i i ai .............i..... i_i i i i i i i i i i i i ........... ■5' DNA, I poU/mex"«*e 5' i i i i i i i i i i i i ji ............ l l l l l i i l l ......... l l l l l l l ....... ■3' -5' t)NAk I 5' l i i i i i 3' 1 1 1 1 ' 1 i i i i i i i i i i i i i i i l 3' ........ť ONA 17 Průběh transkripce - stručný přehled první báze transkriptu neodpovídá první bázi kódující sekvence součástí transkriptu je krátká 5'-nekódující oblast RNA transkript je komplementární templátovému vláknu a má analogickou sekvenci jako kódující vlákno pol\ycr\exwbe 3 ' * III -.1 iii 111111111 ■ ■ 11111111 ■ li i i i i i i i i i i • i ............ 0 s' ° atgatctcgtaa 5' a@c>3' i i i i i i , T^CTA&ík&CATT , Proces transkripce je rychlý vzniklá RNA se rychle uvolňuje z templátu ■ transkripce téhož genu může být zahájena ještě před dokončením transkripce předchozí ■ stejný gen může být podroben často opakované transkripci ■ RNA-polymeráza se pohybuje rychlostí 20 nukleotidů za sekundu (u eukaryot), resp. 40 nukleotidů za sekundu (u prokaryot) za hodinu se může vytvořit více než 1000 transkriptů téhož genu vznik molekul rRNA a jejich spojení s ribozomovými proteiny 19 Fáze transkripce iniciace: rozeznání promotoru RNA-polymerázou, vazba na DNA, rozvinutí dvoušroubovice v místě startu transkripce, zahájení syntézy RNA elongace: pokračování v syntéze transkriptu podle informace v DNA-templátu terminace: ukončení syntézy transkriptu, uvolnění RNA-polymerázy z templátu Iniciace řetězce RNA. RNA-polymeráza DNA 5'-konec RNA Q Elongace řetězce RNA. DNA rostoucí řetězec RNA Q Terminace řetězce RNA. vznikající molekula RNA Terminologie transkripce Transkripční jednotka ■ úsek DNA, který začíná prvním a končí posledním přepisovaným nukleotidem ■ může a nemusí být ekvivalentní genu (u prokaryot běžně zahrnuje několik genů) i-1 Transcription unit Initiation site (i) Termination site (ŕ) DNA Terminologie transkripce Upstream" (proti směru) a "downstream" (po směru) oblasti transkriptu RNA, které sou umístěny směrem k 5'- DNA is unwound at promoter Very short chains are synthesized and released ELONGATION: Polymerase synthesizes RNA TERMINATION: RNA polymerase and RNA are released , Struktura ^ prokaryotických promotorů ■ krátké konzervativní sekvence vzdálené 35 a 10 nukleotidů proti směru transkripce od místa startu pro vazbu sigma faktoru ■ sekvence-35: TTGACA ■ sekvence -10: TATAAT (Pribnowův box, bohaté zastoupení AT, místo prvotního rozvíjení dvoušroubovice) transkripce ■ sekvence proti směru transkripce-•+*- sekvence po směru transkripce 26 I Elongace transkripce -^L u p roka ry o t katalyzována RNA-polymerázou po uvolnění a faktoru prodlužování RNA tvorbou kovalentních vazeb mezi ribonukleotidy RNA-polymeráza se pohybuje po templátu a postupně rozvíjí DNA za polymerázou se obnovuje dvoušroubovice DNA, tím se vytěsňuje vznikající vlákno RNA oblast přechodného párování mezi DNA a RNA je velmi krátká (cca 3 páry bází) rychlost: 40 ribonukleotidů za sekundu K DNA je navázána RNA-polymeráza a kovalentně prodlužuje řetězec RNA místo pro přiváděné ribonukleozidtrifosfáty rostoucí řetězec RNA 5' RNA-polymeráza dvoušroubovice DNA místo opětného krátká oblast místo rozvíjení splétání šroubovice DNA/RNA (a) pohyb RNA-polymerázy rostoucí řetězec RNA místo opětného splétání dvoušroubovice RNA místo rozvíjení (b) RNA-polymeráza se pohybuje po směru transkripce z místa znázorněném v (a) a postupně prodlužuje vznikající řetězec RNA. I Tel -X tra Terminace transkripce u p roka ry o t elongace transkripce pokračuje dokud enzym nezaznamená ve struktuře DNA terminační signál (terminátor) v místě terminátoru se pohyb RNA-polymerázy zastaví, přeruší se vodíkové vazby mezi DNA a RNA a transkripční komplex se rozpadá dojde k uvolnění řetězce RNA uvolněná RNA-polymeráza může znovu asociovat se sigma faktorem a opět zahájit transkripci 28 Typy bakteriálních terminátorů terminátory závislé na p (Rho) - vyžadují spoluúčast proteinu terminátory nezávislé na Rho - fungují bez účasti proteinů Terminátory závislé na Rho protein Rho se váže k syntetizované RNA ve specifickém místě umístěném proti proudu transkripce od terminátoru a pohybuje se po ní ve směru 5'- 3' i i ' mimi ■* ■ ' ■ ' -' RVv> na terminátoru se pohyb RNA-polymerázy zpomalí, protein Rho ji dostihne a zajistí uvolnění vlákna RNA 30 Terminátory nezávislé na Rho obsahují sekvence bohaté na GC, po kterých následuje šest nebo více párů AT do přepisu do RNA v důsledku ntramolekulárního párování bází GC vzniká vlásenka tato vlásenka zpomaluje pohyb RNA-polymerázy, což vede k terminaci transkripce v přilehlé oblasti AU a uvolnění transkriptu RNA, DNA 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5 ■i—i—i—i—i—i-i—i—i—i—i—i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 11 i i i i templátovévlákno DNA transkripce RNA-transkript 5'- CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3' rychlé skládáni RNA r" GA složená RNA ■ G ■ A ■ C ■ C ■ G ■ C ■ C ■ G Složený řetězec RNA napomáha terminaci řetězce. 5'- C C C A C U U U U OH-3' U prokaryot translace navazuje na transkripci transkripty (RNA) genů podléhají translaci na mnoha ribozomech současně DNA ribozomy směr transkripce 0,5 |im 32 Take home message syntéza RNA probíhá ve třech fázích : iniciace, elongace a terminace RNA-polymerázy jsou složité vícepodjednotkové proteiny, které katalyzují syntézu vlákna RNA komplementárního templátovému vláknu DNA kovalentní prodlužování řetězců RNA probíhá uvnitř oblastí lokálního rozvinutí DNA elongace končí v místech, kde RNA-polymeráza zaznamená signál pro terminaci transkripce i Transkripce a úpravy RNA u eukaryot odlišnosti od prokarvot: ■ RNA je syntetizovaná v jádře, ale proteiny v cytoplazmě ■ transkripty jsou monogenní ■ populace primárních transkriptů obsahujících přepisy ntronů a exonů se označuje heterogenní jaderná RNA (hnRNA, pre-mRNA) 34 . Transkripce a úpravy *L RNA u eukaryot_ odlišnosti od prokaryot: ■ 3 typy RNA-polymeráz (I, II, III), které jsou strukturně podobné, ale přepisují různé typy genů ■ primární transkripty genů kódujících polypeptidy podléhají před transportem do cytoplazmy třem modifikacím: - na 5'-konce primárních transkriptů se váže 7-metylguanozinová čepička - na 3'-konce primárních transkriptů se vážou úseky poly(A) (tj. sekvence 20 - 200 A) - z primárních transkriptů se před translací vystřihují introny 35 Modifikace eukaryotických transkriptů intron DNA RjjOWK&ffi^^ pre-mRNA QH CH, J 3 -N, ľ-melylgijaľiozin 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepička mRNA 5'-čepička i transkripce 0 0 0 II II II ,CH, -O-P-O-P-O-P-0 -CH OH H0\| I I I o- o- a o ' 0 O-CH, 1 3 0=P— 0— ribóza I O" Q Připojuje se úsek poly(A). Intron se vyštěpí. Q K 5 -konci se připojuje 7-MG čepička. -AAAAA(A)~190 AAAAOH úsek 3'-poly(A) úsek 3'-poly(A) úsek 3'-poly(A) 36 Tři typy RNA-polymeráz ^ eukaryot_ odlišnost v typu přepisovaných genů: ■ RNA-polymeráza I: geny kódující rRNA (5,8S, 18S a 28S) ■ RNA-polymeráza II: geny kódující mRNA (proteiny), miRNA, siRNA a většinu snRNA ■ RNA-polymeráza III: geny kódující tRNA, rRNA (5S), některé snRNA a další malé RNA TABLE 11.1 Characteristics of the Three RNA Polymerases of Eukaryotes Enzyme Location Products Sensitivity to ce-Amanitin RNA polymerase 1 RNA polymerase II RNA polymerase III Nucleolus Nucleus Nucleus Ribosomal RNAs, excluding 5S rRNA Nuclear pre-mRNAs tRNAs, 5S rRNA, and other small nuclear RNAs No sensitivity Complete sensitivity Intermediate sensitivity 37 Vlastnosti eukaryotických RNA-polymeráz obsahují 10 nebo více podjednotek pro správnou funkci nutná pomoc většího počtu transkripčních faktorů ednotlivé typy se liší citlivostí k houbovému jedu a-amanitinu, tferý funguje jako inhibitor RNA polymerázy II a producentem a-amanitinu je několik muchomůrek (Amanita): - RNA-polymeráza I je zcela rezistentní - RNA-polymeráza II je citlivá i k nízkým koncentracím - RNA-polymeráza III je citlivá k vyšším koncentracím Iniciace transkripce eukaryot ■ na rozdíl od prokaryot závislá na pomocných proteinech, které se vážou na promotory a účastní se tvorby iniciačního komplexu ■ teprve následně se k DNA připojuje RNA-polymeráza ■ RNA-polymerázy I, II a III používají různé promotory TATA box a CAAT box jsou přítomny u promotorů většiny genů RNA-pol II oktamerový box TATA box ATTTGCAT konzervativní sekvence počátek transkripce GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence -20 / \ / \ GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence +1 ■ Hlavní složky eukaryotických *L promotorů RNA-pol II 2 hlavní konzervativní elementy: TATA box: ■ konzervativní sekvence TATAAAA v netemplátovém vlákně ■ umístěn v oblasti -30 ■ důležitý pro správné umístění transkripčních faktorů vzhledem k počátku transkripce CA AT box: ■ konzervativní sekvence GGCCAATCT v netemplátovém vlákně ■ umístěn v oblasti -80 ■ ovlivňuje účinnost iniciace transkripce 40 ^ Základní transkripční faktory ■ uvádějí RNA-polymerázu přesně na promotor a ke startovacímu nukleotidu ■ podílejí se na rozvolnění řetězců DNA před začátkem transkripce ■ uvolňují RNA-polymerázu z promotoru při přechodu z iniciace do elongace ■ fungují na téměř všech promotorech RNA-polymerázy II ■ označují se TFIIX (Transcription Factor for Polymerase II, kde X je písmeno specifické pro daný faktor) 41 Iniciace transkripce RNA-pol. II základní TF musí s promotory reagovat ve správném pořadí: TFIID (a několik malých proteinů) rozeznává a váže TATA box následuje vazba TFIIA a po něm TFIIB -30 -10 HO +30 [-->- místo počátku ' transkripce ITr?TOlrr^rfflr^TOfflrT^fflnrlrTlr?lrWlr?^r^rT^rWí O Na TATA box se váže TFIID. D r i +1 n íi n n ii ií n it n n n i mwm ri i • 111 K iniciačnímu komplexu se připojuje TFIIA, O K iniciačnímu komplexu se váže TFIIB Iniciace transkripce ^ RNA- pol- II_ ■ TFIIF se nejdříve spojí s RNA-pol II a společně se připojují k iniciačnímu komplexu TFIIF má schopnost lokálně rozvinout DNA (podmínka iniciace) připojuje se TFIIE k TFIIE se pak připojují TFIIH a TFIIJ TFIIH má helikázovou aktivitu a pohybuje se během elongace podél DNA s RNA-polymerázou II - tvoří transkripční bubliny TFIIH rovněž fosforyluje RNA-polymerázu II, čímž mění její konformaci, uvolňují se základní transkripční faktory a začíná elongace Q Ke komplexu se připojuje TFIIF, který má rozplétací aktivitu; zároveň se připojuje polymeráza I O K iniciačnímu komplexu se váže TFIIE. RNA-polymeráza II 43 I RNA-pol. II spolupracuje ^ s dalšími proteiny aktivátory transkripce: vážou se do specifického místa DNA („enhancer") a přitahují RNA-polymerázu II k promotoru mediátorový komplex: zprostředkovává interakce mezi aktivátory, RNA-polymerázou II a základními transkripčními faktory chromatin remodelující komplexy a enzymy: usnadňují přístup DNA v chromatinu activator protein enhancer (binding site for activator protein) TATA box start of BINDING OF transcription GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS, RNA POLYMERASE, MEDIATOR,CHROMATIN REMODELING COMPLEXES, AND HISTONE ACETYLASES chromatin remodeling complex histone-modifying enzyme TRANSCRIPTION BEGINS 44 . Při elongaci transkripce ^ eukaryot se RNA upravuje nastává po uvolnění iniciačních faktorů, RNA-pol II se uvolňuje z iniciačního komplexu C-koncová doména RNA-pol II se fosforyluje a tím mění konformaci a mění se spektrum proteinů, se kterými interaguje RNA-polymeráza II se spojuje s elongačními faktory v rané fázi elongace se modifikuje 5'-konec transkriptu čepičkou 45 Modifikace konců transkriptů připojení čepičky na 5'-konec („capping") připojení polyadenylačního signálu na 3'-konec umožňují buňce vyhodnotit, že jsou oba konce k dispozici a že transkript je intaktní před svým transportem z jádra do cytoplazmy procaryotic mRNA 5' P P P coding sequence noncoding sequence protein a protein p* protein 7 eucaryotic mRNA coding sequence noncoding sequence A AAA A15Q_25o 3' protein Modifikace 5 -konců transkriptu nastává po syntéze prvních cca 25-30 nukleotidů mRNA připojení 7-metylguanosinu (čepičky) na 5'-konec 7-methylguanosine i-1 HO OH 5' end of primary transcript r a 5' CH2- P - P- P-CH 5' I CH, L J 5'-to-5' triphosphate bridge OH LO CH, OH 47 Modifikace 5 -konců transkriptů probíhá ve 3 navazujících krocích: fosfatáza odstraňuje fosfát z Dokonce vznikajícího transkriptů guanylyltransferáza na konec naváže GTP (vazba 5'-5') metyltransferáza na guanozin naváže metylovou skupinu Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou II. RNA-polymeráza II 5' 7-MG \ 5'-čepička V" CH3-GpppNpNp CH, t 2'-0-metyltransferáza CH,-GpppNpNp T guanin-7-metyltransferáza GpppNpNp i=i A < 5'- konec primárního transkriptů PP. + P. guanylyltransferáza - GTP pppNpNp K čemu je dobrá čepička? Čepička Leap") pomáhá buňce odlišit mRNA od jiných typů RNA Dředstavuje vazebné místo pro „cap-binding complex", tferý napomáhá sestřihu a exportu transkriptu z jádra účast na iniciaci translace - rozeznávána iniciačními proteiny ochrana transkriptu před nukleázami , Terminace transkripce ^ a přidání poly(A) ■ transkripce probíhá za místo, které se stane 3'-koncem transkriptu v místě vzdáleném 10-30 nukleotidů po proudu transkripce od konzervativní sekvence AAUAAA dochází k endonukleolytickému štěpení po rozštěpení RNA se připojuje k 3'-konci transkriptu úsek cca 200 adenozinmonofosfátových zbytků - poly(A); katalyzováno poly(A)-polymerázou Význam polyadenylace: - zvýšení stability transkriptu - účast na transportu transkriptu do cytoplazmy RNA-polymeráza II transkripčni jednotka / .....\ \ 9 Štěpení endonukleázou. > aauaaa ^bohatá na GU endonukleolytické štěpení 5'- čepičkat==- ~JÄŕ~ Přidání úseku poly(A) ™ poly(A)-polymerázou. ^ 5'- čepička'- -1 3' aauaaa -1 aaaaa(a)1g5 3 aauaaa i i v úsek poly(A) 50 Editace RNA ■ posttranskripční úpravy mRNA výjimka z pravidla, že se genetická informace v průběhu exprese nemění změna informace v transkriptu: ■ v důsledku změny struktury jednotlivých bází ■ inzercí nebo delecí zbytků uridinmonofosfátu 51 Editace RNA změnou bází vzácná, objevena při studiu exprese genu pro apolipoprotein apolipoproteiny zajišťují transport některých tuků v krvi ve střevě mRNA apoB kóduje menší protein (2153 AK) důsledek přeměny C na U vedoucí k terminačnímu kodonu UAA uvnitř pre-mRNA apoB přeměna C na U katalyzována sekvenčně specifickým proteinem, který zajišťuje oxidativní deaminaci cytozinu v játrech mRNA apoB kóduje velký protein (4563 AK) N H O Editace RNA změnou bází dna ^:jwy^jwm35: RNA editing: oxidative deamination of cytosine Apolipoprotein Apolipoprotein 4563 amino acids long 2153 amino acids long I Editace inzercí nebo delecí ^ zbytků uridinmonofosfátu I Editace inzercí nebo delecí zbytků uridinmonofosfátu ■ transkripty se pozměňují inzercí (vzácněji delecí) zbytků uridinmonofosfátu ■ následkem je změna kódujícího smyslu transkriptu ■ zprostředkováno vedoucími (guide) gRNA, což jsou produkty transkripce specifických mitochondriálních genů ■ určitá komplementarita mezi vedoucími RNA a úseky pre-mRNA, které mají být editovány umožňuje jejich částečné párování ■ některé báze A v gRNA zůstávají po vazbě na pre-mRNA nespárovány ■ editaci katalyzuje multiproteinový komplex: editozom, který se pohybuje po částečně dvouřetězcovém hybridu pre-mRNA-gRNA ■ když narazí na nespárované nukleotidy (A), gRNA slouží jako templát, podle kterého se do pre-mRNA začleňují U (komplementární k nespárovaným A v gRNA) ■ pozůstatek dávného světa RNA? ■ primitivní způsob regulace genové exprese? 55 Editace inzercí nebo delecí zbytků uridinmonofosfátu Addition of Uracil to RNA Transcription of DNA to Pre-edited RNA AGCUGCCAAUUGCGCAUUCCAACCGGAUACGCG. Guide RNA gives template for editing U CG A.C.G.G.U UAACGAACGUAAGAGUUGGCCUAUG DNA Pre-edited RNA gRNA AGCUGCCAAUUGC GCAUUC CAACCGGAUAC Editing ofpre-mRNA or.rnnrr* a tt uGjC,U UGXA.U U C U CA A H H Ír fí A TT ň H Pre-edited RNA Edited RNA Translation ta protein or other pathway Přerušované geny eukaryot 1977: objev nekódujících sekvencí - intronů („intervening sequences") - které přerušují sekvence s kódující funkcí - exony (exprimované úseky) Phillip Allen Sharp (*1944) Richard J. Roberts (*1943) NEW ENGLAND spoluzakladatel firmy biotechnologické firmy Biogen Idec Nobelova cena za fyziologii a medicínu v roce 1993 vedoucí pracovník biotechnologické firmy New England Biolabs 57 ^Přerušované geny e u kary o t ■ počet intronů a jejich délka u různých genů značně kolísá ■ exony i introny jsou podrobeny transkripci za vzniku hnRNA ■ přepisy intronů jsou následně z hnRNA odstraněny sestřihem za vzniku zralé mRNA ■ teprve zralá mRNA se transportuje do cytoplazmy, aby se podrobila translaci Biologický význam intronů vliv na genovou expresi (vazebná místa pro regulátory) ■ poskytují evoluční výhodu zvýšením rychlosti, se kterou se mohou exony přeskupovat rekombinací ■ podíl na alternativním sestřihu ■ zdroj regulačních RNA 59 , Odstranění intronů: sestřih („splicing") RNA požadavek vysoké přesnosti (na 1 nukleotid) ■ na hranicích intron/exon jsou konzervativní sekvence: exon-GU....intron....AG-exon gen i exon 1 intron A 1 exon 2 intron B I exon 3 DNA ^ transkripce primární 5' exon 1 i intron A exon 2 intron B i i exon 3 3' i transkript \ v\ kodon n i i W : kodon n + 1 n ii ' i / \ \ \ \ \ \ ii / ; úpravy RNA v \ , T , / \ v " / / \ \ 1 1 / / mRNA \ * 1 1 ' / \ exon 1 exon 2 exon 3 / III w kodon n n + 1 ^ translace Polypeptid NAAAAAAA/ 60 L Typy intronů ■ introny jaderné pre-mRNA ■ typické dinukleotidy na hranicích intron/exon ■ konzervativní sekvence v blízkosti 3'-konce ■ netvorí žádnou charakteristickou sekundární strukturu ■ vystepují se pomocí spliceozomů ■ introny v organelách (mitochondrie, chloroplasty) vystepují se z RNA autokatalyticky („auto-splicing", „self-splicing", samosestřih) ■ nepožadují proteinovou enzymovou aktivitu 61 i Odstranění intronů: tři různé mechanismy introny prekurzorů tRNA se vystepují přesným endonukleolytickým štěpením, po kterém následuje ligace introny některých prekurzorů rRNA se vystepují autokatalyticky (bez účasti proteinů) introny prekurzorů jaderných mRNA se vystepují dvoufázovou reakci, kterou zajišťují ribonukleoproteinové částice spliceozomů 62 Sestřih prekurzorů tRNA / fntronof 10-20 nucleolides OH 5* nuclease pho3phate diesterase 3. Kinase (ATP) Spliced Ó 4, Ligase(ATP) *RNA 5. Phosphatase Excised inlron fáze 1: ■ sestřihová endonukleáza navázaná k jaderné membráně přeruší prekurzorovou tRNA přesně na koncích intronu ■ na specifitě reakce se podílí trojrozměrná struktura RNA fáze 2: ■ sestřihová ligáza spojí příslušné dva fragmenty tRNA k sobě za vzniku zralé tRNA 63 I Autokatalytický sestřih L prekurzorů rRNA (samosestřih) ■ nevyžaduje externí zdroj energie ■ nevyžaduje katalytickou aktivitu proteinu ■ probíhá formou sérií přenosů fosfoesterových vazeb; žádná nově nevzniká, ani nezaniká (transesterifikace) požadavek na guaninový nukleotid s volnou 3'-OH skupinou (GTP, GDP nebo GMP) ■ intron se postupným přenosem fosfoesterových vazeb se zapojením volného G vystepuje a cirkularizuje (vzniká lasovitá struktura) ■ sekundární struktura intronu zajistí požadovanou (*1947) blízkost obou spojení intron-exon ■ mechanismus objeven u prekurozorů rRNA Tetrahymena thermofila, ale probíhá rovněž u dalších nižších eukaryot a u prekurzorů rRNA, tRNA a mRNA mitochondrií a chloroplastů různých druhů 64 G-OH exon 1 exon 2 prekurzor rRNA 5' p Fosfoesterová vazba se přenese ze spojení exon 1 - intron na G-OH, vazba mezi exonem 1 a intronem se rozštěpí. O Fosfoesterová vazba se přenese ze spojení intron-exon 2 na 3'-konec exonu 1, exony 1 a 2 se spojí sestřižená rRNA Samosestřih při tvorbě rRNA fragment intronu vyštěpený intron O lníron se cirkularizuje přenosem vnitřní fosfoesterová vazby. 65 . Sestřih p re-m RNA -L zajišťují spliceozomy Spliceozom ■ komplex cca 40 proteinů a RNA připomínající ribozom ■ obsahuje malé molekuly RNA, tzv. snRNA (U1, U2, U4, U5, U6) ■ některé z nich se spojují s proteiny za vzniku snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) 66 funkce snRNP při sestřihu snRNPUl aU2se vážou na 5'-sestřihové místo (GU) a A uvnitř intronu v místě budoucího větvení podílejí se na sestavení spliceozomu, přerušení cukr-fosfátové kostry v 5'- sestřihovém místě 5' [ 5' C exon 1 intron exon 2 5' A A A I II GU A II AG 1 I I 1 I I / 5'- sestřihové místo místo větvení \ 3'- sestřihové místo ] 3' Q snRNP U1 se váže na 5'- sestřihové místo a snRNP U2 se váže na místo větvení. : 3' Q Sestavuje se úplný spliceozom a štěpí transkript v 5'- sestřihovém místě. štěpené 5'- sestřihové místo 3' X Funkce snRNP při sestřihu ■ vytvoření vazby mezi koncovým G a vnitřním intronovým A ■ vzniká lasovitá struktura í Á \ U4 /ui\\— 5' i irJuj ŠX-u2 • // u5j štěpené 5'- sestřihové místo 9 5 - konec intronu se připojuje k A v místě větvení za vzniku lasovité struktury, uvolňují se U1 a U4. ■ ze spliceozomu se uvolňují U1 a U4 \u6] 5' i yfl ( / u5 J ■ štěpí se 3'-sestřihové místo, exony se spojí obvyklou 5'- 3' fosfodiesterovou vazbou \ v. I I 3' 9 Štěpí se 3'- sestřihové místo a 5'- konec exonu 2 se připojuje k 3'- konci exonu 1. Intron se uvolňuje 2 ve tvaru lasa spolu s snRNP U2, U5 a U6. exon 1 Cl i-1 u5j i exon 2 1 Ol Dl 1 1 O sestřižená mRNA Alternativní sestřih 3=F DMA Transcription Alternative SpLICirtCj pra-mRtJA / \ Translation ^ ^ A ■ různé spojování stejných exonů ■ odhad: 95 % genů podléhá alternativnímu sestřihu ■ zdroj rozmanitosti izoforem proteinů kódovaných stejnými geny (u člověka cca 20 000 genů, 150 000 proteinů) ■ funkce proteinových izoforem se mohou podstatně lišit ■ varianty sestřihu mohou být preferovány podle aktuálních podmínek, tkáňové specifity, apod. ■ účast regulačních proteinů, které se vážou na DNA (enhancery, silencery) a napomáhají sestřihu v určité variantě ■HRNA průlin 69 Sestřih proteinů ■ objeven v roce 1990 (Anraku a Stevens) ■ jiný mechanismus, stejný princip jako u sestřihu RNA ■ vyštěpení vnitřní části proteinu (inteinu) ■ fúze zbývajících částí proteinu (exteinů) ■ popsán u bakterií, archeí, rostlin, kvasinek i člověka rtreaued N-extein C-extein ^ Take horne message ■ intronové sekvence se vystepují z transkriptů RNA před transportem do cytoplazmy ■ introny prekurzorů tRNA se vystepují postupným působením sestřihové endonukleázy a ligázy ■ introny některých typů RNA podléhají autokatalytickému sestřihu ■ introny jaderných pre-mRNA se vystepují působením ribonukleoproteinových struktur zvaných spliceozomy ■ vyštěpení intronů musí být přesné na úrovni jednotlivých nukleotidů, aby bylo zajištěno správné čtení exonových kodonů při translaci ■ variabilita produktů alternativního sestřihu zvyšuje četnost proteinových variant vytvořených expresí téže genetické informace hH-p^biocofiaicalS blogSpohcom